Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

MNP Algılama 1. Yöntem Not: Bu bölüm altın nanoparçacıkların hibridizasyon aracılı büyüme dayalı MNP algılamak için yordam açıklanır. <ol><li> Prob DNA konsantrasyonu 100 uM olarak (5&#39;-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) çözeltisi hazırlayın. </li><li> Prob DNA modifiye AuNP (AuNP prob) parçacıkların hazırlanması. 21 Not: Burada kullanılan hacim prob DNA modifiye AuNP (AuNP prob) parçacıkların gereksinimi bağlıdır. Deneylerin sayısı, yapılacak üzerinde dolayısıyla bağlıdır. Biz genellikle yedek olarak aşırı AuNP prob parçacıkları hazırlamak. Bu adımların kullanılan hacim ayarlanabilir ve esnektir. <ol><li> Konsantrasyon 1 OD / ml altın nano partiküller içeren bir çözeltiye (13 nm, 17 nM) (100 uM, Aşama 1.1&#39;de elde edilmiş) prob DNA ekleyin. </li><li> Sodyum dodesil sülfat nihai konsantrasyonlar getirin (NAC 12 H 25 SO 4 SDS) ve fosfat tamponu (PBS),% 0.01 ve 0.01 M, respectivel içinY. </li><li> 20 dakika sonra, NaCl (2M) ve PBS (0.01 M),% 0.01 SDS muhafaza edilirken bir çözeltisi ile, 0.05 M sodyum klorür (NaCI) konsantrasyonunu getirmek ve 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 1 M üzerinde 20 dakika aralıklarla bir son konsantrasyona kadar 0.1 M artışlarla NaCI konsantrasyonunu artırır. </li><li> 23 ° C &#39;de, bir girdaplı karıştırıcı üzerinde çalkalayarak gece inkübe edin. sallayarak hızı sürece DNA örnekleri ve AuNP sondalar hibritlenmiş olmak gibi deney etkilemez. </li><li> 30 saniye boyunca 7.000 xg&#39;de altın nanopartiküller Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. </li></ol></li><li> 25 nM (AuNP prob çözeltisi) bir konsantrasyonda deiyonize suda (DI su) içine AuNP prob parçacıkları ekleyin. </li><li> Hedef DNA örnekleri hazırlama (: &#39;, üç temel-çift uyumsuz: 5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;; 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 tam olarak komplementer altı baz çiftli uyumsuz: 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;) konsantrasyonlarda0.06, 0.11, 0.17, sırasıyla, 0.20, 0.30, 0.50 uM. </li><li> NaCl (14 uM) ile birlikte DNA örnekleri (350 ul) içine AuNP prob çözeltisi (6 ml, 25 nM) eklenir. </li><li> DNA hibridizasyonu için 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de bir girdaplı karıştırıcı ile DNA örnekleri ve AuNP problarının Karışım çalkalanır. </li><li> AuNP büyümesi için, çözelti (DNA örnekleri ve AuNP prob karışımı) NH 2OH (6 ul, 400 mM) ve HAuCl 4 (6 ul, 25.4 mM) ilave edin. AuNP büyüme tamamlanması için yaklaşık 30 saniye sürer. renk sürekli değişim en fazla 1 saat korur. DİKKAT: HAuCl 4 ile Ciltle temas şiddetli toksik etkiler üretebilir. Kullanmadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. Eldiven giymek ve HAuCl 4 kullanırken duman dolap kullanın. </li></ol> Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu 2. Fabrikasyon Not: P: PDMS tabanlı damlacık manipülasyon platformu iki bileşenden oluşursüper hidrofobik yüzey ve bir hava kanal tabakası (5 mm) DMS membran (100 um). olan bir MEMS işlemi olmadan, yaygın işleme işlemleri imalatı için mikroakışkan bileşenlerin hızlı prototipleme için bir kalıbın PDMS döküm ve çoğaltma yapmak için bir bilgisayar sayısal kontrollü (CNC) mikroişleme içeren cihaz ve lazer mikro imal kullanılmıştır süper hidrofobik yüzey (bakınız Şekil 3). <ol><li> Mikroyapısında ile PMMA esaslı ana kalıpları (bakınız Şekil 3) üretmek için bir matkap ucu (0.5 mm) ile donatılmış CNC makinesini kullanın. matkap ucu 7 mm / sn bir besleme hızı ve dönme 26,000 rpm hızını kullanın. PMMA hurda kaldırmak ve ana kalıp yüzeyini temizlemek için bir hava üfleyici ve DI su kullanın. </li><li> PDMS taban ve oranı 10 içinde sertleştirici madde karışımı hazırlanması: 1 arasındadır. tüm hava kabarcıkları kaldırılır 30 dakika boyunca ya kadar desikatörde içinde karışım Degas. </li><li> th içine PDMS dökünE Ana kalıp ve hava odaları ters mikro-(PDMS membran) ve hava kanalı (PDMS tabakası) elde etmek üzere bir fırında 60 ° C sıcaklıkta 3 saat PDMS fırında. </li><li> (Elle) ana kalıp PDMS katmanı kaldırın. Hava emme ağızlığı için PDMS katman üzerinde delikler. </li><li> Oksijen plazma arıtma sistemi odasına PDMS membran, PDMS katman ve cam alt tabaka koyun. oksijen plazma muamelesinden sonra, 10 dakika süre ile bir ocak (90 ° C) bir araya PDMS membran PDMS tabakası ve cam substrat bağlanması. </li><li> lazer kesim makinesi (PDMS membran tarafı yukarı) içine kompozit çip koyun. süperhidrofobik alan (15 mm x 12 mm) tanımlamak için .dwg dosyasını içe aktarın. Bakınız Şekil 3. Doğrudan PDMS membran (güç 12 W, tarama hızı 106,68 mm / sn) üzerinde süperhidrofobik alan oluşturmak için bir CO 2 -lazer makinesi ile PDMS membran engrave. </li><li> yıkamak için DI su ile süperhidrofobik yüzeyini temizleyinyüzeyde uzak kömürleşmiş artıkları. </li><li> Bir selenoid vana aracılığıyla hava emme girişi ve vakum pompası bağlayın (Şekil 4). Bir dijital I / O USB modülü ile bilgisayar ve kontrol selenoid vana takın. </li></ol> Pnömatik Platformunda MNP Saptanması İçin 3. Operasyon Not: Bu bölüm pnömatik damlacık manipülasyon platformunda kolorimetrik ve hızla MNP tanımlamak için çalışmasını açıklar (bakınız Şekil 5). Tüm adımlar 23 ° C (ortam sıcaklığı) yeri ve bağıl nem% 85 alır. <ol><li> Pnömatik damlacık manipülasyon platformu süperhidrofobik alana (10 ul, 0.5 uM) hedef DNA örneği damlacık yerleştirin. </li><li> Pnömatik damlacık manipülasyon platformu süperhidrofobik alanda AuNP prob damlacık (10 ul, 25 nM) yerleştirin. </li><li> Bir selenoid vana ve bir si ile PDMS membran saptırma neden hava emiş kontrolmple programı (örneğin, Labview). damlacıkları birbiri ile çarpışır ve birleşme şekilde PDMS zar üzerinde (sırasıyla, hedef DNA ve AuNP problar ihtiva eden) damlacıklarının geçiş yolu boyunca her bir hava odası içinde hava emişi sağlar. -80 KPa (gösterge basıncı) vakum pompasının bir çalışma basıncı kullanın. <ol><li> Alternatif olarak, elle sürece damlacık tamamen karışık olarak hava emişi kontrol eder. elle bağlamak ya da test erken dönemlerinde tüplerle vakum pompası ve hava bölmesinin girişlerine ayırın. </li></ol></li><li> selenoid vana kontrol sistemi kullanılarak 3 dakika boyunca karıştırma verimliliği artırmak için ileri ve geri coalesced damlacık rulo hava emişi kontrol eder. hedef DNA ve AuNP probları iyice karıştırılır ve 3 dakika içinde melezleşmiştir olur. sırasıyla, itici frekans ve 5 Hz ve -80 kPa (gösterge basıncı) bir çalışma basıncını kullanın. </li><li> NH2 OH (2 ul, 400 mM) ve HAuCl ihtiva eden bir damlacık yerleştirinPnömatik damlacık manipülasyon platformun süperhidrofobik alanı 4 (2 ul, 25.4 mM). </li><li> damlacıkları birbirleriyle ve COALESCE çarpışır izin hava emişi (-80 kPa gösterge basıncı) kontrol eder. Sonra ileri ve geri coalesced damlacık rulo 1 dakika boyunca karıştırma verimliliği artırmak için izin hava emişi (5 Hz ve -80 kPa gösterge basıncı) kontrol eder. </li><li> Tedbir ve çıplak gözle coalesced damlacık rengini kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions:+current+and+developing+technologies.">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li><li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations.">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li><li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing.">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. , 408 (2010).</li><li>Whelan, S., Goldman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+frequency+of+events+that+cause+multiple-nucleotide+changes.">Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes.</a> Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).</li><li>Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+amplified+DNA+with+immobilized+sequence-specific+oligonucleotide+probes.">Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).</li><li>Kim, S., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+technologies+and+biomedical+applications.">SNP genotyping: technologies and biomedical applications.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).</li><li>Kwok, P. Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).</li><li>Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+colorimetric+detection+of+polynucleotides+based+on+the+distance-dependent+optical+properties+of+gold+nanoparticles.">Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles.</a> Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).</li><li>Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+Detection+of+Mercuric+Ion+(Hg2+)+in+Aqueous+Media+using+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles.">Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles.</a> Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).</li><li>Storhoff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle-based+detection+of+genomic+DNA+targets+on+microarrays+using+a+novel+optical+detection+system.">Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system.</a> Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).</li><li>Bao, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+identification+in+unamplified+human+genomic+DNA+with+gold+nanoparticle+probes.">SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).</li><li>Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single-nucleotide+polymorphisms+using+gold+nanoparticles+and+single-strand-specific+nucleases.">Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases.</a> Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).</li><li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles.">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li><li>Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+DNA+concentration+and+mismatches+using+hybridization-mediated+growth+of+gold+nanoparticle+probes.">Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes.</a> Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).</li><li>Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+control+of+metal+nanoparticle+shape:+one-pot+synthesis+and+cellular+uptake+of+highly+stable+and+functional+gold+nanoflowers.">DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers.</a> Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).</li><li>Chen, L., Manz, A., Day, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+nucleic+acid+analysis+integrated+on+microfluidic+devices.">Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).</li><li>Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+and+detection+of+single+nucleotide+polymorphism+genotyping+utilizing+an+integrated+magnetic+bead-based+microfluidic+platform.">Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform.</a> Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).</li><li>Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discrimination+of+single-nucleotide+mismatches+using+a+microfluidic+device+with+monolayered+beads.">Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads.</a> Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).</li><li>Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics.">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li><li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism.">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li><li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials.">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li><li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface.">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li><li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation.">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li><li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting.">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li><li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes.">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li><li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses.">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol, basit bir kolorimetrik yöntem MNP 0,11-0,50 uM arasında mikrosantrifüj tüpleri içinde değişen konsantrasyonlarda uygulanabilir tespit etmek. Ayrıca, önerilen MNP saptama yöntemi, DNA taraması ve diğer biyo-medikal uygulamalar için yüksek potansiyele sahip bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda yapılır. Uygulamada, DNA örneği konsantrasyonu tespit edilebilir niteliktedir çalışma platformları karıştırma verimliliğine bağlıdır. coalesced damlacık tamamen karışık olduğundan emin olmak için, bu protokolde kritik adım coalesced damlacık boyutuna bağlıdır hava emme (basınç ve frekans) kontrol edilmesidir. tam olarak komplementer örnek DNA ve uyumsuz örnek DNA arasındaki hibridizasyon afinitesi fark uzun DNA sekansı parçası için çıplak gözle ayırt etmek zordur. Bu algılama tekniği sınırlama dolayısıyla örnek DNA fragmanı uzunluğudur. Uzun DN ile numuneler içinBir sekanslar, boyutları ya da büyüme AuNP konformasyon çeşitli uyumsuzlukları içeren çeşitli DNA örnekleri benzerdir. prob DNA örneklerinin uyumsuzlukları Bu protokol orta segmentte görünür. aynı uzunluklarda ve örnek DNA homomerik uyumsuzlukları, uyuşmazlıkları konumu da AuNP hibridizasyon afinite ve büyüme boyutunu etkileyebilir. Pek çok hastalığın halen özellikle kusurlu genlerin kadar takip ediliyor. Belirli hastalıklar için genom veritabanları hala genişleyen ve gelişiyordu. spesifik DNA fragmanının DNA sekansı varyasyonu belirli bir hastalıktan sorumlu olduğu teyit edildikten sonra, (uygun bir uzunluk ve DNA uyumsuzluğu pozisyonu) özel olarak tasarlanmış prob örnek DNA yanlış eşleşme sayısı elde etmek için de kullanılabilir olarak tespit edilebilir bir konsantrasyon aralığında prob zaten bu çalışmada test edildi. Önerilen pnömatik damlacık manipülasyon platformu gerçekleştirmek olduğunuaçık bir ortamda ed. damlacıkların buharlaşması, DNA örneklerinin konsantrasyonunu artırır ve kolorimetrik bir okuma doğruluğunu etkiler. MNP analizinin doğruluğunu iyileştirmek için, kontrollü bir ortam sıcaklığı ve nem gereklidir. Lazer mikro sunulmaktadır platformda süperhidrofobik yüzey imal etmek için uygulanmıştır. PDMS membran superhydrophobicity damlacık manipülasyon (&gt; 20 kez) birçok yineleme altında kalıcı değil. superhydrophobicity kaybı bu damlacık manipülasyon platformu hareketlilik ve manevra kabiliyeti azalır. damlacık manipülasyon platformu (tekrar 2.6-2.8 adımlar) PDMS membran superhydrophobicity remodifying, yüzeyde superhydrophobicity kaybeder kez gereklidir. daha dayanıklı süperhidrofobik yüzeyinin basit fabrikasyon gelecek göz altında. Bu protokol, biz th kontrol etmek için (veri toplama ekipmanları ile) bir selenoid vana ve basit bir kontrol programını kullandıke hava emme. Hava emiş kontrolü başka yollarla veya ekipman dahil olmak, ancak bir solenoid valfın kullanımı sınırlı olmamak kullanılabilir. Bu yazıda, DNA tespiti basit bir kolorimetrik yöntem ve pnömatik damlacık manipülasyon platformunun kombinasyonu tanıtıldı. Her iki teknik benzersiz ve son derece muhtemel olan; Biz aynı sonuçları elde etmek (yani hızlı ve görsel hem) alternatif DNA algılama yöntemi buldum. Optowetting, 22 dielektroforez, 23 electrowetting, 24 titreşim 25 ve termos-kapiller çalıştırma 26 rapor edilmiştir dahil bir açık yüzey üzerinde birkaç damlacık manipülasyon teknikleri. Tüm bu damlacık manipülasyon teknikleri sakıncaları önceki çalışmalarında ele alındı. 20 önerilen pnömatik platformu yukarıda belirtilen yöntemlere göre daha biyouyumlu olduğunu. Bu teknik, o çok nükleotid polimorfizmlerinin tespit etmek içinna pnömatik damlacık manipülasyon platformu örnekleri ve reaktifler doğrudan yüklenir ve pipetler ile toplanabilir anlamına gelir biyokimyasal alanında, araştırmacılar için basittir. sunulan platformun entegrasyonu otomatik kontrol sistemi ve gelecekte gelişmiş ve geniş kullanım için bir kullanıcı arayüzü tasarımı ile yürütülmektedir.

Bir DNA sekansının bir tek baz çifti fark tek nükleotid polimorfizm (SNP), en yaygın genetik varyasyonları biridir. Mevcut çalışmalar SNP hastalık riski, ilaç etkinliği ve gen fonksiyonlarını etkileyerek bireylerin yan etkileri ile ilişkili olduğunu bildirmektedir. 1,2 Son çalışmalar da iki veya çok nokta mutasyonları (multi-nükleotid polimorfizmi) belirli hastalıklar ve bireysel neden olduğunu ortaya hastalığın etkileri farklılıklar. 3,4 nükleotid polimorfizm tespit hastalığı prescreening nedenle zorunludur. Diziye özgü oligonükleotid hızlı tespiti için basit ve etkili yöntemler son derece son yirmi yılda geliştirilmiştir. Vb prob immobilizasyon, floresan etiketleme, jel elektroforezi de dahil olmak üzere prosedürler genellikle DNA mutasyonları tespit dahil 1,5 Güncel yaklaşımlar, 6,7 ancak bu yöntemler genellikle masraflı, uzun analitik süreç gerektirirsive ekipman, iyi eğitimli teknisyenler ve numune ve reaktiflerin önemli tüketim. hacmi ve benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklerine yüzey alanının büyük bir oranı ile bir nanopartikül belirli biyolojik bir çok hassas ve ucuz bir algılama platformu olarak ideal bir malzemedir. Altın nanopartiküller (AuNP) yaygın oligonükleotid prob ile değiştirilecek dolayı büyük bir yetenek DNA tespiti için kullanılır. 8-10 SNP tespit teknikleri de AuNP kullanılarak geliştirilmiştir. 11-13 Bu çalışmada biz tespit etmek için yeni bir kolorimetrik yaklaşımını benimsemiştir çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile. 14, bu basit ve hızlı tarama yöntemi teorisine dayanmaktadır konjuge tek bağlı DNA (ssDNA) ya da çift-şeritli DNA (dsDNA) değişik uzunluklarda AuNP büyüme büyüklüğü ve şekli etkileyen AuNP (Şekil 1 e bakınız). 15, DNA Bu tespit yöntemireaktiflerin küçük tüketimi, küçük bir deney süresi (birkaç dakika) ve klinik tanı ve yerli tıbbi tarama için ileriye dönük uygulanabilir termal kontrolü olmadan basit bir prosedür vardır. DNA&#39;nın duyarlılık, algılama sınırı ve özgüllüğünü artırmak amacıyla deneysel protokolleri büyük ölçekli ekipman az parçalarını gerekli geleneksel deneysel protokollerin evrimleştiği, 16 o mikroakışkan sistemleri ve basitleştirilmiş DNA dizisini tespit etmek için birkaç mikroakışkan sistemleri geliştirilmiştir biyosensör. Mikroakışkan sistemleri DNA saptama yöntemleri de heterojen bir SNP tespit etmek tek okuma için, ancak, sinyal amplifikasyonu ve bir floresan okuyucu için, bir PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) gibi bir sonraki işlem aletleri makine gerektirir. 17,18 basit geliştirilmesi sonraki işlem olmadan platformu doğrudan çoklu nükleotid polimorfizmi sonuçlarını okumakyüksek ölçüde istenmektedir. Karşılaştırıldığında iyi kullanılan geleneksel, mikroakışkan kapalı sistemler, mikroakışkan cihazlar umut verici gibi net bir optik yol, örneğe erişmek için kolay bir yol, doğrudan çevre erişilebilirlik ve hiçbir kolaylıkla oluşturulan kavitasyon ya da ara yüzey tıkanıklığı gibi birçok avantaj sunar açık yüzey kanalı. 19 Daha önceki çalışma olan, bu platformun, damlacıklar aynı anda taşınan ve bir emme kuvveti kullanarak bir itici enerji müdahalesi olmaksızın manipüle edilebilir On açık yüzey damlacık manipülasyon (Şekil 2). 20 için basit bir pnömatik platformu tanıtıldı biyolojik ve kimyasal uygulamalarda büyük bir potansiyel. Bu pnömatik platformu, böylece AuNP problarının DNA hibridleşmesinden faydalanan aracılı büyüme kavramı kullanılarak kolorimetrik bir yaklaşım ile kombinasyon halinde MNT tespiti için DNA örneklerinin işleme yürütmek için kullanıldı. Bu çalışmada sunulan protokol açıklarAçık bir yüzey üzerinde pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmlerinin basit bir görsel algılama. Bu çalışma çok nükleotid polimorfizmi çıplak gözle saptanabilir olduğunu doğrular; Önerilen pnömatik platformu biyolojik ve kimyasal uygulamalar için uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:245px;">PDMS</td>
			<td style="width:204px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">benchtop engravers</td>
			<td style="width:204px;">&#160;Roland DG</td>
			<td style="width:119px;">EGX-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">laser cutting machine</td>
			<td style="width:204px;">Universal Laser Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VLS 3.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Oxygen plasma treatment system</td>
			<td style="width:204px;">Femto Science Inc. Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solenoid valve</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>home built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">vacuum pump</td>
			<td>ULVAC KIKO, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DA-30D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">13-nm AuNP solution</td>
			<td style="width:204px;">TAN Bead Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;">NG-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">DNA (with 5 -end labeled thiol)</td>
			<td style="width:204px;">MDBio, Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>UniRegion&#160;Bio-Tech,. Taiwan</td>
			<td>PBS001-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:204px;">J. T. baker</td>
			<td style="width:119px;">4095-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Hydroxylamine solution (NH2OH)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Chloroauric acid (HAuCl4)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:204px;">Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">centrifuge</td>
			<td style="width:204px;">Hermle Labortechnik GmbH.</td>
			<td style="width:119px;">Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem açık yüzeyi üzerinde bir pnömatik damlacık manipülasyon platformu üzerinde gerçekleştirilmiştir. kolorimetrik DNA tespiti için bu yaklaşım, altın nano parçacık probları (AuNP Probes) hibridizasyon aracılı büyüme dayanıyordu. AuNP büyüme boyutu ve düzenlemesi probları ile hibridize DNA numunelerinin sayısı hakimdir. Nanopartiküllerin spesifik büyüklük-ve biçime bağlıdır optik özelliklerine bağlı olarak, sondalar için örnek bir DNA fragmanı uyuşmazlıkları ayırt edilmesi mümkün olan. testleri, sırasıyla reaktifler ve DNA örnekleri ihtiva eden damlacıklar ile gerçekleştirilmiştir, ve esnek PDMS göre süperhidrofobik membran kontrol pnömatik emme ile taşınan ve pnömatik bir platform üzerinde karıştırıldı. Damlacıklar hiçbir yan eff ile son derece biyouyumlu olduğu önerilen pnömatik platformda açık yüzey üzerinde aynı anda ve tam teslim edilebilirdamlacıklar içindeki DNA örneklerinin vb. İki önerilen yöntemler birleştiren çoklu nükleotid polimorfizmi pnömatik damlacık manipülasyon platformunda bakışta tespit edilebilir; hiçbir ek cihaz gereklidir. sonuca platformda damlacıklar yükleme Prosedür mevcut yöntemlere göre çok daha az az 5 dakika alır. Ayrıca, bu kombine MNP bir tarama yaklaşımı, bir makro sistemin daha belirgin az Her işlem, sadece 10 ul numune hacmi gerekir.

Bu çalışmada, üç DNA örnekleri AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile tespit basit ve yeni bir yöntem kullanılarak test edildi. Prob DNA ve üç çeşit DNA örneklerinin dizileri, spesifik olarak, cDNA protokolün adım 1 &#39;de listelenmektedir, TMDNA (üç baz çiftli uyuşmaz DNA) ve SixMDNA (altı baz çiftli uyuşmaz DNA) (tam olarak komplementer DNA&#39;sını ölçmek amacıyla yapılan). burada test edilen DNA örneklerinin prob uyumsuzluklar DNA örnekleri orta segmentte hem de. 6 değişik konsantrasyonda DNA örnekleri için büyüme AuNP çözümleri renklerini göstermektedir. mükemmel şekilde uyumlu DNA (cDNA) için, çözümlerin tonlar DNA konsantrasyonu artan şeffaf sonra indigo pembe değişir ve. TMDNA için çözümler rengi koyu mor pembe gider ve daha sonra indigo ve SixMDNA için, renk DNA konsantrasyonu artan koyu pembe pembe gider. ayrı D<html> NA örnekleri AuNP değişik büyüme boyutu ve çözümleri çeşitli renk neden prob DNA çeşitli melezleme benzerlikleri sahiptirler. TMDNA örnek prob üç baz çifti mutasyonu olan, AuNP daha küçük bir büyüme boyutu neden cDNA numunesi, daha az melezleme yakınlığına sahiptir. Şekil 6, sonuçların da gösterdiği gibi, özellikle büyük bir DNA konsantrasyonda cDNA ve TMDNA örnekler arasında renk farklılıklar vardır. prob ile birçok uyumsuzlukları sayesinde SixMDNA Örnek da 0.2 uM daha büyük bir DNA konsantrasyonu, AuNP konjüge edilmiş bir kaç dsDNA sonuçlanan prob, zayıf bir hibritleşme bir afiniteye sahiptir. AuNP büyüme boyutu AuNP çözeltisi tabii ki çıplak gözle ölçülmez amaranth, pembeden değişmesine neden bu SixMDNA örneğinde bunun sonucu olarak küçüktür. renkli görüntüler, cDNA dayanarak, TMDNA ve SixMDNA 0.50 uM 0.11 bir DNA konsantrasyonu için kabaca farklılaşmış bulunmaktadır. &quot;Fo: keep-together.within sayfa =&quot; _content. Burada sunulan protokolleri ve yöntemleri ile 1 &quot;&gt;, açık yüzey Mikroakiskan için basit ve yeni damlacık tabanlı manipülasyon platformu oluşturmak için bir güç olarak pnömatik emme kullanma gösterildi PDMS membran damlacıkların kolay taşınması ve manipülasyon yüzey deformasyonu (Şekil 7A bakınız) damlalar halinde, bu durumda, biyo-numune, DNA kesintisiz olarak elde edilebilir. MNP yeni ve görsel saptama, bu ilgili gösterilmiştir pnömatik açık yüzeyi damlacık manipülasyon platformu. Şekil 7B&#39;de gösterildiği gibi, bir sonucu olarak, bir DNA yanlış eşleşme tespit çıplak gözle kolaylıkla gözlemlenebilir. orijinal durumda, AuNP prob damlacık kırmızı bir renk göstermiştir. maksimum optik absorpsiyon AuNP Probes yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile ilişkilendirilir 520 nm &#39;de. çeşitli DNA örneği damlacıklar, tam Cı sahip AuNP hedef prob DNA dupleksi ile hibridizasyon sonra ortaya çıkar<html> artmış AuNP SPR özelliği kayboldu omplementary DNA (cDNA) örnek damlacık şeffaf hale geldi. Buna karşılık, AuNP üç baz çifti uyumsuz DNA (TMDNA) ve uyuşmaz DNA (SixMDNA) sırasıyla mavi ve mor altı baz çifti ile melezleşmiştir. Bu yaklaşımla, DNA tespiti önerilen platformu ve yöntem, birleştirilmiş ve bir basit bir şekilde elde etti. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig1.jpg" /> AuNP tiol ile modifiye edilmiş ssDNA hibridizasyondan MNP. Tiol ile modifiye edilmiş, tek bağlı DNA (ssDNA) ya da çift-şeritli DNA (dsDNA) kolorimetrik tespiti Şekil 1. prensibi, AuNP büyüme boyutu ve şekli etkilenir ve AuNP yol açmışlardır çeşitli optik özellikleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig2.jpg" /> Pnömatik damlacık manipülasyon platformu Şekil 2. şematik diyagramı. Esnek PDMS tabanlı süperhidrofobik membranın bir saptırma neden bir güç olarak pnömatik emme ile zar üzerinde damlacık böylece aktif hale gelir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig2large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54424/54424fig3.jpg" /> Şekil pnömatik damlacık manipülasyon platformu 3. Fabrikasyon. Fabrikasyon bilgisayar sayısal kontrol (CNC) mikroişleme, PDMS döküm veya çoğaltma teknikleri ve lazer mikroişleme dahil. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig3large.jpg" target="_blank">Bir larg görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın er sürümü. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54424/54424fig4.jpg" /> Pnömatik damlacık manipülasyon platformu Şekil 4. Deneysel kurulum. Vakum pompası, hava odasında bir azalma basınç sağlamak ve damlacık manipülasyon için PDMS membran saptırma neden bir hava emiş oluşturdu. Vakum pompası ve selenoid vana ile bağlı hava kanalının giriş. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54424/54424fig5.jpg" /> Bu MNP algılama tekniği çalışması Şekil 5. şematik gösterimi. Hedef DNA içeren damlacıklar ve AuNP sondaları platformda yüklenir, karışık ve hybridized. NH2 OH ve HAuCl 4 hem de içeren damlacık platformu yüklenmiş ve AuNP büyüme için karıştırılır. Son olarak, AuNP hedef-prob DNA dubleks maksimum soğurma değiştirdi ve renk. Değişmiş <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54424/54424fig6.jpg" /> Şekil konsantrasyonu ile çeşitli DNA numunelerinin renk 6. değişimi. Tam Tamamlayıcı DNA (cDNA), çözeltiler tonları DNA konsantrasyonu artan indigo pembe arasında değişmektedir. TMDNA için çözümler rengi koyu mor pembe gider ve SixMDNA için, renk DNA konsantrasyonu artan koyu pembe pembe gider. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig6large.jpg" target="_blank">Bir LAR görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın ger sürümü. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54424/54424fig7.jpg" /> Şekil pnömatik bir platform. A damlacık 7. Images) hava emme. B kontrol) önerdiği pnömatik damlacık manipülasyon platformunda AuNP karşılık gelen hedef prob DNA çift yönlü Görüntüler pnömatik platformda damlacık taşıma seri görüntüler. Sürüş frekansı ve çalışma basıncının çalışma koşulları, sırasıyla 5 Hz ve -80 kPa (ölçüm basıncı) idi. Orijinal durumda, AuNP prob damlacık kırmızı bir renk sergiler. CDNA&#39;ya mevcudiyetinde AuNP hedef prob DNA çift yönlü şeffaftı. TMDNA ve SixMDNA ile melezleşmiştir AuNP sondalar, mavi ve mor sırasıyla idi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. &lt;</a>/ A&gt;

Watch this Scientific Journal Video about The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform at JoVE.com

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir.

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.5K Görüntüleme.  National Taiwan University.  Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir. 

Video: The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively and efficiently. Moreover, given the infrequency of these experiments it is imperative that their impacts be maximized. The rapid advancement of omics technologies offers an opportunity to dramatically increase the volume of data produced from precious spaceflight specimens. To capitalize on this, NASA has developed the GeneLab platform to provide unrestricted access to spaceflight omics data and encourage its widespread analysis. Rodents (both rats and mice) are common model organisms used by scientists to investigate space-related biological impacts. The enclosure that house rodents during spaceflight are called Rodent Habitats (formerly Animal Enclosure Modules), and are substantially different from standard vivarium cages in their dimensions, air flow, and access to water and food. In addition, due to environmental and atmospheric conditions on the International Space Station (ISS), animals are exposed to a higher CO2 concentration. We recently reported that mice in the Rodent Habitats experience large changes in their transcriptome irrespective of whether animals were on the ground or in space. Furthermore, these changes were consistent with a hypoxic response, potentially driven by higher CO2 concentrations. Here we describe how a typical rodent experiment is performed in space, how omics data from these experiments can be accessed through the GeneLab platform, and how to identify key factors in this data. Using this process, any individual can make critical discoveries that could change the design of future space missions and activities.

The NASA GeneLab platform provides unfettered access to precious omics data from biological spaceflight experiments. We describe how a typical mouse experiment is conducted in space and how data from such experiments can be accessed and analyzed.

Fare açık erişim NASA GeneLab platformu kullanarak fizyolojisi üzerinde uzay uçuşu etkileri keşfetmek

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...