我々は、この研究に資金を提供するための科学技術研究庁（* STARの）、シンガポールに感謝します。

動物の治療は、IACUCとNACLARガイドラインに従って行われ、動物部門（（http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11）によって承認されました。 注：以前5に記載のようにニューロスフェア培養物を胚（E14）C57BL / 6マウスの前脳から調製しました。 文化クローンサンプル神経球の1（1日目） <ol><li> / 10 NG：、EGF（最終濃度：20 ngの/ mL）を：B27サプリメント（1×最終濃度）を含むダルベッコ改変イーグル培地/栄養F-12（DMEM / F12）培地を組み合わせることにより、NSCの増殖培地を準備し、bFGFの（最終濃度mL）およびペニシリン/ストレプトマイシン（最終濃度：1×）。 </li><li> 1 mLのNSCの増殖培地、室温で7分間1 mLの0.05 N水酸化ナトリウムでのE14.5マウスニューロスフェアを解離します。上下ピペット細胞は時折、懸濁液中の細胞を維持します。ニュートラルに0.05 N塩酸の1 mLを加えアルカリをIZE。 注：ニューロスフェア細胞を10cm培養皿で20,000細胞/ mLで播種し、37℃、5％CO 2で5日間培養します。予想収量は後に10cmディッシュあたり約10万個の細胞です。次いで、これらの細胞を解離し、ステップそれぞれ1.2および1.3に記載のクローン密度で播種します。 <ol><li>トリパンブルー染色し、血球計数器を用いて細胞数を実行します。 </li></ol></li><li> 96ウェルディッシュ中/ mLの以下100μLNSCの増殖培地中で50個の細胞の密度で種単E14.5マウスニューロスフィア細胞。クローンのニューロスフェアを生成するために、wは37℃で1、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 注：細胞が互いに接触しないようにクローン性は、この密度でニューロスフェア形成中に確保されています。 </li></ol>馴化培地のための神経球の2.文化（3日目） <ol><li>ステップ1.2で説明したようにE14.5マウスニューロスフェアを解離します。 </li><li> Eからシード単細胞10cmの培養皿中で10 mLのNSCの増殖培地中に20,000細胞/ mlの密度で14.5マウスニューロスフェア。バルク培養ニューロスフェアを生成するために、5日間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 </li></ol>条件培地ニューロスフィアの調製（8日目） <ol><li> 700μLを混合して塗布液を調製し、0.01％ポリ-L-リジン（PLL）、70の1mgμL/ mlのラミニンとのリン酸緩衝生理食塩水6,230μL（PBS）。 </li><li>被膜を37℃で2時間、PLL /ラミニン溶液の7mLのと10cmの培養皿。 </li><li> 10 mLの血清学的ピペットを使用して、15 mLのコニカル遠心分離管にすべてのバルク培養ニューロスフェアを転送します。室温で1分間、171×gでニューロスフェアを遠心分離し、上清を完全に除去します。 </li><li> B27（最終濃度：1×）を含むDMEM / F12培地を組み合わせることにより、NSCの分化培地を調製し、ウシ胎児血清（FBS）（最終濃度：0.5％）広告ニューロスフェアへのNSCの分化培地のD 10ミリリットル。アップピペットで数回上下ニューロスフェアを再懸濁します。 </li><li> 10cmの培養皿から吸引し、PLL /ラミニンおよび10 mLのPBSで1回洗浄。 PLL /ラミニンでコーティングされた10cmの培養皿にすべての神経球を転送します。皿に付着するの神経球を37℃、5％CO 2でO / Nインキュベートします。 </li></ol>サンプルニューロスフィアのNFUの4決意（8日目） <ol><li> （;セクション1 1日目に播種）だけでなく、顕微鏡下でそれぞれに形成された神経球の数をカウントします。 注：NFUを与えるメッキ100細胞当たりに形成されるニューロスフェアの数を、決定します。 </li></ol> 50ウェルチェンカバースリップ（8日目）にサンプルニューロスフィアの5.移転<ol><li>被膜を37℃で2時間、PLL /ラミニンコーティング溶液10μLで50ウェルチャンバーカバースリップの各ウェル。 注：に記載のように塗布液を調製ステップ3.1。 </li><li> PBSそれぞれの30 mLを含む3×50 mLのコニカル遠心チューブを準備します。滅菌ピンセットを用いて、コーティングした50ウェルチャンバーカバースリップを削除します。塗布液を洗い流すために、第二、次いで、PBSの第3チューブに続いてPBSの第1のチューブの中にチャンバーカバースリップを浸します。 </li><li>チャンバーカバーガラスのウェルから残りの液体を吸引します。 </li><li>静かに96ウェルディッシュの各ウェルからすべてのメディアとニューロスフェアをピペットし、単一の10cmの培養皿に移します。 </li><li>顕微鏡下で、10μLピペットチップを装着したP10マイクロピペットを用いてサンプルのニューロスフェアを選択します。単一の神経球を2μLにピペット列を設定して、各時間に取得されていることを確認してください。各ニューロスフェアのために新しいピペットチップを使用してください。 </li><li>コーティングした50ウェルチャンバーカバースリップの井戸の中心に神経球を転送します。 </li><li>繰り返して、チェンカバースリップコンタの各ウェルまで5.5と5.6ステップニューロスフェアをINS。 注：ニューロスフェアは、層流フード内またはベンチトップ上に置かれ、顕微鏡下で採取することができます。 </li><li>チェンカバースリップの各ウェルに10μLNSCの分化培地を追加します。 NSCの分化培地の乾燥を防ぐために、皿の縁に沿って10cmの培養皿とピペットPBSでチャンバーカバーガラスを置きます。 1 10cmの培養皿に2室のカバースリップまで置きます。 37℃、5％CO 2で一晩（10cmの培養皿に含まれている）のチャンバーカバースリップをインキュベートします。 </li></ol>サンプルニューロスフェアの6分化（9日目） <ol><li> 15 mLのコニカル遠心チューブに（部3からの）バルク培養した神経球から分化培地を転送します。分化培地の2-3 mLの取り外しから接着細胞を防止するために、培養皿に残っていることを確認してください。 20 mLの滅菌注射器を使用して、0.2μを通じて分化培地を渡しますメートルフィルタは、任意の細胞や破片を除去します。 </li><li>バック付着した細胞を含有する10cmの培養皿にフィルタリング分化培地を転送します。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、静かにサンプルのニューロスフェアを下向きにしているような反転方法で分化培地上にチャンバーカバースリップを配置。 37℃で3日間分化培地とチャンバーカバースリップをインキュベートし、5％CO 2。 注：サンプルの神経球分化培地と接触しているではなく、分化細胞と接触して下。 </li></ol>分化した神経球の7.固定（12日目） <ol><li>静かに滅菌ピンセットを用いて、10cmの培養皿からチャンバーカバースリップを削除します。静かに馴化培地を洗い落とすためにPBSにカバースリップを浸します。 </li><li>カバーガラスからシリコンガスケットをはがし。カバーガラスを破損しないために静かに、ゆっくりと、これを実行します。サイド番目の点に注意してください電子分化した神経球が接着されています。 </li><li>カバースリップの大きさにパラフィンフィルムの切断片の上に4％パラホルムアルデヒド（PFA）のピペット1ミリリットル。ゆっくりとPFAと接触して下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にカバースリップを配置。 RTで20分間のニューロスフェアを修正しました。 注意：PFAは、液体および蒸気形態の両方で毒性があり、可燃性です。蒸気の吸入を避け、皮膚や目に接触。常に換気ドラフト内でPFAを扱います。 </li><li>パラフィンフィルム片の上にPBSのピペットで1 mLです。穏やかに神経球を室温で10分間、PBSに接触して下方に向けてカバースリップを配置することによって、ニューロスフェアを洗浄します。 </li><li>繰り返しステップ7.4をさらに2回。 </li></ol>分化した神経球の8. O4染色（12日目） <ol><li> PBS中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）を準備します。パラフィンフィルム片の上に3％BSAをピペット1ミリリットル。優しくplacinによってニューロスフェアをブロックRTで30分間、BSAと接触している（下に向けてニューロスフェアで）グラムカバースリップ。 </li><li>ピペット1マウスmLの抗O4 IgM抗体（1：3％BSAで300倍希釈）パラフィンフィルム片の上に及び抗体と接触して下向きにニューロスフェアにパラフィンフィルム上にカバースリップを配置。 O4染色は室温で2時間に発生することができます。 </li><li>ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。 </li><li>緑色蛍光色素コンジュゲート抗マウスIgM二次抗体のピペット1mLの（1：500 3％BSAで希釈）パラフィンフィルム片へと抗体と接触して下向きにニューロスフェアパラフィンフィルム上にカバースリップを配置。暗所で室温で1時間放置。 注：これ以降のステップから暗い環境で免疫染色を行います。 </li><li>ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。 </li></ol> 9.するTuj1およびグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）染色分化した神経球の（12日目） <ol><li> 3％BSAに：トリトンX-100（0.5％最終濃度）を添加することによって浸透溶液を調製します。パラフィンフィルム片に溶液を透過性のピペットで1 mLです。 RTで20分間透過化溶液と接触下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にカバースリップを置きます。 </li><li>ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。 </li><li>マウスのピペット1mLの抗するTuj1のIgG 2aは抗体（1：500 3％BSAで希釈）およびウサギ抗GFAP IgG抗体（1：3％BSA 1,000希釈）パラフィンフィルムと場所カバースリップの一片上に抗体と接触して下向きにニューロスフェアとパラフィンフィルム。 Tuj1およびGFAP染色は室温で2時間に発生することができます。 注：両方の抗体は、単一の溶液として調製することができます。 </li><li>ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。 </li><li>赤色蛍光色素のピペットで1 mLのコンジュゲート抗マウスIgG 2A（1：3％BSA中で500倍希釈）および遠赤色蛍光色素コンジュゲート抗ウサギIgG（1：3％BSA中で500希釈）パラフィンフィルムと場所の一片上に二次抗体抗体と接触して下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にカバースリップ。室温で1時間放置。 注：両方の抗体は、単一の溶液として調製することができます。 </li><li>ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。 </li><li> PBSで300 nmの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）ストック溶液を希釈します。核染色のため、室温で2分間DAPIと接触して下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にパラフィンフィルムと場所カバーグラスの作品へのDAPIのピペットで1 mLです。 </li><li>ステップ7.4で説明したように、脱イオン水で1回PBSで二回カバースリップを洗ってください。適切なマウンティング培地を用いてガラススライド上にカバースリップをマウントし、室温でO / Nを乾燥させます。 </li></ol> 10.いま分化した神経球のエージング（13日目） <ol><li> 40Xを用いた共焦点顕微鏡下で画像のニューロスフェア。それぞれ、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを検出するために、488 nmの、594 nmおよび647 nmでレーザーを使用してください。 </li><li>単能性、両能とtripotentニューロスフェアの割合を決定します。 注： -オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイト5,14,15,26効力は3神経系統に分化する神経球の能力によって決定されます。オリゴデンドロサイトは、O4のための陽性染色（セクション8）によって識別されます。ニューロンをするTuj1（セクション9）のための陽性染色により同定されます。アストロサイトはGFAPのための陽性染色（セクション9）によって識別されます。単能性神経球は、系統のいずれか一方のみに分化し、積極O4、GFAPまたはのTuj1のいずれかを染色する必要があります。両能性の神経球は、任意の2つの系統に分化し、積極O4およびGFAPまたはO4とするTuj1またはGFAPとするTuj1を染色する必要があります。異なるtripotentのニューロスフェアすべての3つの系統にiatesと積極O4、GFAPとのTuj1を染色する必要があります。 </li><li>以下の式を用いて、目的の集団におけるNSCの周波数を決定します。 NSC周波数=（tripotentのニューロスフェアのNFUののx％）/ 100％。 </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Surface+Marker+Signatures+for+the+Isolation+of+Neural+Stem+Cells,+Glia+and+Neurons+Derived+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Are+Markers+of+Human+Neural+Stem+Cells.">Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells.</a> Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

私たちは姫クローン性条件下でのNSCの列挙について説明します。重要なステップは、新鮮なNSCの増殖および分化培地の使用、またコートに新たに調製したPLL /ラミニン溶液を用いチャンバーカバーグラスだけでなく、培養皿を含みます。これは、ニューロスフェアの最適な増殖と分化条件を確保します。良質の抗体の使用は、効果的に、ニューロンおよびグリア、並びに他の神経球に接触していないクローンのニューロスフェアの選択的なピッキングを検出するために、重要です。さらに、それを拾って、神経球が枯渇しないようにすることが重要です。すべての10の神経球をピッキングした後、各ウェルに分化培地の10μLを追加することをお勧めします。異なるサンプルからの神経球の間のクロストークを回避するために、サンプルごとに10cmの皿の一方チャンバーカバーガラスを使用することが重要です。 2カバースリップ（異なる試料からそれぞれ含む神経球）に配置されている場合同じ10cmディッシュ、1カバーガラスからの神経球は、特定の系統に分化するために、他のカバースリップにニューロスフェアの傾向を変更することができる因子を放出する可能性があります。同じ10cmの皿の中の二つのカバースリップはまた、サンプル間のミックスアップになることがあります。 NFUまたはNSC周波数が予想よりも低い場合には、低継代数のニューロスフェアが使用されていることを確認してください。健全な低継代のニューロスフェアは、馴化培地を生成するために使用されていることも重要です。ニューロスフェアは、96ウェル皿のように小径、とのウェル中で培養される場合は次に、操縦し、マイクロピペットを用いて、ニューロスフェアを選択することが困難になります。この場合、ピッキングの前に6ウェル皿のようなより大きな培養皿に神経球を移します。選んだニューロスフェアの一部は、文化や免疫染色の間のチャンバーカバーガラスから持ち上げことがあります。培養中のチャンバーカバーガラスの動き、およびより少ない集中的な洗浄を最小限に抑えます免疫染色の際にる、ニューロスフェアの剥離を回避するのに役立つだろう。 初期の研究では、唯一のNFA 7,11,13を使用したNSCを定量化しました。両方のNSCおよび早期NPは、神経球5を生成するようしかし、NFAは、NSCの周波数を過大評価します。ルイらは NCFCA 21,22として知られているのNSCを定量化するための別の方法を開発しました。 NCFCAは、クローン性を保証するために、コラーゲンベースのマトリックス中に単一細胞を培養することを含む、それが直径2mm上記ニューロスフェアのみのNSCによって形成されることが示されました。 NCFCAと同様に、クローンは、このプロトコルを通じて確保されています。これは、クローン密度でのニューロスフェアを生成し、チャンバーカバーガラスでニューロスフェアを微分することにより達成されます。チェンカバースリップの使用は多くの利点を与えます。チャンバーカバースリップは、それによって分化の間にクローン性を確保し、他のサンプルのニューロスフェアと物理的に接触しなくても、区別するために、各サンプルのニューロスフェアを可能にします。チャンバーカバーガラスサンプル神経球を連続的に調整することができるように、最大​​の分化を確実にするために分化培地に懸濁し配置することができます。分化中の馴化培地と血清の非存在下では、ニューロスフェアの生存率は低下し、神経球を主にアストロサイト（タムMとアーメドS、未発表）を生成します。また、免疫染色ニューロスフィアは、好都合に長期間保存することができ、チャンバーカバースリップを顕微鏡用スライドガラス上に直接取り付けることができます。 1はすぐに、よくチャンバー小で神経球を見つけるのイメージをキャプチャし、次のウェルに移動することができるように加えて、免疫染色ニューロスフェアの撮像が容易になります。 我々は、この原稿27とNCFCA 28に記載されているプロトコルの両方を使用してE14.5マウスニューロスフェア培養におけるNSCの周波数を決定しました。私の両方によって決定さE14.5マウスニューロスフェアでNSC周波数thodsは同等です。 NCFCAは多能であり、長期自己再生能力を持っているのNSCを列挙します。我々の方法からNSC周波数はNCFCAからそれに匹敵するので、私たちのプロトコルからの読み出しは、NSCの周波数を過大評価していないようです。 NCFCAが完了するまでに3週間を必要とし、主に細胞播種と培地補充を必要とします。ここで説明するプロトコルは、実行するために13日を要するとステップの異なるシリーズ、 例えば 、神経球のピッキング及び免疫染色を伴います。このプロトコルは、NSCのを列挙するための代替法として役立つ可能性があります。研究者は、その試料中のNSCの周波数を確認するためにNCFCAと、このプロトコルの両方を使用することができます。 このプロトコルの1つの制限は重要な一連のステップは、すべての条件培地、サンプルのニューロスフェアのNFUの決意、そして50ウェルのチャンバーカバースリップへのサンプルのニューロスフェアの転送の準備をしなければならない8日目に行わなければならないことですダ上で実行Y 8.一つは、これらのステップを完了するまでに時間がかかる場合があります。また、効率的な方法でこれらの手順を実行するには練習が必要です。 ニューロスフェアは、広くNSC機能および挙動を研究するために使用されています。しかし、神経球のNSCとNPの両方で構成されています。したがって、NSCの生物学を研究するために、神経球からのNSCを豊かにすることが重要です。現在、細胞表面マーカー、色素排除性並びに細胞サイズおよび粒度は、NSCを6,7,9-13,29,30を濃縮するために使用されてきました。このプロトコルは、潜在的なNSCマーカーによってNSCの富化を定量化し、決定的なNSCマーカーの探索を容易にするために使用することができます。四つの最近の研究では、NSCの周波数5,14,15,26を列挙するために、このプロトコルを使用しています。

神経幹細胞（NSC）自己複製することができる中枢神経系（CNS）の細胞であり、多能です。 NSCは、最初の胚の前脳の開発中に指定されており、このような側脳室の脳室下帯（SVZ）および海馬の歯状回（DG）のように特定の領域での成人の脳に固執し続けています。 NSC線の数は、バッテン病1と脳卒中および他の神経学的疾患の治療のための臨床試験で使用されています。 NSCは神経前駆細胞（NPS）は、ニューロスフェアと呼ばれる3次元回転楕円体構造をフローティングとして、培養中で増殖させます。それらは、胚および成体の皮質細胞は、上皮増殖因子（EGF）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）2-4の存在下で分割できることが分かった場合に神経球培養系は、1990年代初期にレイノルズとワイスによって開発されました。ニューロスフェアは、cの異機種混在で構成され異なる発達段階5でサブクラスからなるells。特にによるNPの存在のために神経球から得られたデータを用いたNSCを研究するために困難です。したがって、神経球からのNSCを豊かにすることが重要です。現在では、4つの主な方法は、in vitroでのNSCを濃縮するために使用されています。第一の細胞表面マーカーの使用です。ルイス-X（LEX）とCD133（もProminin1として知られている）が最も顕著な細胞表面NSCマーカー6-9です。シンデカン1、ノッチ-1とインテグリン-β1は、NSCの10を濃縮する他の表面タンパク質です。第二には、色素排除です。蛍光DNA結合色素ヘキスト33342を送り出すためのユニークな能力を持っているサイドポピュレーション細胞は、NSCの11のために濃縮されていることが示されています。第三には、形態学的選択の使用です。増加した細胞サイズおよび粒度を有する細胞は、それらの対応5,12,13以上のNSCを保有することが実証されています。第四は、NSCのsuの追加です培養培地へのrvival要因。これは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの添加が示されており、アポリポタンパク質Eは、NSCの生存を増強し、従ってNSC周波数14,15を増加させます。転写因子を含む多くのマーカーがNSCの16,17に関連付けられてきたが、これらのマーカーのいずれも、純度のNSCを豊かにすることはできません。決定的なNSCマーカーの欠如のために、それはのNSCを定量化し、in vitroでのNPと区別するために、課題です。 初期の研究では、NSCを7,11,13を定量化するためにニューロスフェア形成アッセイ（NFA）を使用します。このアッセイでは、解離した細胞は、ニューロスフェアを形成するために培養し、神経球の数が決定されるめっきすべて100個の細胞に対して生成されました。この値は、ニューロスフェア形成ユニット（NFU）と呼ばれています。すべてのニューロスフェアはNSCのから発生した場合NFUは、NSCの周波数に等しいです。しかし、神経球は、両方のNSによって形成されるNFUはNSCの頻度を過大評価することが示されましたCsと早期のNP 5。したがって、もっぱらニューロスフェア形成に基づいたNSCを列挙するために不正確です。自己再生広範囲に増殖し、多能ニューロスフェアを生成するそれらの能力に基づいたNSCを定量化することが可能であってもよいです。 EGFおよびbFGF応答性であるNSCは、通常、少なくとも10継代のために生き残るため、文化4,18-20で豊富な自己再生能力を表示します。 EGFおよびbFGFが同様に応答性であるNPは、また、いくつかの通路のためではなく、長期間の神経球を生成することができます。したがって、広く善意のNSCは、少なくとも10継代のためのニューロスフェア形成に基づく公正な精度で列挙できることが受け入れられてきました。ほとんどの研究では、しかし、自己再生は通常により10継代のために必要な長い実験時間に第二又は第三ニューロスフェアの形成に基づいて測定されます。したがって、二次NFAは広く自己再生能力賭けを比較するために使用することができますWEEN集団は、しかし正確にNSCの周波数を列挙するために使用することはできません。 NSCは、NPのに比べて大きな増殖能を有しています。 NSCのこのプロパティは、ルイらによって使用されました。神経コロニー形成細胞アッセイ（NCFCA）21,22 - NSC列挙するためのアッセイを開発します。このアッセイでは、単一の細胞がコラーゲンを含む半固体マトリックス中に3週間培養されます。これらの培養条件下では、直径2mm上記のニューロスフェアを形成する細胞がtripotentあり、長期自己再生することができることが示されました。これらの細胞は、NSCのように定義されます。したがって、NSCは、NPをより効果的に区別されます。 NSCは、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび神経細胞に分化する能力を有します。神経球の分化は、増殖因子を除去し、血清を培地に添加されます。すべての3つの神経系統は、そのニューロスフェアを開始し、その後、細胞神経球で観察されている場合、私NSCは、S。しかし、分化アッセイは、いくつかの制限を有します。まず、分化のために使用される培養条件は、3つすべての神経系統の生成のために最適ではないかもしれません。実際には、単一の神経球の分化過程において、有意な細胞死が発生し、主にアストロサイトの生成は（未発表、タムMとアーメド・S）が発生します。第二に、クローン性の問題があります。 NSCの正確な計数のために、ニューロスフェアの形成と分化は、各ニューロスフェアを単一細胞から生じる場合には、クローン性条件下で行われなければなりません。バルク懸濁培養では、凝集は、細胞および神経球のレベル23-25の両方で発生します。各ニューロスフェアは、多分化の神経球計数および評価を複雑にする、複数のセルまたはニューロスフェアから発生するしたがって、それは可能です。最近の証拠は、細胞の凝集が0.5細胞/μL以下または低いプレーティング密度で発生していないことを示し、そして培養プレートをNEU中に移動されていない場合rosphere形成15。したがってクローン性を確実にするような低密度で細胞を培養します。 現在、NCFCAはNPのからのNSCを区別し、NSCの周波数を列挙するための最も一般的に使用される方法です。 NCFCAは、しかし、3週間、比較的長い時間を要します。ここでは、多能性神経球を形成するNSCの能力に基づいて、NSCの周波数を列挙するためのプロトコルを説明します。このプロトコルは、実行するためにのみ13日かかります。コラーゲンマトリックスは、ニューロスフェアの移動を防止するようNCFCAは、クローン性を保証します。このプロトコルで使用される培養条件はまた、クローンを全体にわたって維持されることを可能にします。例えば、50ウェルチャンバーカバースリップの使用は、ニューロスフェアが互いに接触することなく区別するようになります。さらに、我々は、神経球の分化能（ 図1）を最大化するために、分化中の神経栄養因子を提供する馴化培地を使用します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml sterile syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>300141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>300144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody&#160;</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP IgG antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope fitted to laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>1000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-O4 IgM antibody&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse</td>
			<td>TS100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture dishes</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm culture dishes&#160;</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16534-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.45 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N Sodium hydroxide (NaOH)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-well chambered coverslips&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat function&#160;</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>UC152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a&#160; antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6&#8217;-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;RT1 75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10006021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventilated fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;pH meter&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enumeration of neural stem cells using clonal assays

アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト - 神経幹細胞（NSCは）自己再生および3の主要な神経系統を生成する能力を持っています。 NSCは神経前駆細胞（NPS）は、ニューロスフェアとしてin vitroで一般的に培養されます。このプロトコルは、クローンの条件下で与えられた細胞集団におけるNSC周波数を決定する方法を詳細に説明しています。プロトコルはクローンニューロスフィアの生成を可能にする密度で細胞の播種から始まります。ニューロスフェアは、その後のチャンバーカバーグラスに移し、ニューロスフェアの分化能を最大化する馴化培地中のクローンの条件で区別されます。最後に、NSC周波数はニューロスフェアの形成及び多分化能力に基づいて算出されます。このプロトコルのユーティリティは、候補NSCマーカーの評価、NSCの精製、及びNPのからのNSCを区別する能力が含まれます。この方法は、多くのsとなる、実行するために13日かかりますNSCの周波数を列挙するための現在の方法よりもhorter。

私たちは、NSCのを濃縮するために、LEX、既知の細胞表面NSCマーカー7の能力を評価するために、このプロトコルを使用しています。この研究からのデータは、NSCを、プロトコルにクローンアッセイを使用して列挙されている方法を説明するために使用されます。 E14.5マウスニューロスフェア細胞を抗LEX抗体と共にインキュベートしました。その後、LEX（LEX - ）を発現しないレックス（LEX +）細胞を発現する細胞（FACS）を蛍光活性化細胞選別により50細胞/ mLで播種し、1週間のためのクローンのニューロスフェアを生成させました。タイムラプスイメージングは、ニューロスフェアは、（ 図2）クローンである50細胞/ mLで生成されたことを示しています。 LEX +とLEXのためのNFU -細胞を決定しました。細胞（ 図3G） - LEX +細胞がLEXと比較して有意に高いニューロスフェアの形成能を有することが示されています。生成されたニューロスフェアは、その後、分化させましたクローン条件下で、続いて免疫染色と（ 図3a-e）を撮像しました。細胞（ 図3F） - LEX +細胞はLEXよりも有意にtripotentのニューロスフェアを生成します。 NSC周波数は次にNFUとtripotentニューロスフェア（ 図3G）の％に基づいて算出しました。 LEXに基づく選択は、NSCマーカーとしてLEXを検証し、14以上の倍NSC周波数を豊かにします。また、このプロトコル27とNCFCA 28を使用して、E14.5マウスニューロスフェアのNSCの周波数を決定しました。どちらの方法でも、E14.5マウスニューロスフェアで約2％の同等のNSCの周波数を報告しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" /> クローン条件の下で神経球の分化のために 、図1 のプロトコル。クローン性条件下で成長させたサンプルニューロスフェアは、個別に各PLL /ラミニン-Cに配置されています50ウェルのチャンバーカバースリップでもoated、およびO / Nを付着させました。同日、バルク培養ニューロスフェアは、PLL /ラミニンでコーティングされた10cmの皿に分化培地に播種し、O / Nを付着させます。翌日、バルク培養した神経球からの条件培地を濾過し、10cmの皿に戻されます。サンプルニューロスフェアは、その後。馴化培地上に反転し、3-4日間28分化させている<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" /> クローン神経球の 図2. 成長。E14.5神経球由来細胞を分離し、96ウェルディッシュに50細胞/ mLで播種しました。個々の細胞は、タイムラプスイメージングにより6日間追跡しました。 Oの画像神経球に成長ね、そのようなセルが示されています。ニューロスフェアは、クローン性を維持することに注意してください。 （a）は、0日。 （b）は 1.19.45。 （c）は 2.95.37。 （d）の 3.32.76。 （e）は 4.46.53。 （f）は 5.61.44。最初の数日を指し、2番目の数値は一日の割合を意味し、第3の数は、hの割合を指します。倍率10倍。スケールバー、100μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" /> 図クローン神経球およびNSC周波数のEnumerationの3分化。シングルニューロスフェアは、3日間50ウェルチャンバーカバースリップで拾い、分化させました。 tripotentのニューロスフェアの駅の代表画像（a）は、DAPIでINEDおよび（b）GFAP免疫染色のため、（C）のTuj1および（d）O4。 （D） - （e）は （a）ののオーバーレイを表示します。スケールバー、65μmで。 （f）の単能性、両能とtripotent LEX +とLEXで生成されたニューロスフェアの％ -細胞（平均±SEM; n = 3） でした 。 LEX +およびLEX（g）においてNSC周波数- 。NFUの製品とtripotentニューロスフェアの％として計算されるセルは、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

神経幹細胞（NSCは）自己再生および3神経系統に分化することができる細胞を指します。ここでは、クローン性条件下でニューロスフェア形成および分化を使用して、指定された細胞集団におけるNSCの周波数を決定するためのプロトコルを説明します。

クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

enumeration-of-neural-stem-cells-using-clonal-assays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K ビュー.  Agency for Science, Technology and Research (A*STAR). 神経幹細胞（NSCは）自己再生および3神経系統に分化することができる細胞を指します。ここでは、クローン性条件下でニューロスフェア形成および分化を使用して、指定された細胞集団におけるNSCの周波数を決定するためのプロトコルを説明します。 

ビデオ: Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

神経科学

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.