Biz bu araştırmayı finanse etmek için Bilim, Teknoloji ve Araştırma (A * STAR), Singapur Ajansı teşekkür ederiz.

Hayvanların tedavisi hayvan departmanı tarafından ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11) IACUC ve NACLAR kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi. Not: Neurosphere kültürleri / 6 fareleri, daha önce 5 açıklandığı embriyonik (E14) C57BL ön beyin hazırlandı. Kültür Klon Örnek Neurospheres 1. (Gün 1) <ol><li> EGF (nihai konsantrasyon: 20 ng / ml), bFGF (nihai konsantrasyon: 10 ng /: B27 eki ile Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Besin F-12 (DMEM / F12) orta birleştirerek (1x nihai konsantrasyon) MGK büyüme ortamı hazırlamak ml) ve penisilin / streptomisin (nihai konsantrasyon: 1 x). </li><li> 1 ml MGK büyüme ortamı ve oda sıcaklığında, 7 dakika için 1 ml 0.05 N sodyum hidroksit içinde E14.5 fare Neurospheres ayrıştırmaları. Pipet hücreleri yukarı ve aşağı bazen süspansiyon hücreleri tutmak için. nötr 0.05 N hidroklorik asit, 1 ml ekleyinAlkali ize. Not: Neurosphere hücreleri 10 cm&#39;lik kültür kabı başına 20.000 hücre / ml&#39;de tohumlanmıştır ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 5 gün boyunca kültürlenmektedir. beklenen verim sonra 10 cm çanak başına yaklaşık 10 milyon hücredir. Bu hücreler daha sonra ayrılmış ve adımlar sırasıyla 1.2 ve 1.3, tarif edildiği gibi klonal yoğunluğunda tohumlanır. <ol><li> Tripan Mavisi boyama ve hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> 96 oyuklu bir çanak / ml veya daha düşük 100 uL MGK büyüme ortamında 50 hücre yoğunluğunda Tohum tek E14.5 fare neurosphere hücreleri. Klonal Neurospheres üretmek için B 37 ° C&#39;de 1 için,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. NOT: Hücreler birbirine temas etmeyecek şekilde Klonalite bu yoğunlukta Neurosphere oluşumu sırasında sağlanmaktadır. </li></ol> Klimalı ortamda için Neurospheres 2. Kültür (Gün 3) <ol><li> Adım 1.2&#39;de tarif edildiği gibi E14.5 fare Neurospheres ayrıştırmaları. </li><li> E&#39;den Tohum tek hücre10 cm&#39;lik bir kültür kabı içinde 10 ml MGK büyüme ortamında 20,000 hücre / ml yoğunluğunda 14.5 fare Neurospheres. Toplu kültürlenmiş Neurospheres oluşturmak için 5 gün süreyle 37 ° C,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li></ol> Orta Klima neurosphere 3. Hazırlama (Gün 8) <ol><li> 700 uL karıştırılarak kaplama çözeltisi hazırlayın% 0.01 Poli-L-lisin (PLL), 70 1 mg ul / ml laminin ve Fosfat Tamponlu Salin 6.230 uL (PBS). </li><li> Ceket, 37 ° C &#39;de 2 saat süre ile PLL / laminin çözeltisi 7 mL, 10 cm&#39;lik kültür çanağı. </li><li> 10 ml serolojik pipet kullanarak 15 ml konik santrifüj tüpüne tüm dökme kültürlenmiş Neurospheres aktarın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 171 x g&#39;de santrifüj Neurospheres tamamen supernatant çıkarın. </li><li> ve fetal sığır serumu (FBS) (nihai konsantrasyon:% 0.5) Ad (1x nihai konsantrasyon) B27 DMEM / F12 ortamı birleştirerek MGK farklılaşma ortamı hazırlayınneurospheres MGK farklılaşma orta d 10 ml. yukarı pipet ve bir kaç kez aşağı neurospheres tekrar süspansiyon. </li><li> Aspire PLL / 10 cm kültür çanak laminin ve 10 ml PBS ile bir kez yıkayın. PLL / Laminin kaplı 10 cm kültür çanak tüm neurospheres aktarın. 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe, neurospheres% 5 CO2 çanak uyması. </li></ol> Örnek neurospheres NFU 4. Belirlenmesi (Gün 8) <ol><li> (; Bölüm 1 gün 1 numaralı seribaşı) iyi bir mikroskop altında her oluşturulan neurospheres sayısını. NOT: NFU verir kaplı 100 hücre başına oluşan neurospheres sayısını belirler. </li></ol> 50-de Chambered lamel örnek neurospheres 5. Transferi (Gün 8) <ol><li> Ceket, 37 ° C &#39;de 2 saat süre ile PLL / laminin kaplama solüsyonu 10 uL 50-kuyucuklu odacıklı lamel her bir. NOT: tarif edildiği gibi kaplama çözeltisi hazırlayın3.1 adım. </li><li> PBS her biri 30 mL içeren 3 x 50 mL konik santrifüj tüpü hazırlayın. Steril forseps kullanarak, kaplamalı 50-iyi odacıklı lamel çıkarın. Kaplama çözüm yıkayın, ikinci ve daha sonra PBS üçüncü tüp ardından PBS ilk tüp içine odacıklı lamel batırın. </li><li> odacıklı lamel kuyulardan kalan sıvıyı aspire. </li><li> Yavaşça 96 oyuklu çanak her bir yanı, tüm orta ve Neurospheres pipet ve tek bir 10 cm&#39;lik kültür tabağına aktarın. </li><li> Mikroskop altında, 10 uL pipet ile donatılmış bir P10 mikropipet kullanarak bir örnek neurosphere seçin. sadece tek bir neurosphere 2 mcL pipet sütun ayarlayarak her zaman alınır emin olun. Her neurosphere için yeni bir pipet kullanın. </li><li> kaplanmış 50-iyi odacıklı lamel bir kuyunun merkezi üzerine neurosphere aktarın. </li><li> Tekrarlayın odacıklı lamel conta her bir kuyu kadar 5.5 ve 5.6 adımlarıBir neurosphere ins. Not: Neurospheres bir laminer akış başlığı içinde ya da sıra üzerine yerleştirilmişlerdir mikroskop altında aldı edilebilir. </li><li> odacıklı lamel her bir kuyunun 10 uL MGK&#39;nın farklılaşma orta ekleyin. MGK farklılaştırma ortamının kurumasını önlemek için çanak kenarları boyunca bir 10 cm&#39;lik kültür kabı ve pipet PBS odacıklı lamel yerleştirin. bir 10 cm kültür çanak iki odacıklı lamelleri kadar yerleştirin. Gece boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde (10 cm kültür kabı içinde ihtiva) bölmeli lamel inkübe edin. </li></ol> Örnek Neurospheres 6. Farklılaşma (Gün 9) <ol><li> 15 ml konik santrifüj tüpüne (bölüm 3 itibaren) toplu kültür neurospheres gelen farklılaşma ortamı aktarın. farklılaşma orta 2-3 mL koparmasını yapıştırılır hücreleri önlemek için kültür çanak kalmasını sağlamak. 20 ml steril şırınga kullanarak, bir 0.2 μ içinden farklılaşma orta geçmesim filtre herhangi bir hücre veya enkaz kaldırmak için. </li><li> geri yapıştırılır hücreleri içeren 10 cm kültür çanak filtrelenmiş farklılaşma orta aktarın. </li><li> Steril forseps kullanarak, yavaşça örnek Neurospheres aşağıya bakacak şekilde ters çevrilmiş bir şekilde farklılaşma ortamına odacıklı lamel yerleştirin. 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca farklılaşma ortamı ile odacıklı lamel inkübe,% 5 CO2. Not: Örnek Neurospheres farklılaşma ortamı ile temas halindedir, ancak altında farklılaşan hücreler ile temas halinde. </li></ol> Farklılaştırılmış Neurospheres 7. Tespit (Gün 12) <ol><li> Yavaşça steril forseps kullanarak 10 cm kültür çanak odacıklı lamel çıkarın. Yavaşça koşullu orta yıkayın PBS içine lamel batırın. </li><li> lamel silikon conta soyulabilir. lamel bozulmaması için nazikçe ve yavaşça bu gerçekleştirin. nerede inci tarafında dikkat edinE farklılaşmış Neurospheres yapıştırılır. </li><li> lamel ölçülerine parafın filmi kesmek bir parça üzerine,% 4 paraformaldehid (PFA) Pipet 1 mi. Yavaşça PFA ile temas aşağı bakacak neurospheres ile parafin film üzerinde lamel yerleştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Neurospheres saptamak. Dikkat: PFA toksik hem sıvı hem de buhar şeklinde ve yanabilir. buharı solumaktan kaçının ve Göz ve cilt ile temasa geçin. Her zaman bir havalandırmalı davlumbaz PFA anlaştım. </li><li> parafın film parçası üzerine PBS pipetle 1 ml. hafifçe Neurospheres, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile temas içinde aşağı doğru bakacak şekilde lamel yerleştirerek Neurospheres yıkayın. </li><li> Adımı yineleyin 7.4 iki kez daha. </li></ol> Farklılaştırılmış Neurospheres 8. O4 Boyama (Gün 12) <ol><li> PBS içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. parafın film parçası üzerine% 3 BSA pipetle 1 ml. hafifçe placin tarafından neurospheres engelleg, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle BSA ile temas içinde (Neurospheres aşağı bakacak şekilde) lamel. </li><li> Pipet 1 fare anti-O4 IgM antikorunun ml: parafın film parçası üzerine (3: 1,% BSA içinde 300 seyreltme) ve antikor ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film lamel. O4 boyama oda sıcaklığında 2 saat süre ile meydana izin verin. </li><li> Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın. </li><li> Yeşil fluoresan boya konjüge-anti-fare IgM ikincil antikor pipetle 1 ml (1: 500% 3 BSA içinde seyrelti) parafın film parçası üzerine ve antikor ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film lamel . karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat bekletin. NOT: itibaren bu adımdan karanlık bir ortamda immün gerçekleştirin. </li><li> Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın. </li></ol> 9. Tuj1 ve glial fibriller asidik protein (GFAP) boyamaFarklılaştırılmış neurospheres (Gün 12) <ol><li> % 3 BSA: Triton X-100 (% 0.5 son konsantrasyon) eklenerek çözelti Su-geçirimli hazırlayın. parafın film parçası üzerine çözelti Su-geçirimli Pipet 1 ml. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca su-geçirimli çözeltisi ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film lamel yerleştirin. </li><li> Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın. </li><li> Fare pipetle 1 ml anti-Tuj1 IgG 2a antikoru (1: 500% 3 BSA içinde seyreltme) ve tavşan anti-GFAP IgG antikoru (1: 3% BSA içinde 1000 seyrelti) parafın film ve bir yer örtücü bir parça üzerine ilgili antikorlarla temas aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin filmi. Tuj1 ve GFAP boyama oda sıcaklığında 2 saat süre ile meydana izin verin. NOT: Her iki antikor, tek bir çözelti halinde elde edilebilir. </li><li> Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın. </li><li> Kırmızı floresan boya Pipet 1 mLkonjüge-anti-fare IgG 2a (1: 3% BSA içinde 500 dilüsyon) ve uzak-kırmızı flüoresan boya konjüge-anti-tavşan IgG (1: 3% BSA içinde 500 dilüsyon) parafın film ve yerde bir parça üzerine ikincil antikorlar antikorlar ile temas aşağı bakacak neurospheres ile parafin film üzerine lamel. Oda sıcaklığında 1 saat bekletin. NOT: Her iki antikor, tek bir çözelti halinde elde edilebilir. </li><li> Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez lamel yıkayın. </li><li> PBS içinde 300 nM&#39;ye 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) stok çözeltisi ile seyreltilir. çekirdek boyama için oda sıcaklığında 2 dakika için DAPI ile temas içinde aşağı gelecek şekilde neurospheres parafin film parafın film ve bir yer örtücü bir parça üzerine DAPI Pipet 1 ml. </li><li> Aşama 7.4 de tarif edildiği gibi, iyonu giderilmiş su ile bir kez PBS ile ve iki kez de lamel yıkayın. Uygun bir montaj orta kullanarak bir cam slayt lamel monte edin ve oda sıcaklığında O / N kurumasını bekleyin. </li></ol> 10. ImaFarklılaştırılmış neurospheres ging (Gün 13) <ol><li> 40x kullanarak bir konfokal mikroskop altında görüntü Neurospheres. sırasıyla, oligodendrosit, nöronlar ve astrositler algılamak için 488 nm, 594 nm ve 647 nm lazerler kullanın. </li><li> unipotent, bipotent ve tripotent neurospheres yüzdesini belirlemek. Not: - oligodendrosit nöron ve astrositler 5,14,15,26 Etkili üç nöral soy ayırt etmek neurosphere yeteneği belirlenir. Oligodendrosit O4 (bölüm 8) için pozitif boyama ile tanımlanır. Nöronlar Tuj1 (Bölüm 9) pozitif boyama ile tanımlanır. Astrositler GFAP (bölüm 9) için pozitif boyama ile tespit edilir. Bir unipotent neurosphere soy sadece birine ayırır ve pozitif O4, GFAP veya Tuj1 biri için leke gerekir. Bir bipotent neurosphere herhangi iki soy içine ayıran ve olumlu O4 ve GFAP veya O4 ve Tuj1 veya GFAP ve Tuj1 için leke gerekir. Farklı bir tripotent neurosphereÜç soy içine ara ürünlerinin pozitif O4, GFAP ve Tuj1 için leke gerekir. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak ilgi popülasyonda MGK sıklığının saptanması: MGK frekans = (tripotent neurospheres NFU x%) /% 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+neural+stem+cells.">The culture of neural stem cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+Population+Analyses+Demonstrate+That+an+EGF-Responsive+Mammalian+Embryonic+CNS+Precursor+Is+a+Stem+Cell.">Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell.</a> Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).</li><li>Narayanan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+mRNA+Profiling+Identifies+Progenitor+Subclasses+in+Neurospheres.">Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres.</a> Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells.">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).</li><li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LeX/ssea-1+Is+Expressed+by+Adult+Mouse+CNS+Stem+Cells,+Identifying+Them+as+Nonependymal.">LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal.</a> Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).</li><li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LeX+is+expressed+by+principle+progenitor+cells+in+the+embryonic+nervous+system,+is+secreted+into+their+environment+and+binds+Wnt-1.">LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1.</a> Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).</li><li>Corti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+neural+stem/progenitor+cells+based+on+Prominin-1+expression.">Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression.</a> Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).</li><li>Nagato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+characterization+of+neural+stem+cells+by+flow+cytometry+analysis+using+a+combination+of+surface+markers.">Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers.</a> J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).</li><li>Kim, M., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Populations+of+Forebrain+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+Can+Be+Isolated+Using+Side-Population+Analysis.">Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis.</a> J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).</li><li>Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+neural+stem+cells+in+the+developing+and+adult+mouse+brain.">Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain.</a> J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).</li><li>Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain.">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).</li><li>Tham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSPG+Is+a+Secreted+Factor+that+Stimulates+Neural+Stem+Cell+Survival+Possibly+by+Enhanced+EGFR+Signaling.">CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling.</a> PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).</li><li>Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ApoE+as+an+autocrine/paracrine+factor+that+stimulates+neural+stem+cell+survival+via+MAPK/ERK+signaling+pathway.">Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway.</a> J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).</li><li>Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+survival+factors.">Neural stem cell survival factors.</a> Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+neural+stem+cell+self-renewal,+growth+and+differentiation.">Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation.</a> Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Neural+Stem+Cells+Reside+into+the+Rostral+Extension+and+Olfactory+Bulb+of+Adult+Rodents.">Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents.</a> J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+and+Fibroblast+Growth+Factors+Behave+as+Mitogenic+Regulators+for+a+Single+Multipotent+Stem+Cell-Like+Population+from+the+Subventricular+Region+of+the+Adult+Mouse+Forebrain.">Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li><li>Vescovi, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cloning+of+multipotential+stem+cells+from+the+embryonic+human+CNS+and+establishment+of+transplantable+human+neural+stem+cell+lines+by+epigenetic+stimulation.">Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation.</a> Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).</li><li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony-Forming+Cell+Assay.">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).</li><li>Coles-Takabe, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don't+look:+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies.">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li><li>Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observational+examination+of+aggregation+and+migration+during+early+phase+of+neurosphere+culture+of+mouse+neural+stem+cells.">Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Yu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+Visualization,+and+Molecular+Signature+of+Neural+Stem+Cells.">Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells.</a> Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).</li><li>Yu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1qR1+is+comparable+with+LeX+and+Prom1+as+a+neural+stem+cell+marker.">C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker.</a> Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , (2012).</li><li>Tham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+colony-forming+cell+assay.">Neural colony-forming cell assay.</a> A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , (2009).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Surface+Marker+Signatures+for+the+Isolation+of+Neural+Stem+Cells,+Glia+and+Neurons+Derived+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Are+Markers+of+Human+Neural+Stem+Cells.">Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells.</a> Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Biz hee klonal koşullarda NSC&#39;lerde numaralandırma açıklar. Kritik adımlar, taze MGK büyüme ve farklılaşma ortam maddesinin kullanımını ve ayrıca kaplamak için taze hazırlanmış PLL / laminin çözeltisinin kullanımı odacıklı lamelleri, hem de kültür kaplarına içerir. Bu neurospheres optimal büyüme ve farklılaşma koşulları sağlar. kaliteli antikorların kullanımı etkili nöronlar ve glia, hem de diğer neurospheres ile temas halinde olmayan klonal neurospheres seçici toplama tespit etmek için, önemlidir. Ayrıca, o kadar kuru değil aldı neurospheres sağlamak için önemlidir. Her 10 neurospheres çekme sonra her oyuğa farklılaşma orta 10 uL eklemek için tavsiye edilir. Farklı örneklerden neurospheres arasında çapraz karışmayı önlemek için, numune başına bir adet 10 cm&#39;lik bir tabakta bir odacıklı lamel kullanılması önemlidir. İki lamelleri (farklı numune, her ihtiva Neurospheres) yerleştirilir iseAynı 10 cm çanak, bir lamel Neurospheres belirli soy içine ayırt etmek için diğer lamel içinde neurospheres eğilimi değiştiren faktörleri serbest olabilir. Aynı 10 cm&#39;lik bir tabakta iki lamelleri da örnekler arasında karıştırmak neden olabilir. NFU veya MGK frekans beklenenden daha düşük olması durumunda, düşük geçit sayısı Neurospheres kullanıldığından emin olun. Sağlıklı düşük geçiş Neurospheres koşullandırılmış ortam üretilmesi için kullanılması da önemlidir. Neurospheres örneğin 96 gözlü tabak içinde küçük çaplı olan kuyularda kültürlenir Ardından, o zaman manevra ve bir mikropipet kullanılarak Neurospheres almak zor olacaktır. Bu durumda, önceki çekme için, bir 6-yuvalı tabak olarak, daha büyük bir kültürü çanak Neurospheres aktarın. aldı neurospheres Bazı kültür ve immün sırasında odacıklı lamel kapalı kaldırabilir. kültür sırasında odacıklı lamel hareketini ve daha az yoğun yıkama en aza indirmek,immün sırasında ing, neurospheres ayrılmasını önlemek için yardımcı olacaktır. İlk çalışmalar sadece NFA 7,11,13 kullanarak NSCs sayısal. NSC&#39;lerde ve erken NPS hem neurospheres 5 oluşturmak Ancak, NFA MGK frekansını overestimates. Louis et al. NCFCA 21,22 şekilde bilinmektedir NSCs ölçmek için bir yöntem geliştirdi. NCFCA klonalite sağlamak için kollajen bazlı bir matris içinde tek hücre kültür edilmesini içerir, ve çapı 2 mm üzerinde Neurospheres yalnızca NSC&#39;lerde oluşturduğu gösterilmiştir. NCFCA benzer şekilde, klonalite bu protokol boyunca sağlanır. Bu klonal yoğunlukta Neurospheres oluşturma ve odacıklı lamelleri olarak Neurospheres farklılaştırarak elde edilir. odacıklı lamelleri kullanılması bir çok avantaj bahşeder. odacıklı lamel her bir örnek neurosphere böylece diğer örnek neurospheres ile fiziksel temas olan farklılaşma sırasında klonalite sağlanmadan ayırt etmek için izin verir.odacıklı lamel Örnek Neurospheres sürekli konması ve en farklılaşmasını sağlamak için izin vermek için farklılaşma ortamına süspansiyon yerleştirilebilir. farklılaşması sırasında koşullandırılmış ortam ve serum yokluğunda, neurospheres sağkalım düşürür ve Neurospheres çok astrositler (Tham M Ahmed S, yayınlanmamış) oluşturur. Buna ek olarak, immüno neurospheres uygun zaman uzun süre saklanabilir ve odacıklı lamelleri mikroskop cam slaytlar doğrudan monte edilebilir. bir hızla, iyi odacıklı küçük de neurosphere bulmak bir görüntü yakalamak ve bir sonraki kuyuya taşıyabilirsiniz Buna ek olarak, immüno neurospheres görüntüleme kolay yapılır. Biz bu yazıda 27 ve NCFCA 28 anlatılan protokol ikisini de kullanarak E14.5 fare neurosphere kültüründe MGK frekansı belirledik. ikisi de benim tarafından belirlenen E14.5 fare neurospheres NSC frekansthods karşılaştırılabilir. NCFCA multipotent ve uzun vadeli kendini yenileme kapasitesine sahip NSCs sıralar. Bizim yönteminden MGK frekans NCFCA gelen karşılaştırılabilir olduğundan, bizim protokolden okuma MGK frekansını abartma görünmüyor. NCFCA tamamlanmak üzere üç hafta gerektirir ve özellikle hücre kaplama ve orta ikmal içerir. Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek için 13 gün gerektirir ve farklı adımların serisi, örneğin, neurosphere toplama ve immün içerir. Bu protokol NSCs numaralandırmak için alternatif bir yöntem olarak hizmet verebilir. Araştırmacılar kendi örneklerinde MGK frekansını doğrulamak için NCFCA ve bu protokolü hem de kullanabilirsiniz. Bu protokolün bir sınırlama önemli adımlar bir dizi olması tüm gün 8. 50-de odacıklı lamel klimalı ortamın hazırlanması, örnek neurospheres NFU belirlenmesi ve örnek neurospheres transferi üzerinde yapılacak olması dekar üzerinde yapılany 8. Tek bu adımları tamamlamak için zaman alabilir. Buna ek olarak, verimli bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için pratik gerektirir. Neurospheres yaygın MGK fonksiyonu ve davranışlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, Neurospheres NSC&#39;lerde ve NP hem oluşmaktadır. Bu nedenle, MGK biyoloji çalışma neurospheres arasında NSCs ettirecek önemlidir. Şu anda, hücre yüzeyi markerleri, boya çıkarma özelliği ve hücre boyutu ve ayrıntı NSC&#39;lerde 6,7,9-13,29,30 zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Bu protokol potansiyel MGK belirteçleri ile NSC&#39;lerde zenginleştirme ölçmek için ve kesin MGK işaretleyici aramayı kolaylaştırmak için kullanılabilir. Dört yeni çalışmalar MGK frekansını 5,14,15,26 numaralandırmak için bu protokolü kullanılır.

Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) kendini yenilemek ve multipotent vardır, merkezi sinir sistemi (MSS) hücrelerdir. NSC&#39;lerde ilk embriyonik ön beyin gelişimi sırasında belirlenen ve bu tür lateral ventriküllerin subventricular bölge (SVZ) ve hipokampus dentat girus (DG) gibi belirli bölgelerde yetişkin beyinde devam etmeye devam edilir. MGK hatlarının bir dizi böyle Batten hastalığı 1 olarak inme ve diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. NSC&#39;lerde ve nöral atalarıdır (NPS) Neurospheres adlandırılan 3 boyutlu sfero yapılarını yüzen olarak kültüründe yayılır. Embriyonik ve yetişkin kortikal hücre, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) 2-4 mevcudiyetinde bölmek olabilir saptandığında neurosphere kültür sistemi, 1990&#39;ların başında Reynolds ve Weiss tarafından geliştirilmiştir. Neurospheres C heterojen bir karışımı oluşurfarklı gelişim aşamalarında 5 de alt sınıflar oluşan arşın. Özellikle nedeniyle NPS varlığı neurospheres elde edilen verileri kullanarak NSCs çalışmaya zordur. Bu nedenle, neurospheres gelen NSCs ettirecek önemlidir. Bu, dört ana yöntem, in vitro olarak NSC&#39;lerde zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Ana hücre yüzeyi markerlerinin kullanımı. Lewis-X (Lex) ve (aynı zamanda Prominin1 olarak da bilinir) CD133 MGK 6-9 işaretleme kalemler en önemli hücre yüzeyi vardır. Sindekan-1, Çentik 1 ve integrin beta1 NSC&#39;lerde 10 ettirecek diğer yüzey proteinleridir. İkincisi boya dışlama olduğunu. Fluoresan DNA bağlanma boya Hoechst 33342 üzerinden pompa için eşsiz bir yeteneği vardır yan popülasyonu, hücrelerin, NSC&#39;lerde 11 zenginleştirilmiş olduğu gösterilmiştir. Üçüncü morfolojik seçim kullanılmasıdır. Artan hücre boyutu ve ayrıntı hücreler muadillerinden 5,12,13 daha NSCs liman olduğu gösterilmiştir. Dördüncü MGK su eklenmesidirKültür ortamına rvival faktörler. Bu Kondroitin sülfat proteoglikan eklenmesinin gösterilmiş ve apolipoprotein E NSC hayatta kalmasına katkıda bulunur ve bu yüzden MGK frekansı 14,15 artar. Transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere pek çok belirteçler NSC&#39;lerde 16,17 ile ilişkili olsa da, bu markerlerin hiçbiri saflığına NSCs ettirecek edebiliyoruz. Kesin MGK belirteçlerin eksikliği nedeniyle, bu NSCs ölçmek ve in vitro NPS onları ayırmak için bir sorundur. İlk çalışmalar NSCs 7,11,13 ölçmek için neurosphere formasyonu deneyi (NFA) kullanılır. Bu tahlilde, hücreler ayrışmış Neurospheres oluşturmak üzere kültürlenir ve neurospheres sayısı belirlenir kaplı her 100 hücre için oluşturulan. Bu değer Neurosphere Formasyonu Birimi (NFU) olarak adlandırılır. Tüm Neurospheres NSC&#39;lerde kaynaklanan eğer NFU MGK frekansını eşittir. Bununla birlikte, her iki Neurospheres NS tarafından oluşturulan gibi NFU MGK frekansı tahminini fazla olduğu gösterilmiştirCs ve erken NPS 5. Böylece, sadece neurosphere oluşumuna dayanan NSCs numaralandırmak için yanlıştır. Bu onların yeteneklerine göre NSCs ölçmek mümkün olabilir, kendini yenilemek yoğun çoğalmaya ve multipotent neurospheres oluşturur. Duyarlı EGF ve bFGF olan NSC&#39;lerde, genellikle en az on pasajları hayatta ve böylece kültür 4,18-20 geniş kendini yenileme kapasitesini gösterir. hem duyarlı EGF ve bFGF olan NPS, aynı zamanda, uzun bir süre için bir kaç geçişleri ancak için Neurospheres oluşturabilir. Bu nedenle, yaygın iyi niyetli NSC&#39;lerde en az on geçişleri için neurosphere oluşumuna dayanan adil bir doğrulukla numaralandırılan edilebileceği kabul edilmiştir. Çalışmaların çoğunda, ancak, kendini yenileme nedeniyle genellikle on geçişleri için gerekli olan uzun deneysel zaman ikincil veya üçüncül neurosphere oluşumu dayalı olarak ölçülür. Bu nedenle, ikincil NFA geniş kendini yenileme yeteneği bahsi karşılaştırma için kullanılabilirween popülasyonları, ama doğru MGK frekansını numaralandırmak için kullanılamaz. NSC&#39;lerde NP kıyasla daha büyük bir çoğalma yeteneğine sahiptir. NSC&#39;lerde Bu özellik Louis ve arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Nöral koloni oluşturan hücre deneyi (NCFCA) 21,22 - MGK sayımı için bir test geliştirmek için. Bu deneyde, tek hücreler kolajen ihtiva eden yarı katı matris içinde 3 hafta içinde kültürlenir. Bu kültür koşulları altında, çapı 2 mm üzerinde Neurospheres hücreler, tripotent ve uzun bir dönem için kendi kendine yenileyebilir gösterilmiştir. Bu hücreler NSC&#39;lerde olarak tanımlanır. Bu nedenle, NSC&#39;lerde etkin bir NPS ayırt edilir. NSC&#39;lerde astrositler, oligodendrositler ve nöronlar içinde farklılaşan yeteneğine sahiptir. neurospheres farklılaşması için, büyüme faktörleri kaldırılır ve serum, kültür ortamına ilave edilir. Her üç sinir soy o neurosphere başlatılan daha sonra hücre bir neurosphere gözlenen ise benBir MGK s. Ancak, farklılaşma denemesi bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, farklılaşması için kullanılan kültür koşulları üç nöral soylarının üretimi için uygun olmayabilir. Aslında, tek neurosphere farklılaşma sürecinde, çok hücre ölümü meydana gelir ve çok astrosit nesil (Tham M ve yayınlanmamış Ahmed S) meydana gelir. İkincisi, klonalitenin sorunu var. NSC&#39;lerde, oluşumu ve neurospheres farklılaşma doğru sayım için, her neurosphere tek bir hücreden kaynaklanan klonal koşullar altında gerçekleştirilmesi gerekir. Toplu süspansiyon kültürlerinde, toplama hücresel ve neurosphere seviyelerinde 23-25 hem de oluşur. Her neurosphere neurosphere sayma ve multipotency değerlendirilmesini karmaşık hale birden fazla hücre veya neurospheres, ortaya için nedenle, mümkündür. Son kanıtlar hücrelerinin toplanması 0.5 hücre / aşağıda uL veya ve düşük kaplama yoğunluğunda meydana gelmez gösterir kültür plakaları neu sırasında taşınır zamanrosphere oluşumu 15. Böylece klonalite sağlayacak kadar düşük yoğunlukta hücrelerin kültürlenmesi. Şu anda, NCFCA NPS gelen NSCs ayırt ve MGK frekansını numaralandırmak için en sık kullanılan yöntemdir. NCFCA Ancak üç hafta nispeten uzun bir zaman alır. Burada, multipotent Neurospheres oluşturulması için NSC&#39;lerde yeteneklerine göre MGK frekans numaralandırmak için bir protokol açıklar. Bu protokol gerçekleştirmek için sadece 13 gün sürer. kollajen matris neurospheres hareketini önlediği NCFCA klonalite sağlamaktadır. Bu protokolde kullanılan kültür koşulları, aynı zamanda klonalite boyunca muhafaza edilmesini sağlar. Örneğin, 50-çukurlu odacıklı lamelleri kullanımı Neurospheres birbirlerine temas etmeden ayırt etmesini sağlar. Ayrıca, neurospheres (Şekil 1) farklılaşma potansiyelinin en üst düzeye çıkarmak farklılaşma sırasında nörotrofik faktörler malzemeleri orta klimalı kullanın.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml sterile syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>300141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>300144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody&#160;</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP IgG antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope fitted to laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>1000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-O4 IgM antibody&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse</td>
			<td>TS100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture dishes</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm culture dishes&#160;</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16534-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.45 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N Sodium hydroxide (NaOH)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-well chambered coverslips&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat function&#160;</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>UC152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a&#160; antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6&#8217;-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;RT1 75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10006021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventilated fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;pH meter&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enumeration of neural stem cells using clonal assays

astrositler, nöron ve oligodendrositleri - nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) kendini yenilemek ve üç büyük nöral soyları üretmek için yeteneği var. NSC&#39;lerde ve nöral progenitörler (NPS) neurospheres in vitro genel olarak kültürlenir. Bu protokol klonal şartlar altında belirli bir hücre popülasyonunda MGK sıklığını belirlemek için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Protokol klonal neurospheres üretilmesine olanak sağlayan bir yoğunlukta hücreler tohumlama ile başlar. Neurospheres sonra odacıklı lamelleri transfer ve neurospheres farklılaşma potansiyeli maksimize şartlandırılmış ortamda, içinde klonal şartlarda ayrılır. Son olarak, MGK frekans neurosphere oluşumu ve multipotency yeteneklerine göre hesaplanır. Bu protokolün Kamu aday MGK belirteçlerin değerlendirilmesi, NSC&#39;lerde saflaştırılması ve NPS gelen NSCs ayırt yeteneği vardır. Bu yöntem çok s olan gerçekleştirmek için 13 gün sürerGeçerli yöntemlere göre daha Hörter MGK frekansını numaralandırmak için.

Biz NSC&#39;lerde için zenginleştirmek için Lex, bilinen bir hücre yüzeyi MGK işaretleyici 7 yeteneğini değerlendirmek için bu protokolü kullanılır. Bu çalışmadan elde edilen veriler NSC&#39;lerde protokolde klonal tahliller kullanılarak numaralandırılır nasıl göstermek için kullanılacaktır. E14.5 fare neurosphere hücreleri, anti-Lex antikoru ile inkübe edilmiştir. Daha sonra, Lex (Lex -) eksprese etmeyen Lex (Lex +) ve hücrelerinde bulunmuştur (FACS) flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre 50 hücre / ml&#39;de ekildi ve 1 wk klonal Neurospheres oluşturmak için bırakılmıştır. Time-lapse görüntüleme Neurospheres 50 hücreleri üretilen gösterir / ml klonal (Şekil 2). Lex + ve Lex için NFU - hücreler tespit edildi. Hücreleri (Şekil 3g) - Lex + hücre Lex ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek neurosphere oluşum yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Oluşturulan Neurospheres sonra ayırt edildiklonal koşullar altında, daha sonra boyanmış (Şekil 3a-e) &#39;de görüntülenmiştir. Hücreleri (Şekil 3F) - Lex + hücreleri önemli ölçüde daha fazla tripotent Lex daha Neurospheres oluşturur. MGK frekansı sonra NFU ve tripotent neurospheres (Şekil 3g)% &#39;si olarak hesaplanmıştır. Lex dayalı seçim, bir MGK işaretleyici olarak Lex doğrulayarak, 14&#39;ten fazla kat MGK frekansını zenginleştirir. Biz de bu protokol 27 ve NCFCA 28 kullanılarak E14.5 fare neurospheres MGK frekansını tespit ettik. Her iki yöntem de E14.5 fare neurospheres yaklaşık% 2 karşılaştırılabilir MGK frekansını bildirmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" /> Klonal Koşullarında Neurosphere Farklılaşma için Şekil 1. Protokol. Klonal koşullarda yetiştirilen Numune neurospheres tek tek her PLL / Laminin-c yerleştiriliriyi bir 50-iyi odacıklı lamel oated ve / N O uymak için izin verdi. Aynı gün, dökme kültürlenmiş Neurospheres PLL / laminin ile kaplanmış 10 cm tabak farklılaşma ortama yerleştirilmiş ve / nO yapışmaya izin verilir. Toplu kültürlenmiş neurospheres ertesi gün, kıvamlandırılmış ortam filtre edildi ve tekrar 10 cm çanak içine yerleştirilmiştir. Örnek neurospheres sonra klimalı ortama ters ve 3-4 gün 28 için. Farklılaştırmak için izin verilen <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" /> E14.5 neurospheres türetilen Şekil klonal neurosphere 2. Büyüme. Hücreler ayrılmış ve 96-yuvalı tabak ml / 50 hücre tohumlandı. Bireysel hücreler zaman atlamalı görüntüleme ile 6 gün boyunca takip edildi. o görüntüleriBir neurosphere içine büyüyen ne tür hücre gösterilir. neurosphere klonalite tutar unutmayın. (A) 0 gün; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; İlk sayısı gün belirtir burada, ikinci sayı gün fraksiyonuna değinmektedir, ve üçüncü sayı h fraksiyonuna değinmektedir. 10X büyütme. Ölçek çubuğu, 100 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" /> Şekil Klon Neurospheres ve MGK Frekansı Numaralama 3. Farklılaşma. Tek neurospheres 3 gün 50-iyi odacıklı lamel toplanmış ve ayırt edildi. Bir tripotent neurosphere sta bir temsilcisi görüntü(a) DAPI ile daimi olarak tutturulabilir ve (b) GFAP için immuno, (c) Tuj1 ve (d) O4. (D) - (e) (a) kaplamayı gösterir. Ölçek çubuğu, 65 mikron. (F) unipotent, bipotent ve tripotent Lex + ve Lex tarafından üretilen neurospheres% - hücreleri (ortalama ± SEM, n = 3). Lex + ve Lex (g) MGK frekans -. NFU ürünü ve tripotent neurospheres% olarak hesaplanmıştır hücrelerin <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays at JoVE.com

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) kendini yenilemek ve üç sinir soy içine ayırt edebilirsiniz hücrelere bakın. Burada, klonal koşullarda neurosphere oluşumu ve farklılaşmayı kullanarak belirli bir hücre popülasyonu MGK sıklığını belirlemek için bir protokol açıklar.

Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

enumeration-of-neural-stem-cells-using-clonal-assays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Görüntüleme.  Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).  Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve üç sinir soy içine ayırt edebilirsiniz hücrelere bakın. Burada, klonal koşullarda neurosphere oluşumu ve farklılaşmayı kullanarak belirli bir hücre popülasyonu MGK sıklığını belirlemek için bir protokol açıklar. 

Video: Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Nörobilim

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Civciv Embriyo Özü murin Sinir Crest Kök Hücre Yetiştiriciliği Üretimi

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.