This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the S&#228;chsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

وقد تم الحصول على جميع عينات الدم الإنسان من المتطوعين الأصحاء، وبروتوكول تخصيب الكريات البيض تطبيق يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات كلية الطب في جامعة لايبزيغ. وتمت الموافقة على التجارب مع دم الفئران من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية المسؤولة (Landesdirektion سكسونيا، Referat 24)، وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية على رعاية الحيوانات واستخدامها. 1. إعداد التجريبية ملاحظة: كما في إجراء تحلل منخفض التوتر لاستنزاف كرات الدم الحمراء من عينات الدم هو إجراء الوقت الحرج، وإعداد جميع التجهيزات الضرورية (على سبيل المثال، مخازن) لهذا الجزء من البروتوكول مقدما. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية واحدة 15 مل أنبوب الطرد المركزي للتحلل منخفض التوتر واحد أنبوب عينة 1.5 مل لاحق aminophenyl فلوريسئين (APF) تلطيخ في عينة الدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان سيتم إجراء تخصيب الكريات البيض تحت ظروف معقمة، تنفيذ هذا الوسم تحت تدفقمربع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حوالي 12 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 10 ملم) لكل عينة. اعتمادا على ما إذا كان يتم عزل الكريات البيض تحت ظروف معقمة أم لا، وإعداد برنامج تلفزيوني إما باستخدام محلول معقم جاهز من مورد أو عن طريق إذابة أقراص برنامج تلفزيوني في الماء المقطر. تحقق من قيمة الرقم الهيدروجيني، وإذا لزم الأمر، وضبط لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام كميات صغيرة من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم الحلول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل أقراص برنامج تلفزيوني (انظر الجدول من المواد) في 200 مل من الماء المقطر للحصول على حل العازلة غير معقمة كافية لحوالي 16 عينة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح العقيمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حوالي 1 مل هانكس محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع الكالسيوم 2+ لكل عينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 970 ملغ من الملح HBSS في 100 مل (الحجم النهائي) الماء المقطر المزدوج. قبل ملء تصل إلى الحجم النهائي، والتحقق من قيمة الرقم الهيدروجيني وتعديله لدرجة الحموضة 7.4. نظرا لقدرتها عازلة منخفضة، وإعداد هذا المخزن المؤقت الطازج كل يوم لد أداء ضبط الأس الهيدروجيني مع عناية خاصة باستخدام كميات صغيرة من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم الحلول. ملاحظة: محلول معقم يمكن أن تستخدم، اعتمادا على التجربة. يمكن تعقيم الحل عن طريق الترشيح العقيمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالاضافة الى اثنين من المخازن، والتسمية، وإعداد أنبوب (على سبيل المثال، 50 مل أنبوب الطرد المركزي) أو قارورة (على سبيل المثال، 250 مل قياس كوب) مع الماء المقطر المزدوج لإجراء تحلل منخفض التوتر مقدما. إعداد حوالي 10 مل من الماء لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير وعاء مع الثلج المجروش ل(القسم 3) تلطيخ APF، والتي تتم على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد aliquots من APF في وقت مبكر يسمح إعداد سريع للحلول العمل المستخدمة خلال تلطيخ (خطوة 3.2) وتجنب مرارا تجميد والذوبان من الحل APF. ملاحظة: يتم الحصول على APF عادة باعتباره 5 ملغ / مل (11.81 ملم) حل الأسهم في خلات الميثيل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد aliquots من 10-100 ميكرولتر في 0.5 مل أنابيب. لAPF تلطيخ نهائييستخدم تركيز الصبغة من 10 ميكرومتر (الخطوة 3.8). </li></ol></li></ol> 2. منخفض التوتر تحلل من الكريات الحمر ملاحظة: نفذ الخطوات تحلل ناقص التوتر (باستثناء الخطوات الطرد المركزي) تحت مقعد تدفق الصفحي لتجنب التلوث. تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة. كما تحلل منخفض التوتر هو عملية حاسمة الوقت، وضبط ماصات للمياه (2 مل)، وبرنامج تلفزيوني (5 مل) بالإضافة مقدما وفتح المياه وقوارير برنامج تلفزيوني قبل بدء العملية. تخزين الحل في برنامج تلفزيوني والماء المقطر في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من كل نقل عينة الدم 100 ميكرولتر إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي المناسب. ملاحظة: في تجاربنا عادة ما تحتوي على عينات دم 10 U / مل من الهيبارين من أجل تجنب تجلط الدم. بعد نظرا لمصادر مختلفة من مادة العينة طبيعة وتركيز مكافحة تجلط الدم قد تختلف. وينبغي اختبار تأثيرها على تلطيخ APF التي كتبها comparجي النتائج إلى النتائج التي تم الحصول عليها من عينات الدم تستكمل مع أنواع أو تركيزات مكافحة تجلط الدم الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الماء المقطر وتخلط العينات باستخدام خلاط دوامة تعيين إلى مستوى متوسط. احتضان هذه العينات لمدة 60 ثانية، ثم يضاف 5 مل PBS لكل عينة وتخلط باستخدام خلاط دوامة. ملاحظة: ما يصل إلى حوالي 5 عينات يمكن أن تكون مستعدة بشكل متواز. الحفاظ على نموذج النظام نفسه لإضافة الماء وبرنامج تلفزيوني لتحقيق حضانة مرات مقارنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تجديد الظروف متساوي التوتر عن طريق برنامج تلفزيوني إضافة (الخطوة 2.2) بيليه خلايا سليمة المتبقية في جميع العينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 450 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بصب قبل أن تتحول إلى سلة المهملات الجدول. إزالة كسائل أكبر قدر ممكن من أنبوب للقلب الطرد المركزي والاستفادة من فتح على منشفة ورقية. تأكد من أن بيليه خلية جافة قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء تحلل منخفض التوتر كما هو موضح من قبل (الخطوة 2.2). NOTE: من حيث المبدأ هذا الإجراء تحلل منخفض التوتر (الخطوات 2،3-2،5) قد يتكرر أكثر من مرة، وهذا يتوقف على نقاء جزء الكريات البيض المختلطة التي يمكن الحصول عليها. بعد سنتين تحلل الخطوات حصة المتبقية كريات الدم الحمراء في جزء الخلية المختلطة التي تم الحصول عليها عن 25٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه خلايا سليمة المتبقية بواسطة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 450 ز س. إزالة طاف (راجع الخطوة 2.4). إضافة 500 ميكرولتر HBSS لبيليه وحل برفق حتى يتم الحصول على حل متجانسة. نقل كل عينة إلى أنبوب عينة 1.5 مل المسمى وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على تجربة تحليل مباشرة العينات التي تم الحصول عليها (على سبيل المثال، عن طريق التدفق الخلوي) 25، وصمة عار مع الأجسام المضادة مضان المسمى (لتحديد أنواع وحيدة الخلية) 32، واحتضان مع المثيرات الخلوية (للتجارب تنشيط الخلايا) 33 أو تخزينها على الجليد واستخدام في وقت لاحق. اعتمادا على الهدف من هذه الدراسة، نفذ فورا تجارب لاحقة علىجزء الكريات البيض مختلطة منذ المحببة لديهم قصيرة نسبيا نصف عمر حوالي 20 ساعة. ملاحظة: هذا ينطبق أيضا على تلطيخ النشاط البيروكسيديز هو موضح أدناه. </li></ol> 3. Halogenating البيروكسيد آخر تلطيخ ملاحظة: HOCl- وHOBr الإنتاج من قبل بيروكسيديزات الهيم المشتقة من الدم الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات وكميا باستخدام APF، الذي يتأكسد إلى فلوريسئين من الأحماض hypohalous اسمه. لذلك إذا تم تنفيذ وسم الخلية مع الأجسام المضادة المسماة مضان في تركيبة مع APF تلطيخ، وتجنب fluorophores التي تتداخل مع إشارة انبعاث فلوريسئين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء APF تلطيخ في 4 درجات مئوية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل العاملة من APF ذوبان الجليد قسامة المناسبة للصباغة (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر، 11.81 ملم) وتمييع مع HBSS بالضبط 1 ملم (على سبيل المثال، إضافة 108.1 العازلة ميكرولتر إلى ميكرولتر 10). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة (500 ميكرولتر حل الخلية) إعداد 5 μلتر من محلول العمل APF وصفها. وفقا لذلك، استخدم واحد 10 قسامة ميكرولتر من APF (11.81 ملم)، والتي ينتج 118.1 ميكرولتر حل APF العمل (1 ملم) لإعداد حوالي 20 عينة. بسبب فقدان أثناء pipetting لإعداد حوالي 10٪ أكثر APF حل العملية من حساب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل التحقق من خصوصية البيروكسيديز من تلطيخ APF، وإعداد العينات التحكم مع هيدرازيد الهيم البيروكسيديز المانع 4-أمينو حمض (4 أباه) 35. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 1 M من 4 أباه (151.17 جم / مول) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) عن طريق تمييع 75.6 ملغ 4 أباه في 500 ميكرولتر المذيبات. وعلاوة على ذلك تمييع 4 أباه 10/01 في HBSS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل H 2 O 2 عمل تسمية اثنين من 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي مع &quot;70 مم H 2 O 2&quot; و &quot;7 مم H 2 O 2&quot;، على التوالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب المسمى &quot;70 مم H 2 O 2&quot;، حديثا تمييع 10 ميكرولترالحل الأسهم 30٪ (8.8 ملم) من H 2 O 2 باستخدام 990 ميكرولتر الماء المقطر للحصول على تركيز من حوالي 88 ملم. تخزين على الجليد واستخدامها داخل 4 ساعات. ملاحظة: H 2 O 2 يتم تسليم عادة ما 30٪ حل الأوراق المالية من قبل الموردين. عند تخزينها في 4 درجات مئوية، وأنها مستقرة لمدة 3 سنوات. أداء التخفيفات من H 2 O 2 في الماء المقطر لتجنب التحلل. ويمكن أيضا أن يكون مستعدا H 2 O 2 التخفيفات في 0.1 حل M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد H المحدد 2 O 2 تركيز إعداد تخفيف مزيد من 1 إلى 10 من H الأول 2 O 2 حل سهم (حوالي 88 ملم) وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى 900 ميكرولتر من الماء المقطر في أنبوب 1.5 مل المسمى &quot;7 مم H 2 O 2&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الطيف في المدى القريب للأشعة فوق البنفسجية (على سبيل المثال، 200-300 نانومتر) باستخدام photospectrometer أشعة فوق البنفسجية فيس واستخدام الامتصاصية في 240 نانومتر (49؛ 240 = 34 م -1 سم -1) لتحديد H الفعلي تركيز 2 O 2 في H الثاني 2 O 2 حل الأوراق المالية 34. ضمان كفيت إشارة تحتوي على الماء فقط المقطر. لcuvettes استخدام الكوارتز قياس كما هو مسجل طائفة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هذه النتيجة، وحساب تركيزات بالضبط كل الحلول الأسهم H 2 O 2. ضبط تركيز المحلول الأول في &quot;70 مم H 2 O 2&quot; عينة أنبوب بالضبط 70 ملم عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء المقطر. تخزين حل العمل الحصول على الجليد واستخدام في غضون ساعة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من محلول 4 أباه العمل (100 ملم) للعينات مناسبة لتركيز النهائي من 1 ملم. احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة قبل APF بالإضافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر حل APF العمل (1 ملم) على كل500 عينة ميكرولتر للحصول على تركيز الصبغة النهائي من 10 ميكرومتر. خلط العينات بلطف (على سبيل المثال، باستخدام خلاط دوامة على الإعداد المتوسط)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر H حل العاملة 2 O 2 (70 ملم) لكل عينة ميكرولتر 500 لتركيز النهائي من 700 ميكرومتر. المزيج بلطف العينات واحتضان لهم لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إجراء قياسات المراقبة المناسبة في نفس الوقت. وأظهرت قياسات تحكم أن 700 ميكرومتر H 2 O 2 ليست سامة للخلايا: ملاحظة. كما لم يلحظ أي الاستجابات الخلوية الهامة. ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ تلطيخ APF بحذف إضافة H 2 O 2، اعتمادا على مسألة علمية. في غياب بيروكسيد الهيدروجين يتحدد فقط MPO الكلورة القاعدية والنشاط EPO في حين أن إضافة H 2 O 2 يسمح للكشف الأقصى HOCL وHOBr إنتاج الخلايا. تانه يعني الأخير إشارة الفلورسنت أعلى بكثير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالتكوير الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 ز س. تماما إزالة طاف دون تدمير بيليه وإضافة 250 ميكرولتر HBSS إلى resuspend الخلايا. ملاحظة: هذه العينات هي الآن جاهزة للتحليل عن طريق التدفق الخلوي 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين العينات في الظلام حتى تحليل لتجنب التبييض. بعد الإثارة في 480-490 نانومتر كشف عن انبعاث فلوريسئين في حوالي 525 نانومتر 37. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

كما العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم البشري عزل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي يركز كثير من الأحيان إلا على هذه الخلايا ويتضمن الفصل العدلات من الكريات البيض الأخرى عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي 38. ولكن كما العدلات أقل وفرة في عينات دم الفئران 39 لأساليب أكثر تعقيدا الأخيرة لا بد من استخدامها 40. وعلاوة على ذلك يؤدي كلا الطريقتين أيضا إلى إزالة حيدات-البيروكسيديز إيجابي من العينات، ونظرا لحاجة كميات الدم الكبيرة (على سبيل المثال، 400 ميكرولتر 41)، لا تنطبق على العينات المجهرية التي تم الحصول عليها خلال أخذ عينات الدم المتكررة من حيوانات المختبر صغيرة 38،40. تنقية العدلات الفئران من الإفرازات البريتوني أيضا في حاجة إلى التضحية من الحيوانات وعلاوة على ذلك، لا تسفر المحببة المشتقة من الدم 38،40. طرق للحصول على أجزاء محببة عالي النقاء من BL الفئران وضعت مؤخراالعود (على سبيل المثال، تطبيق الأجسام المضادة) وغالبا ما تكون مكلفة ومعقدة وتستغرق وقتا طويلا 40،42،43 ومرة أخرى تركز فقط على تنقية واحدة نوع الكريات البيض-البيروكسيديز إيجابي. وهكذا فإن الطريقة المعروضة هنا لديه اثنين من المزايا مقارنة مع الطرق الأخرى المطبقة لتنقية الكريات البيض-البيروكسيديز إيجابي. لأنه يقوم على عينات دم صغيرة الخلايا التي تم الحصول عليها تمثل الوضع في الدورة الدموية. نظرا لحجم العينة الأولي صغير اللازمة لبروتوكول الطريقة تنطبق على كل من الإنسان والدم غير البشرية، على الرغم من الاختلافات بين الأنواع في وفرة من العدلات. في الواقع، كنا حتى تتمكن من تطبيق الطريقة الموصوفة المبدئي كميات الدم صغيرة مثل 50 ميكرولتر (لا تظهر البيانات). العينة الدموية الصغيرة اللازمة لالأسلوب أيضا يجعلها مناسبة للانسحاب الدم المتكررة من حيوانات المختبر صغيرة أو للتطبيقات الطبية الخاصة (على سبيل المثال، تشخيص الأطفال حديثي الولادة). كما رويستند أنه تخصيب الكريات البيض على استنزاف كرات الدم الحمراء يتم تضمين كافة الخلايا البيروكسيديز الإيجابي (العدلات، الحمضات، وحيدات) في جزء الكريات البيض المختلطة التي تم الحصول عليها ويمكن تحليلها بشكل منفصل باستخدام التدفق الخلوي. فإن هذه الطريقة سريعة وموثوق بها، ومتطلبات منخفضة المتعلقة بالمواد الكيميائية والأجهزة، مما يجعل من بروتوكول مناسبة لبيئات علمية متعددة. كما يتم بسهولة تفعيل العدلات خطوة حاسمة واحدة خلال طريقة وصفها هو التعديل الدقيق لقيمة الرقم الهيدروجيني للمحاليل تستخدم (PBS وHBSS، نرى خطوات 1.2 و 1.3 من قسم البروتوكول). وعلاوة على ذلك فترة حضانة من خلايا الدم بالماء المقطر لا ينبغي أن تكون أطول من 60 ثانية قبل استعادة الظروف normosmotic (راجع الخطوة 2.2 من قسم البروتوكول. و(تقريبا) إزالة تماما من المذيب من الخلية بيليه (الخطوة 2.4) قبل إضافة من الماء للتحلل منخفض التوتر الثاني هو خطوة حاسمة أخرى كما برتقاليسوف بقايا إيه يقلل من كفاءة عملية تحلل منخفض التوتر. يشير خطوة حاسمة أخرى لتطبيق H 2 O 2 خلال تلطيخ APF. على الرغم من أن كمية تطبيقها لا ينبغي أن يكون السامة للخلايا، يجب فحص حيوية الخلية. خلال دراستنا ونحن عادة تطبيق الصبغة 5،5 &#39;، 6،6&#39;-tetrachloro-1،1&#39;، 3،3&#39;-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine يوديد (JC-1) للكشف عن أحداث أفكارك المبكرة. وعلاوة على ذلك، هناك زوجين من القيود في طريقة تخصيب الكريات البيض مبسط وصفها. في حين أن التقنية يمكن تطبيقها على عينات الدم من عدة أنواع (قد حوكموا رجل، الجرذان والفئران)، وكمية الكريات البيض التي تم الحصول عليها بعد تحلل كريات الدم الحمراء يعتمد على وفرة الأولية في الدم. هذا الأخير يختلف بالتأكيد بين الأنواع 39 و يعتمد أيضا على حالة التهابات الفرد بحثها. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن أن يتم إجراء تحلل مع ما يصل الى واحدمئات من العينات في موازاة الخطوات الطرد المركزي المتوسطة تشكل الحد كما، اعتمادا على أجهزة الطرد المركزي المستخدمة، يمكن معالجتها فقط حتى 30 عينة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، في حين APF يكتشف بسهولة HOCL وHOBr بحضور SCN -، ويؤثر على النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات أيضا إلى الأخير الزائفة هاليد. يتكون وهو غير قادر على أكسدة APF - hypothiocyanite بذلك (OSCN). الحد آخر يأتي من خصائص الصبغة APF المستخدمة لتحديد HOCl- وHOBr الإنتاج من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات. كما يتأكسد الصبغة لفلوريسئين، وتلطيخ لا يمكن الجمع بين الأضداد الفلورسنت مع طيف الانبعاث في نفس النطاق. بالطبع لم يتم فحص أي التداخل بين مضان المستمدة APF وإشارة من إشارات الفلورسنت إضافية ويعوض عليها في قياس التدفق الخلوي. خلاف ذلك، إذا كان الكشف عن النشاط halogenating البيروكسيديز ليست في نطاقالدراسة، بعد تطبيق طريقة استنزاف كرات الدم الحمراء ويمكن استخدام الأساليب التحليلية الأخرى بدلا من APF. كما يؤدي هذا الإجراء تحلل منخفض التوتر وصفها إلا إلى استنزاف جزء من كريات الدم الحمراء وكما كل الكريات البيض لا تزال موجودة في جزء الخلية المختلطة التي تم الحصول عليها، وأساليب فقط والتي تسمح ينبغي تطبيق تحليل خلية واحدة. والأساليب التي تشمل تحلل الخلايا (على سبيل المثال، تحليل مؤامرة غربية) لا تسفر عن نتائج يمكن الاعتماد عليها. قد يكون حجم العينة الأولي صغير عقبة أخرى لمثل هذه الأساليب التحليلية. فيما يتعلق بالتحقيق في الخطة الرئيسية للعمليات (وايبو) النشاط في الكريات البيض في كثير من الأحيان فقط لإنتاج أكسدة العام من قبل خلايا موجهة بدلا من تقييم تحديدا النشاط البيروكسيديز الهيم 44،45. في كثير من الأحيان وعلاوة على ذلك يتم إجراء أية محاولات للتمييز بين halogenating والنشاط البيروكسيديز من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات 46،47. الأساليب، التي تتناول على وجه التحديد النشاط MPO الكلور عن طريق تشوantifying المنتجات المشتقة HOCL مثل chlorotyrosine لا كشف الإفراط في أكسدة و / أو منتجات عملية الأيض، وبالتالي غالبا ما تؤدي إلى التقليل من الحقيقي HOCL الإنتاج 48. وعلاوة على ذلك هذه الطريقة فضلا عن الكشف عن المستمدة HOCL-2-chloroethidium أيضا مضيعة للوقت، يحتاج معدات التحليل مكلفة وتشمل تحلل الخلايا 48-50 وهناك العديد من التقارير حول الأصباغ جديدة لتحديد معين من النشاط الخطة الرئيسية للعمليات الكلورة داخل الخلايا الحيوية 44،51،52. بعد حتى الآن يتوفر تجاريا، وبالتالي تستخدم بشكل روتيني في مجال البحوث 25،33 فقط APF وhydroxyphenyl فلوريسئين في مجمع ذات الصلة (HPF). في الواقع، عن طريق استخدام APF نحن يمكن أن تظهر أن النشاط MPO الكلور لا يمكن أن يكون كميا فقط باستخدام انزيم معزولة 53 ولكن أيضا من خلال تطبيق الصبغة على الخلايا الحية 26،33. وهكذا من خلال الجمع بين تخصيب الكريات البيض السريع من الدم عينات الصغيرة المذكورة أعلاه معن APF تلطيخ ضعنا بروتوكولا، الذي هو مناسبة لمعالجة تحديدا في وقت واحد في النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات في كل البيروكسيديز الكريات البيض إيجابية، أي العدلات، وحيدات الحمضات 32. وعلاوة على ذلك الأسلوب لا يتطلب تحلل الخلية، والذي يسمح لمجموعة واسعة من الأساليب التحليلية، بما في ذلك التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلورسنت مبائر. وعلاوة على ذلك هذه تلوين البيروكسيداز النشاط يمكن جنبا إلى جنب مع تطبيق علامات سطح الخلية، مما يسمح للتحليل محدد من الكريات البيض كسور الفرعية، اعتمادا على المهمة العلمية. ومع ذلك لابد من النظر إلى أن الأجسام المضادة المسماة مضان التطبيقية لا تتداخل مع إشارة مضان القائم على فلوريسئين المستخدمة لقياس HOCl- والمستمدة HOBr للأكسدة APF. وباختصار يمكن أن توفر هذه الطريقة وسيلة جديدة للحصول على المزيد من الأفكار في دور الفسيولوجية للنشاط halogenating البيروكسيديز من إعادة المناعيةبلاد الشام بيروكسيديزات المشتقة من الدم الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات، والتي لا تزال غير مفهومة جيدا 8،20،23. وعلاوة على ذلك في دراسة أجريت على الحيوانات في التهاب المفاصل الروماتويدي يمكن أن نلاحظ في الآونة الأخيرة أن هذا البروتوكول قد يؤدي إلى تقييم إنتاج HOCL المستمدة MPO-كعلامة السريرية الجديدة في الأمراض الالتهابية المزمنة (بيانات غير منشورة).

الكريات البيض النوى (PMNs، وتسمى أيضا المحببة) وحيدات تمثل المكونات الخلوية الهامة من نظام المناعة الفطري في 1،2 الدم. لأنها تسهم في الدفاع الأول ضد الجراثيم وكذلك لتفعيل نظام المناعة المكتسبة والشروع في الاستجابة الالتهابية الجهازية 2-4. بعد خصوصا العدلات، النوع الأكثر وفرة من المحببة، وحيدات أيضا تسهم إلى حد كبير في التنظيم وإنهاء أحداث الالتهابية الحادة 5. لذلك قد تكون هذه الخلايا أيضا أن تلعب دورا هاما في الأمراض الالتهابية المزمنة مثل التهاب المفاصل الروماتويدي 6،7. في الواقع، والربو، ومرض مجرى الهواء التهابي مزمن، وتتميز الخلايا ضعاف الحمضات، والنوع الثاني الأكثر محببة في الدم 8. إلا أن موت الخلايا المبرمج للالمحببة وإزالة سريعة من قبل الضامة هما خطوتان أساسيتان أثناء إنهاء الخلويالتهاب 9-11. في الخلايا المناعية المسماة اثنين من الانزيمات وترتبط ارتباطا وثيقا، وهي الميلوبيروكسيديز (الخطة الرئيسية للعمليات، العدلات وحيدات) والحمضية البيروكسيديز (EPO، الحمضات) ويمكن الاطلاع 12،13. وهذه بيروكسيديزات الهيم المرتبطة تقليديا إلى الاستجابة المناعية الخلطية لأنها يومين إلكترونيا أكسدة (الزائفة) هاليدات للفراش لا تسبب المقابلة (الزائفة) الأحماض halous التي هي معروفة لخصائص جراثيم من 14-16. في ظل الظروف الفسيولوجية MPO أساسا أشكال حمض تحت الكلور (HOCL) وhypothiocyanite (- OSCN)، في حين تتشكل حمض الأخير وhypobromous (HOBr) من خلال المكتب الأوروبي للبراءات 17-19. وتشير النتائج الجديدة أن هذا (الزائفة) نشاط انزيم halogenating قد تسهم أيضا في تنظيم الاستجابات الالتهابية وإنهاء التفاعلات المناعية 20،21. في الواقع، عرضت على إنتاج HOCL من الخطة الرئيسية للعمليات والمنتجات المشتقة منها لقمع تي خلية القاعدة الاستجابات المناعية التكيفية 22-24. من أجل كسب المزيد من الضوء على دور مناعي من الكريات البيض من نظام المناعة الفطري في الأمراض الالتهابية المزمنة وتحديد مساهمة الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات لهذه الوظيفة الفسيولوجية قمنا بتطوير طريقة لإثراء بسرعة الكريات البيض من عينات دم صغيرة لأغراض محددة لاحق تقرير النشاط halogenating البيروكسيديز في هذه الخلايا. لاستنزاف كرات الدم الحمراء اخترنا طريقة موحدة بما في ذلك الخطوات تحلل ناقص التوتر اللاحقة مع اثنين من الماء المقطر، الأمر الذي يؤدي إلى تخصيب الكريات البيض سريع في تكاليف المواد منخفضة. لقرار لاحق من الخطة الرئيسية للعمليات halogenating والنشاط EPO تم استخدام HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl فلوريسئين (APF) 25-27. وعلى النقيض من تطبيق أساليب تلطيخ البيروكسيديز غير محددة 28،29، وهذا النهج يسمح للكشف انتقائي من النشاط halogenating البيروكسيديز، والتي غالبا ما تضعف في infl شديدammation 30،31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">materials/equipment</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">15 ml centrifugation tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Corning</td>
			<td style="width:120px;">734-0451</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">1.5 ml sample tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">211-2130DE</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:213px;">Pipettes for volumes up to 5 ml</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">e.g. 3120000070</td>
			<td style="width:203px;">We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 &#181;l, 10-100&#181;l, 100-1000 &#181;l an 500-5000&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">laminar flow bench</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Electron Corperation</td>
			<td style="width:120px;">HeraSafe</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:203px;">Bender &#38; Hobein AG</td>
			<td style="width:120px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td style="width:120px;">Laborfuge 400R</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 450x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Small centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">5415D</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 400x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Incubator</td>
			<td style="width:203px;">Heraeus</td>
			<td style="width:120px;">cytoperm 2</td>
			<td style="width:203px;">Settings: 37 &#176;C, 95% humidity, 5 % CO2 content</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Varian</td>
			<td style="width:120px;">Cary 50 bio</td>
			<td style="width:203px;">A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Flow cytometer</td>
			<td style="width:203px;">Becton, Dickinson</td>
			<td style="width:120px;">BD Facs Calibur</td>
			<td style="width:203px;">Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Chemicals</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">amresco</td>
			<td style="width:120px;">K812</td>
			<td style="width:203px;">sterile solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;"></td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P4417</td>
			<td style="width:203px;">tablets for solving in 200 ml millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1387</td>
			<td style="width:203px;">970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:203px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">1.09057.1000</td>
			<td style="width:203px;">1M solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:203px;">Riedel-deHa&#235;n</td>
			<td style="width:120px;">30620</td>
			<td style="width:203px;">Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">Aminophenyl fluorescein</td>
			<td style="width:203px;">Cayman</td>
			<td style="width:120px;">10157</td>
			<td style="width:203px;">5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 &#181;l should be prepared and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:213px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1009</td>
			<td style="width:203px;">This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A41909</td>
			<td style="width:203px;">A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:120px;">23500.26</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and specific assessment of the halogenating peroxidase activity in leukocyte-enriched blood samples

في هذه الورقة يوصف بروتوكول لإثراء سريع وموحد من الكريات البيض من عينات الدم كلها صغيرة. ويستند هذا الإجراء على تحلل منخفض التوتر من كريات الدم الحمراء ويمكن تطبيقها على عينات الإنسان، وكذلك للدم من مصدر غير إنساني. حجم العينة الأولي صغيرة من حوالي 50 إلى 100 ميكرولتر يجعل هذه الطريقة تنطبق على اخذ عينات من الدم المتكررة من حيوانات المختبر الصغيرة. وعلاوة على ذلك، ويتحقق تخصيب الكريات البيض في غضون دقائق ومع الجهود المواد منخفضة المتعلقة بالمواد الكيميائية والأجهزة، مما يجعل هذه الطريقة قابلة للتطبيق في بيئات المختبرات متعددة. يتم الجمع بين تنقية موحدة من الكريات البيض مع طريقة انتقائية للغاية تلطيخ لتقييم النشاط البيروكسيديز halogenating من مستخلصات الهيم، الميلوبيروكسيديز (MPO) والبيروكسيديز الحمضات (EPO)، أي تشكيل من تحت الكلور وحمض hypobromous (HOCL وHOBr). في حين أن الخطة الرئيسية للعمليات أعرب بقوة في neut غيرrophils، والأكثر وفرة المناعي نوع من الخلايا في الدم البشري وكذلك في وحيدات، وأعرب عن انزيم ذات الصلة EPO حصرا في الحمضات. وتعالج النشاط halogenating هذه الانزيمات باستخدام فلوريسئين تقريبا HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl (APF) والبيروكسيديز الأساسي بيروكسيد الهيدروجين الركيزة. على تحليل التدفق الخلوي لاحق كل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي (العدلات، وحيدات، الحمضات) يمكن تمييزها، ويمكن كميا نشاطهم البيروكسيديز halogenating. منذ APF تلطيخ يمكن الجمع بين تطبيق علامات سطح الخلية، وهذا البروتوكول يمكن أن تمتد إلى معالجة على وجه التحديد الكريات البيض كسور الفرعية. هذه الطريقة تنطبق على كشف HOCL وHOBr إنتاج في كل من الإنسان وفي الكريات البيض القوارض. ونظرا للدور المناعية التي نوقشت على نطاق واسع وبتنوع هذه المنتجات الأنزيمية في الأمراض الالتهابية المزمنة، قد يسهم هذا البروتوكول إلى فهم أفضل للأهمية المناعية من مستخلصات الهيم المشتقة من خلايا الدم البيضاء.

<html> كما ذكرت سابقا الطريقة المذكورة أعلاه تبين أن تنطبق على كل من الإنسان والمواد غير البشرية 32. وعلاوة على ذلك كما هو مبين بالنسبة للفئران مع أعراض الربو قد يكون تلطيخ APF أداة مناسبة للكشف عن الاختلافات في وضع النظامية الموالية للالتهابات. لذلك في دراسة لاحقة استخدمنا هذا البروتوكول لتقييم مرارا النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات (وايبو) في إناث فئران الظلام الأغوطي مع التهاب المفاصل الناجم عن البريستينات (PIA). ويرد مثال ممثل تخصيب الكريات البيض وتلطيخ المنجزة خلال هذه التجربة في الشكل 1. تم الحصول على معلومات عن 200 ميكرولتر من الدم الكامل من الضفيرة الوريدية خلف المقلة للحيوان تحت التخدير وheparinized. أجريت استنزاف كرات الدم الحمراء وتلطيخ APF لاحق باستخدام 100 ميكرولتر حجم العينة. بعد ذلك تم تحليل عينة من التدفق الخلوي. her.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; كما هو مبين من خلال التآمر حجم الخلية مقابل خلية تحبب (الشكل 1A)، استنزاف قوي من الكريات الحمراء من تحقق العينة. وعلاوة على ذلك كانت أنواع الكريات البيض مختلفة يمكن تمييزها بوضوح، التي تم تحديدها من خلال تطبيق علامات سطح الخلية مضان المسمى (لا يظهر). لفترة وجيزة في كرات الدم الحمراء (-CD235a إيجابي) / خلية منطقة الحطام تمثل سوى 22٪ من أحداث في حين تم تحديد حوالي 48٪ من أحداث كما العدلات-CD16 الإيجابية. وعلاوة على ذلك 3٪ من الأحداث تم تحديد كل منها الحمضات-CCR3 إيجابي وحيدات-CD14 إيجابي وحوالي 19٪ من الأحداث تمثل CD5 /-CD19 إيجابي B والخلايا اللمفية تي، على التوالي. توزيع كثافة مضان المستمدة APF (الشكل 1B) يسمح بوضوح للتمييز من كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية البيروكسيديز السلبي في حين تصدرت وحيدات الحمضات لأكسدة APF المعتدلة وكانت العدلات بقوة الإيجابي البيروكسيديز تحت الفصلاوسين الظروف التجريبية. هذه النتائج تتماشى مع وفرة عالية من الخطة الرئيسية للعمليات في الخلايا الأخيرة بالمقارنة مع تركيز الانزيم في حيدات 20. استجابة ضعيفة نسبيا من الحمضات يمكن تفسير حقيقة، أنه لا يوجد بروميد أضيف، والتي قد دفعت تشكيل المستمدة EPO لHOBr. الدراسات الأولية على الحمضات معزولة بشكل مفاجئ لم تظهر تأثير كبير بروميد أضاف خارجيا على أكسدة APF من هذه الخلايا. ومع ذلك، أكسدة APF التي لوحظ الحمضات التي يمكن تفسيرها من خلال إدخال كميات صغيرة من الأخ - عن طريق المحاليل المستخدمة (PBS وHBSS). بدلا من ذلك EPO قد تنتج أيضا كميات صغيرة من HOCL، على الأقل في ظل الظروف الحمضية (مثل في جسيم حال بلعمي). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54484/54484fig1.jpg" /> الشكل 1: تخصيب خلايا الدم البيضاء وAPF-ينحدرحصلت د مضان في الدم الصغيرة عينة من الفئران مبلغ قدره حوالي 200 ميكرولتر من الدم الكامل من الضفيرة الوريدية خلف المقلة للإناث الفئران الظلام الأغوطي. بعد تطبيق الإجراء انحلال الدم وصفها إلى 100 ميكرولتر الدم ولاحق من APF تلطيخ جزء الخلية المختلطة تم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. كما هو مبين من قبل FSC- / SSC- قطعة أرض (A) تم استنفاد الكريات الحمراء بقوة من العينة وأنواع الكريات البيض مختلفة يمكن بسهولة المتميزة. أظهر توزيع كثافة مضان المستمدة APF (ب) بوضوح الهيم البيروكسيديز سلبية خلايا (كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية) وكذلك الكريات البيض مع المعتدلة (الحمضات والوحيدات) أو قوية (العدلات) النشاط halogenating البيروكسيديز. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54484/54484fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples at JoVE.com

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Views.  University of Leipzig. This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Video: Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

تحديد نشاط أكلة العينات السريرية جسم

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome. Aging is associated with an increased susceptibility to viral and bacterial infections and decreased responsiveness to vaccines with a well-documented decline in humoral as well as cell-mediated immune responses1,2. We have recently assessed the effects of aging on Toll-like receptors (TLRs), key components of the innate immune system that detect microbial infection and trigger antimicrobial host defense responses3. In a large cohort of healthy human donors, we showed that peripheral blood monocytes from the elderly have decreased expression and function of certain TLRs4 and similar reduced TLR levels and signaling responses in dendritic cells (DCs), antigen-presenting cells that are pivotal in the linkage between innate and adaptive immunity5. We have shown dysregulation of TLR3 in macrophages and lower production of IFN by DCs from elderly donors in response to infection with West Nile virus6,7. 
Paramount to our understanding of immunosenescence and to therapeutic intervention is a detailed understanding of specific cell types responding and the mechanism(s) of signal transduction. Traditional studies of immune responses through imaging of primary cells and surveying cell markers by FACS or immunoblot have advanced our understanding significantly, however, these studies are generally limited technically by the small sample volume available from patients and the inability to conduct complex laboratory techniques on multiple human samples. ImageStream combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging and thus facilitates investigation in multiple cell populations contemporaneously for an efficient capture of patient susceptibility. Here we demonstrate the use of ImageStream in DCs to assess TLR7/8 activation-mediated increases in phosphorylation and nuclear translocation of a key transcription factor, NF-&kappa;B, which initiates transcription of numerous genes that are critical for immune responses8. Using this technology, we have also recently demonstrated a previously unrecognized alteration of TLR5 signaling and the NF-&kappa;B pathway in monocytes from older donors that may contribute to altered immune responsiveness in aging9.

We describe use of ImageStream technology (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), which combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging, to quantify cellular mechanisms of primary immune cells from well-defined patient cohorts. Our studies provide a blueprint for translational investigations to quantify lineage specific cellular responses in small samples from subject cohorts.

الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

الطريقة النمام المغناطيسي للكشف عن<em&gt; الخيطيات</em&gt; يرقات في عينات العضلات

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...