We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).

1. Dokunmatik uyarılmış Tepki Testi <ol><li> Dokunmatik uyarılmış Tepki Testi için Embriyolar dpf&#39;e 2 hazırlanması <ol><li> Etkinlik gün 17,18 boyunca önemli ölçüde değişebilir çünkü testi yapılır hangi günün hangi saati deneyler arasında tutarlı olduğundan emin olun. NOT: Deney kör gerçekleştirilen ve test sırası deneysel eserler en aza indirmek için randomize edilmelidir. </li><li> balık atama deneyi yürüten kişiye bilinmeyen bir numara suşları. serbestçe kullanılabilir online araçlar test sırasını belirleyen rastgele listesini oluşturmak kullanarak, bu aşağıdaki. </li><li> en az bir saat önce test, koryon bir delik kopyalama ve yavaşça ince cımbız çifti kullanılarak ayrı koryon çekerek dechorionate embriyolar. 28 ° C inkübatör dönmeden önce petri pislikleri temizleyin. </li></ol></li><li> Dokunmatik uyarılmış Tepki Testi Sahne <ol><li> Isı stage 28 ° C&#39;de en az 15 dakika için test başlamadan önce. Bu aşama sıcaklığı kontrol edilir ve 28 ° C&#39;de kalır: NOT &#160; Test süresince ° C. Sıcaklık aktivitesini etkileyecek ve sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek önemlidir. ısıtılmış aşamada mevcut değilse, o zaman, su sıcaklığının izlenmesi ve tüm deneyler aynı sıcaklıkta yürütülmelidir. </li><li> Embriyo orta (5 mM NaCl, 0.17mM KCI, 0.33 mM CaCl2, su içinde 0.33 mM MgSO 4) aydınlatılmış sahneye dolu bir petri yerleştirin ve petri üzerinde yüksek hızda kamera monte. </li><li> balık o kadar hızlı yüzme eylemi kaydedilir emin olmak için yakalama hızı olarak sn (1000 fps) 1.000 çerçevesini seçin (örneğin burada açıklanan izle Pix 5 gibi) ve &quot;çalışma alanı&quot; sekmesi altında video kamera kayıt yazılımı başlatın. </li><li> Bir seferde bir embriyo ile çalışan, Midd embriyo yerleştiringörüş alanında açıkça görülebilir zebrabalıkları sahip petri Le. NOT: Embriyo deney başlamadan recapturing ve embriyo konumlandırma bazı hastalık modellerinde kas zayıflığı teşvik edebilir uyaran ve tekrarlanan patlama yanıtları hissizleştirilmek neden olabileceğinden, başka bir ile değiştirin uzak öncesinde yüzer edin. </li><li> &quot;Rekor&quot; butonuna tıklayarak kaydetmeye başlayın ve başın üstünde bir künt iğne ile hafifçe dokunarak embriyo mechanosensory uyaran sunmak. </li><li> Embriyo görüş alanının dışında swum veya dinlenme döndüğünde Kaydı durdur. NOT: Mekanik uyaran aşağıdaki patlama kaçış tepkisi ilk 0,2 saniye içinde ivme zirveleri. Bu nedenle, balık görüş alanında bir kayıt çıkış tepkisinin ilk 0.2 saniye boyunca en az olduğundan emin olun. Adım 1.2.3 açıklanan yazılımı kullanarak, veriler otomatik olarak kaydedilirBir avi video dosyası olarak. Böyle indirmek için serbestçe kullanılabilir her ikisi de Bedava Video Capture veya Softonic, gibi alternatif video yakalama yazılımı da kullanılabilir. </li><li> Yeni bir petri embriyo dönün ve test için başka bir embriyo seçin. 15 balık az üzerinde test gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Yüzme Davranış sayısallaştırılması <ol><li> Yüzme davranışı ölçmek için, yazılımı başlatmak ve Avi kaydedilen video dosyasını açmak için &quot;arka plan çıkarma olmadan Tek Larva Locomotion&quot; modülünü seçin. </li><li> &quot;Freehand&quot; ya da filmin menü çubuğu seçme alanlardan &quot;çokgen&quot; aracını kullanarak analiz için kullanılacak. Bölge balık orijinal pozisyonunu ve balık yüzmek olacağı bölgeyi hem de kapsar emin olun. prob analiz edilecek alanın dışında olduğundan emin olun. Yazılım otomatik olarak istenilen alanda balık yörüngesini takip edecektir. </li><li> t gerçekleştirmek içinO analiz, menü çubuğundan &quot;deney&quot; linkine tıklayın ve &quot;yürütme&quot; seçeneğini seçin. Istenen konumda ham veri analizi dosyası (.phr biçimi) kaydetmek isteyip istemediğiniz sorulduğunda. kaydettikten sonra, analiz başlamak için &quot;start&quot; tıklayın. &quot;Deney&quot; altında &quot;stop&quot; tıklayarak analizi End açılır menüsünden. sonuçlarını içeren bir pencere ekrana gelecektir. </li><li> &quot;Maksimum ivme&quot; değerini elde etmek için sağa kaydırın. İstenirse, sonuçlar pencereyi kapatmak ve &quot;sonuçları&quot; başlığı altında &quot;ihracat anlık sonuç&quot; butonuna tıklayarak bu verileri dışa açılır menüsünden. Uygun ham veri analizi dosyasını seçin ve açık tıklayın. bir elektronik tablo programında açılabilir bir metin dosyası hedef klasörde kaydedilir. </li><li> Her balık ve her bir suş için ortalama maksimum ivme elde etmek için ortalama bu işlemi tekrarlayın (Şekil 1). Not: Alternatif olarak usin içing Burada açıklanan yazılım, böyle serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım gibi benzer paketler ilgili hareket veri ayıklamak için kullanılabilir. 3D Parçacık Tracker eklentisi yüzme yörüngeleri izlemek için kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2. Hareket Testi - 10 dk Swim Testi <ol><li> Yüzme Analizi Embriyolar dpf&#39;e 6 Hazırlanması <ol><li> Gerekirse, sıralama embriyolar gerekli genotipi için, ayrı bir Petri kabı (tabak başına 25-30 embriyo) bir floresan protein veya fenotip ile ifade incelenmesi ve yerine göre örneğin. Seçenek olarak ise, genotip hareket tahlilin tamamlanmasından sonra belirlenebilir. </li><li> 3 dpf&#39;e, petri kapları yeniden incelemek ve herhangi bir çıkmamış embriyolar ve enkaz kaldırmak. 6 dpf&#39;e kadar 28 ° C inkübatör Petri yemekleri dönün. </li><li> Zebra balığı larvaları en aktif olduğu zamandır 9 am ve 12 saatleri arasında tüm suşların testini gerçekleştirin. p test ve pozisyonu sırası rastgelevahşi tip ve mutant örneklerin geç sirkadiyen farklılıklar ve diğer deneysel önyargı etkilerini en aza indirmek için. NOT: etkinlik gün boyunca önemli ölçüde değişebilir, çünkü test süresi deneyler arasında tutarlı olması önemlidir. </li><li> En az 30 dakika, oyuk başına bir larva ile 48 oyuklu plaka test yer larvalarına karşı önceden. Su yüzeyi sadece kuyunun üst altında olacak şekilde transferinden sonra hiçbir kabarcıkları vardır sağlanması, kuyu doldurun. 28 ° C inkübatör plakaları dönün. </li><li> kuluçka plakaları almak ve testten önce beş dakika ışığında iklime alıştırmak. </li></ol></li><li> Hareket tahlilin gerçekleştirilmesi <ol><li> Bu larvalar karanlıkta tespit edilebilir, böylece 60 kare / saniyeye kadar yakalayan, kızılötesi dijital kamera ile donatılmış kayıt odasına, içine 48 plaka yerleştirin. Kuyuların tüm lokomosyon yazılımına dairesel ızgara içine yerleştirilir emin olun ve tüm larvalar cle olduğunuarly saptanabilir. </li><li> yazılımı başlatmak ve &quot;izleme&quot; modülünü seçin. &quot;Dosyası&quot; altında &quot;oluşturmak yeni protokol&quot; üzerine tıklayın ve deney için kullanılan kuyuların numarayı düzenleyin. Deneme süresini ve &quot;parametreleri&quot; butonuna tıklayarak 10 dakika için entegrasyon süresini hem de set menü açılır ve &quot;protokol parametrelerini&quot; ve daha sonra &quot;zaman&quot; sekmesini seçerek. Aynı &quot;protokol parametreleri&quot; diyalog kutusunda &quot;seçenekler&quot; sekmesine tıklayın ve &quot;Numeriscope&quot; checkbox &quot;protokol parametreleri&quot; diyalog kutusu kapatılabilir, aşağıdaki tıklandığında emin olun. </li><li> kayıt alanları kuyulardan birinde tüm ızgara ve çift tıklayın vurgulamak ayarlayın. &quot;Çizmek alanlar&quot; butonuna tıklayın ve sol üst, sağ üst ve sol alt kuyuların etrafında çizmek ve yazılım otomatik olarak her bir konumunu belirlemek için izin verir &quot;build&quot;, tıklayın. Ayrıca bir ölçekte çizmekbar ve &quot;grubu için geçerli&quot; üzerine tıklayın. Tamamlandığında, &quot;alanlarını çizmek&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Görme sadece balık hareketleri arka plan sinyalleri ile ortaya koyan bir seviyeye &quot;algılama eşiği&quot; çubuğunu kaydırarak algılama eşiğini belirler. NOT: algılama eşiği suşları ve böylece eşikleri, yeni bir suş test zaman belirlenmelidir arasında değişecektir. Örnek veriler 25 mm bir algılama eşiği sunulmaktadır / sn cinsinden kullanılmıştır. </li><li> test başlamadan önce hareketsizlik tespiti ve küçük ve büyük hareketler için hareket eşik girin. NOT: temsilci veriler 6 mm / sn bir hareketsizlik eşiğini ve 30 mm&#39;lik bir etkinlik patlama eşiğine sundu In / sn kullanılmıştır. eşikleri minimum hareket aktif dikkate alınması gereken belirlemek ve gerekli seviye patlama aktivitesini kabul ve (küçük aktif içine ancak patlama eylemlerinde altında faaliyet sınıflandırma izin edilecekty eşikleri) ve patlama aktivitesi eşiğinden daha büyük (büyük) hareketleri. eşikler incelendi özel balık türlerinin aktivitesine bağlı olarak değiştirilebilir. Not: Deney, ya açık ya da koyu koşullarda gerçekleştirilebilir, ancak zebra balığı larvası koyu 18 daha aktif olduğu gösterilmiştir. </li><li> &quot;Parametreleri&quot; altında &quot;ışık sürüş ayarları&quot; butonuna tıklayarak% 0 olması odasının içine ışık yoğunluğunu ayarlayın açılır menüsünden. Ortaya çıkan diyalog kutusunda, gerekli ışık ayarları ekleyin. NOT: odasının içine ışık yoğunluğu larva aktiviteyi teşvik etmek test süresinde ve kapatmak için tetiklenebilir </li><li> kayıt odasının kapısını kapatın ve video kaydını başlatmak. </li></ol></li><li> Yüzme Davranış sayısallaştırılması <ol><li> Deney tamamlandıktan sonra, &quot;deney&quot; altında &quot;stop&quot; linkine tıklayarak menüyü aşağı bırakın. Bir diyalog botüm sonuçlar x gösterilecektir. </li><li> &quot;Içeren açmak klasördeki&quot; konulu excel tıklamayla bu sonuçları erişebilir ve ortaya çıkan klasöründe görünür excel dosyasını açın. önemli parametreler &quot;smlct&quot; (küçük hareket sayımı), &quot;larct&quot; (büyük hareket sayımı), &quot;smldist&quot; (küçük hareketlerle balık tarafından katedilen toplam mesafe) ve &quot;lardist&quot; büyük hareketler balık kapsadığı (toplam mesafe vardır ). NOT: Kayıt sonrasında, yazılım da 10- sırasında hareketin bir görsel temsilini içeren ve bir .png resim dosyası ((10 dk kayıt video içeren) bir .avi dosyası biçiminde iki ek çıkış dosyaları döndürür dak deneyi; bakınız Şekil 2). </li><li> Lokomosyon değerleri hesaplanır kez doğru hesaplanmış lokomosyon değerleri balık yüzme hareketlerini tasvir edip, (bakınız Şekil yorumlayan .avi ve .png dosyalarını yeniden3). Not: Burada tarif edilen yazılım kullanılarak bir alternatif olarak, örneğin serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı gibi paketler lokomotor davranışını izlemek için de kullanılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splice+site+mutation+in+laminin-&#945;2+results+in+a+severe+muscular+dystrophy+and+growth+abnormalities+in+zebrafish.">A splice site mutation in laminin-&#945;2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).</li><li>Gupta, V., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model &amp; Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li><li>Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+BAG3+myofibrillar+myopathy+suggest+a+toxic+gain+of+function+leading+to+BAG3+insufficiency.">Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).</li><li>Sztal, T. E., Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+nemaline+myopathy+reveal+a+spectrum+of+nemaline+bodies+contributing+to+reduced+muscle+function.">Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function.</a> Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).</li><li>Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+discovery+and+global+gene+expression+analysis+in+zebrafish.">Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish.</a> Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).</li><li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation.">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).</li><li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown.">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. , (2005).</li><li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays.">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. (82), e50925 (2013).</li><li>Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+measurement+during+contraction+to+assess+muscle+function+in+zebrafish+larvae.">Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li><li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+6-minute+walk+test+as+a+new+outcome+measure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).</li><li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+6-minute+walk+test+and+other+clinical+endpoints+in+duchenne+muscular+dystrophy:+reliability,+concurrent+validity,+and+minimal+clinically+important+differences+from+a+multicenter+study.">The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study.</a> Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).</li><li>Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+locomotor+activity+in+zebrafish.">Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).</li><li>MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+in+larval+zebrafish:+Influence+of+time+of+day,+lighting+and+ethanol.">Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+dominant+ACTA1+disease+recapitulate+human+disease+and+provide+insight+into+therapies.">Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies.</a> Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).</li><li>Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ACTA1+mutation+resulting+in+a+severe+congenital+myopathy+with+nemaline+bodies,+intranuclear+rods+and+type+I+fibre+predominance.">A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance.</a> Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).</li><li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish.">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).</li><li>Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+of+larval+zebrafish:+ontogeny+of+body+waves+and+implications+for+locomotory+development.">Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development.</a> J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).</li><li>Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonia+congenita-associated+mutations+in+chloride+channel-1+affect+zebrafish+body+wave+swimming+kinematics.">Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics.</a> PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).</li><li>Moggio, M., Colombo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disease+heterogeneity:+a+prognostic+challenge.">Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge.</a> Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

fareler, köpekler, Zebra balığı, sinek ve solucanlar gibi birçok farklı hayvan modelleri kas hastalıklarının genetik ve moleküler temeli anlayışımız yolunda katkıda ve bunlarla mücadele etmek terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde yardımcı olması. Zebra balığı kas hastalığı çalışmaları için çeşitli avantajlar sunuyor. Zebra balığı, in vitro kültür sistemlerinde mümkün değildir, uygun bir fizyolojik bir ortamda, karmaşık kas modelli değerlendirmek için genetik olarak manipüle edilebilir bir sistem sağlar. Diğer omurgalı hayvan modellerinde farklı olarak, hep birlikte optik berraklık üretilen balık sayıda, in vivo kimyasal ve genetik tarama hızlı, yüksek hacimli kolaylaştırır. Burada zebrabalıkları embriyogenez sırasında kas performansını değerlendirmek için yüksek verimlilik ve otomatik bir yöntem sağlamak için Zebra balığı hareket deneyleri gelişimini açıklar. Her iki tahliller için de kabul edilmesi gerektiğini sirkadiyen ritimler vedış çevresel uyaranlara anlamlı zebrabalıkları yüzme davranışı 17,18 etkileyecektir. Aynı zebrabalıkları Tekrarlanan test de 23 uyaran dokunsal yanıt olarak bir azalmaya neden alışkanlık yol açacaktır. Bu nedenle, deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar her zebrabalıkları embriyo elde etmek için sadece bir gün ve aydınlatma koşulları zaman standardize edilmelidir kez test edilmiş ve su sıcaklığı sıkı regüle edilmesi gerekmektedir edilmelidir. doğrudan kas kuvveti ile orantılı bir patlama yüzme eylemi, maksimum ivme ölçebilir dpf&#39;e dokunma kullanarak 2&#39;de analiz uyarılmış. Zebra balığı Önceki teknikler ölçülür bir elektrik alanı ve kas 14 kuvvet üreten yeteneğini kullanarak uyarılan kas kasılması deneysel ekipman aşağıdakilere embriyoların her iki ucunu bağlayarak kas kuvveti inceledik. Bu yöntem, t üretim kapasitesi kuvvetini ölçer ikenO larva kas, bu yüzme sırasında larva kas tarafından üretilen gerçek gücü ölçmez. Bu nedenle dolaylı olarak kas sağlığının genel bir ölçü sağlamak için, normal larva yüzme hareketi sırasında oluşan kuvveti değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. 1000 kare hızında bireysel zebrabalıkları hareketleri kayıt yeteneğine yüksek hızlı video sistemi, / sn gözle doğrudan ayırt edilemez kas fonksiyonlarının küçük ama anlamlı farklılıklar tespit etmek için kullanılabilir. Bu elektriksel olarak uyarılmış kuvvet nesil değişiklikleri yüzme performansında değişiklikler ile ilişkili bildirilen ne kadar önceden görmek için ilgi olacaktır. Ek olarak dokunmatik yanıt deneyler ayrıca lokomotor davranışlar nicel bir ölçümünü elde etmek için, yüzme hareketi 24 boyunca vücut dalga şekli ve hız gibi yüzme kinematik değerlendirmek için kullanılabilir uyarılmış. Nedeniyle zebraf spontan hareketineish larvalar 3 dpf&#39;e sonra, biz kas fonksiyonunu ölçmek için dokunmatik uyandırmak deneyleri gerçekleştirmek mümkün değildi. Tersine, biz 6 dpf&#39;e Zebra balığı larvalarının mesafe swum belirleyerek daha uzun bir süre boyunca kas performansını ölçtük. Bu test, kas fonksiyonunun dolaylı ölçüm de, balık bozulmuş kas performansının 8 veya nörodejenerasyonu 25,26 görüntülendiği belirlemek için kullanılabilir. Bu test 6 dakika yürüme testine benzer bir ölçüm sağlar ama aynı zamanda in vivo ilaç ya da mutagenez ekranlarında otomatik yüksek verimlilik için uygun değil sadece.

Geçtiğimiz on yıl zebrabalıkları üzerinde giderek kas hücre biyolojisi ve hastalık incelemek için kullanılır olmuştur. optik netlik ile birleştiğinde zebrafish embriyo, hızlı dış gelişme, kas oluşumu, büyüme ve fonksiyon doğrudan görselleştirme izin verir. Kas geliştirme süreci son derece zebrabalıkları muhafaza edilir ve bu müsküler distrofi ve konjenital miyopatiler 1-8 da dahil olmak üzere kas hastalıklarının bir dizi başarılı modelleme izin verdi. Zebra balığı modellerin detaylı olarak incelenmesi ancak bu koşulların patobiyolojisi yeni bakış açıları sağlanan değil, aynı zamanda uygun tedavilerin 6,9-13 test için bir platform sağlamadı. kas hastalıklarının zebrabalıkları modellerinin analizi kas performansını ölçmek için güvenilir ve tekrarlanabilir deneyleri dayanır. Önceki çalışmalar başarıyla tarafından DPF 3 ila 7 arasında balık Zebra balığı gövde kas kuvveti üreten yeteneği ölçülür varelektriksel bir güç iletim sistemi 14 bağlı bir hareketsizleştirilmiş balık kasılmasını stimüle eder. Bu kuvvet detaylı ölçümler sağlayabilir ancak ideal yüksek verim deneyleri için uygun değildir ve yüzme sırasında kas performansını ölçmek için avantajları vardır. Zebra balığı kas dpf 2&#39;de tamamen işlevseldir ve balık uyaranlara yanıt olarak patlama yüzme hareketleri ortaya çıkarabilir. dokunmatik uyandırmak çıkış yanıt deney kasılma gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir bir darbe yüzme hareketi sırasında ivme ölçümü için kullanılır. Miyopati hastalarda kas fonksiyonlarının en çok kullanılan önlemlerden biri toplam mesafe sert ve düz bir yüzeye 15,16 yürüdü kaydeden 6 dk yürüme testidir. Biz toplam mesafe yapılırsa yapılsın izlemek ve böylece, zebra balığı larvası dpf 6 kas fonksiyonu ölçmek için kıyaslanabilir bir test uygulanmış ve 10 dakikalık bir süre boyunca, her bir larvaya yapılan hareketlerin sayısı var. Bu gerçekleştirilirkas performansı, güvenilir ve yüksek verimli ölçümleri sağlayan otomatik bir izleme sistemi kullanılarak. Her iki kas testleri yüksek oranda tekrarlanabilir ve Zebra balığı miyopati modellerde 8 kas performansında farklılıklar ölçmek için kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G X 1&#39; Blunt Needle</td>
			<td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td>
			<td>TE2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>Baumer</td>
			<td>HXC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://www.randomization.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.1.2, 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16001-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StreamPix5</td>
			<td>NorPix</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Control Unit</td>
			<td>Viewpoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, style 8</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>T04-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrabox System</td>
			<td>Viewpoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebralab</td>
			<td>Viewpoint</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.3.1, 2.2.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish

Zebra balığı kas gelişimi son derece onlara kas fonksiyonu ve hastalık incelemek için mükemmel bir model yapma memeli sistemlerle muhafaza edilir. iskelet kas fonksiyonunu etkileyen birçok miyopatiler hızlı ve kolay bir embriyogenez ilk birkaç gün içinde zebrafish değerlendirilebilir. 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) tarafından, wild tip zebrabalıkları kendiliğinden kuyruk kasları sözleşme ve 48 hpf, Zebra balığı sergi kontrollü yüzme davranışlarıyla. sıklığında azalma, ya da diğer değişiklikler, bu hareketler bir iskelet kas disfonksiyonu gösterebilir. yüzme davranışlarını analiz ve erken Zebra balığı gelişiminde kas performansını değerlendirmek için, biz de dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi ve hareket analizleri kullanmaktadır. Dokunmatik uyarılmış kaçış tepki deneyleri hızlı kasılan kas liflerinin kasılmasıyla ortaya çıkan kısa patlama hareketleri sırasında kas performansını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu durumda, bir dokunun bir dış etmenin etkisi, yanıt olarak,Baş, sonrası fertilizasyon (dpf) 2 gün wild tip Zebra balığı genellikle keskin dönüşler eşliğinde güçlü bir patlama yüzmek, sergilerler. Bizim yöntemi ivme kas kasılması tarafından üretilen kuvvet ile doğru orantılı olarak, bir patlama yüzme hareketi sırasında maksimum ivmeyi ölçerek iskelet kası fonksiyonunu rakamlarla. Buna karşılık, erken zebra balığı larva gelişimi sırasında hareket yeteneği deneyler, kas aktivitesinin devam dönemlerde kas performansının değerlendirilmesi için kullanılır. yüzme davranışlarını izlemek için bir izleme sistemi kullanarak, biz onların iskelet kas fonksiyonlarının yansıtıcı 6 gün eski Zebra balığı faaliyet ve mesafe sıklığı otomatik hesaplama, edinin. yüzme performansı ölçümleri hastalık modelleri ve iskelet kas fonksiyonunu etkileyen mutasyonlar veya kimyasal tedavilerin yüksek verimli tarama fenotipik değerlendirme için değerlidir.

Dokunun yanıt deney Kas gücünün orantılı ölçüsüdür hızı ve yüzme hareketlerinin ivmesini belirlemek için kullanılabilir uyarılmış. Mekanik bir uyarana tepki olarak böyle vahşi tip Zebra balığı sergi hızlı bir yüzme eylem dpf&#39;e kafasına 2 küçük musluk gibi. Video yakalanır ve iki farklı zebra balığı miyopati modellerde analiz edilmiştir: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), önemli bir kas güçsüzlüğü gösterilmiştir nemaline miyopati modeli ve şiddetli kas kusurları tarif edildiği Duchenne kas distrofisi modeli 19,20 dpf&#39;e 5 de. Tipik bir dokunuş bir videodan Görüntüler Şekil 1A temsil edilmektedir tahlil uyarılmış. Zebra balığı hızlandırılması incelenmiş ve patlama yüzme kaçış tepkisi (Şekil 1B) ilk 0,2 saniye içinde zirveye bulunmuştur. Bu zirve maksimum ivme kuvveti g orantılı bir önlem sağlariskelet kası kapasitesini enerating. Tg (ACTA1 D286G -eGFP): ortalama 276,0 ± 28,8 m / s 2, n = 3 bağımsız tekrarlı deneyin içeren = maksimum ivme değerleri her bir suş için bir ortalama maksimum ivme değeri (ortalama ± standart hata) elde etmek üzere ortalaması alınmıştır 15 ayrı balık; Vahşi tipli kontrolü: Ortalama = 500,8 ± 50,28 m / sn 2, n = 15 ayrı balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 - / - mutant: Ortalama = 249,9 ± 19,1 m / sn 2, n = 12-19 bireysel balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 +/- heterozigot: Ortalama = 235,9 ± 8.7 m / sn 2, n = 16-27 bireysel balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 + / + wild tip homozigot: Ortalama = 230,9 ± 8.7 m / sn 2, n = 8-27 bireysel balık (Şekil 1C) içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri. Beklendiği gibi, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Balık fare modelleri ve hasta verileri 8,21,22 ile tutarlıdır azalmış kas fonksiyonunu gösteren maksimum ivmelenme önemli bir azalma olduğu görüldü. Dmd pc2 - / - mutant balık, ancak 20 (Şekil 1D) dpf&#39;e 3 ila kas kusurları tespit tutarlı, 2 dpf&#39;e, maksimum ivme hiçbir fark olmadığını göstermiştir. Hareket deneyleri kas performansında bir gösterge olarak zebra balığı suşlarının aktivitesi ve uzaklık swum belirlemek için 6 dpf yapıldı. Test sonrasında on dakikalık test süresi boyunca yüzme hareketleri şematik bir gösterimi sırasıyla yavaş ve hızlı hareket dönemleri temsil eden kırmızı ve yeşil çizgiler ve hareketsizlik dönemleri (Şekil 2) temsil eden siyah çizgilerle, üretilmiştir. oppos olarak hareketsizlik nispeten hiçbir dönemleri ile Bireysel yabanıl tip zebrabalıkları gösteri yüksek etkinlikEd test süresi (Şekil 2B) içinde daha az aktif olan Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Balık e. Yüzme davranışı her balık (Şekil 3) ile hareketi sayısı ve uzaklık swum münferit değerlerin ortalaması alınarak belirlendi. Her ikisi de, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) balık (Şekil 3A ve 3B) ve DMD, PC2 - / - Mutant balık (Şekil 3C ve 3D), ilgili göre swum hareketleri ve mesafe ortalama sayısında belirgin bir azalma olduğu bulunmuştur kontroller: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) balık: hareketlerin ortalama sayısı = 94.3 ± 13.6, ortalama mesafe yapılırsa yapılsın = 112.9 ± 18.4 mm, n = 45 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; vahşi tip kontrolleri: hareketlerin sayısını = 177.4 ± 14.0 ile ortalama mesafe yapılırsa yapılsın = 300.2 ± 22.8 mm, n = 3 bağımsız r45 balık içeren eplicate deneyler; dmd pc2 - / - mutant: mesafe swum ortalama hareketlerinin sayısını = 163.3 ± 30.0 ortalama: 298.4 ± 60,37 mm, n = 12-20 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 +/- heterozigot: hareketlerin sayısı ortalama = ± 38,8 362,3, mesafe swum ortalama: 660,3 ± 86.1mm n = 17-27 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 + / + vahşi tip homozigot: hareketlerin sayısını = 341.9 ± 91.6 ortalama = 574,3 ± 170.9mm n = 8-25 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri mesafe swum anlamına gelir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> Şekil 1:. Kantitasyonu Zebra balığı embriyolarının dpf&#39;e için 2 yanıt deneyi dokunmatik-uyandırmak kontrol zebrabalıkları (A) Anlık görüntüleri sırasında 2 dpf&#39;e deneyleri dokunmatik-uyandırmak. (B) ilk 0.2 saniye Hızlanma eğrisiTek Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (kırmızı) ve dokunmatik uyarıcının uygulanması, aşağıdaki tek bir kontrol (mavi) zebra balığı. maksimum ivme noktalı çizgilerle temsil edilmektedir. (C, D) (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebrabalıkları dokunmatik uyarılmış müdahale deneyleri kaydedilen maksimum ivmelenme (m / sn2) miktarının ve (D) dmd pc2 - / - mutant balık 2 dpf&#39;e zebrafish kontrol grubuna göre. Hata çubukları, 3 suret deneyler için ortalama ± SEM temsil * p &lt;0.05. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> Şekil 2:. Zebra balığı embriyolarının için lokomosyon tahlillerin Temsil (A) balığı embriyolar 48 oyuklu plakalara yerleştirilir ve hareket kızılötesi sayısal kamera kullanılarak yukarıda kaydedilir. Kırmızı çizgiler yavaş hareketler ve (yazılım girilen algılama eşikleri ile belirlendiği gibi) hareketsizlik gösteren siyah çizgiler gösteren hızlı hareketler, yeşil çizgiler tasvir ile test döneminde Zebra balığı hareket (B) şematik. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu figür.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> Şekil 3:. Zebra balığı larvalarının dpf&#39;e için 6 lokomosyon tahlillerin Kantitasyonu hareketlerinin (A) sayısının Kantitasyonu ve (B) Tg 6 dpf&#39;e zebrafish kontrol grubuna göre (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafish mesafe T./ - - 6 dpf&#39;e zebrafish kontrol grubuna göre mutant balık hareketleri (C) sayısı ve (D) miktarının belirlenmesi dmd PC2 izlediği mesafe. Hata çubukları, 3 suret deneyler için ortalama ± SEM temsil * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish at JoVE.com

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

using-touch-evoked-response-locomotion-assays-to-assess-muscle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.7K Görüntüleme.  Monash University. Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function. 

Video: Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

Zebra basımında Akut ve Kronik Hiperglisemi Modelleri: Hipergliseminin Nörogenez Üzerindeki Etkisini ve Radyoaktif Etiketli Moleküllerin Biyo Dağılımını Değerlendiren Bir Yöntem

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its embryonic transparency, genetic tractability, and amenity to rapid, high-throughput studies. However, the loss of transparency limits heart function analysis at the adult stage, which complicates modeling of age-related heart conditions. To overcome such limitations, high-frequency ultrasound echocardiography in zebrafish is emerging as a viable option. Here, we present a detailed protocol to assess cardiac function in adult zebrafish by non-invasive echocardiography using high-frequency ultrasound. The method allows visualization and analysis of zebrafish heart dimension and quantification of important functional parameters, including heart rate, stroke volume, cardiac output, and ejection fraction. In this method, the fish are anesthetized and kept underwater and can be recovered after the procedure. Although high-frequency ultrasound is an expensive technology, the same imaging platform can be used for different species (e.g., murine and zebrafish) by adapting different transducers. Zebrafish echocardiography is a robust method for cardiac phenotyping, useful in the validation and characterization of disease models, particularly late-onset diseases; drug screens; and studies of heart injury, recovery, and regenerative capacity.

We describe a protocol to assess heart morphology and function in adult zebrafish using high-frequency echocardiography. The method allows visualization of the heart and subsequent quantification of functional parameters, such as heart rate (HR), cardiac output (CO), fractional area change (FAC), ejection fraction (EF), and blood inflow and outflow velocities.

Zebrafish Kardiyak Fonksiyondeğerlendirmek için Yüksek Frekanslı Ultrason Ekokardiyografi

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Gelişmekte Olan Zebra Balıklarında Değiştirilmiş Kan Oluşumunu Tespit Etmek ve Nicel hale Getirmek için Akış Sitometrisini Kullanma

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...