Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

1. metodo per rilevare MNP Nota: Questa sezione descrive la procedura per rilevare la MNP basata sulla crescita ibridazione mediata di nanoparticelle d&#39;oro. <ol><li> Preparare il DNA probe (5&#39;--GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 tiolo &#39;) soluzione ad una concentrazione di 100 pM. </li><li> Preparare il particelle AUNP sonda di DNA modificato (sonda AUNP). 21 Nota: Il volume usato qui dipende dal requisito della AUNP sonda di DNA modificato (sonda AUNP) particelle. E &#39;quindi dipende da condurre il numero di esperimenti. Noi di solito preparare particelle sonda AUNP in eccesso come pezzi di ricambio. Il volume utilizzato in questi passaggi è regolabile e flessibile. <ol><li> Aggiungere DNA sonda (100 mM, preparati nel passo 1.1) Ad una soluzione di nanoparticelle di oro (13 nm, 17 nM) alla concentrazione 1 OD / ml. </li><li> Portare le concentrazioni finali di dodecil solfato di sodio (NaC 12 H 25 SO 4, SDS) e tampone fosfato (PBS) a 0,01% e 0,01 M, respectively. </li><li> Dopo 20 min, portare la concentrazione di cloruro di sodio (NaCl) e 0,05 M con una soluzione di NaCl (2 M) e PBS (0,01 M) mantenendo SDS a 0.01% e incubare per 20 min. </li><li> Aumentare la concentrazione di NaCl in incrementi di 0,1 M ad una concentrazione finale di 1 M oltre 20 intervalli min. </li><li> Incubare per una notte con agitazione su un vortex a 23 ° C. La velocità di agitazione non influisce l&#39;esperimento finché i campioni di DNA e sonde AUNP diventano ibrida. </li><li> Centrifugare le nanoparticelle di oro a 7.000 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Aggiungere particelle sonda AUNP in acqua deionizzata (DI acqua) ad una concentrazione di 25 nM (soluzione della sonda AUNP). </li><li> Preparare campioni di DNA bersaglio (pienamente complementari: 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 &#39;, tre paia di basi non corrispondenti: 5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;, sei paia di basi non corrispondenti: 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;) a concentrazionidi 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 mM, rispettivamente. </li><li> Aggiungere la soluzione della sonda AUNP (6 ml, 25 Nm) nei campioni di DNA (350 microlitri) con NaCl (14 micron). </li><li> Agitare la miscela di campioni di DNA e sonde AUNP con un vortex a 23 ° C per 5 minuti per l&#39;ibridazione DNA. </li><li> Per la crescita AUNP, aggiungere NH 2 OH (6 ml, 400 mM) e HAuCl4 (6 ml, 25,4 mM) alla soluzione (la miscela di campioni di DNA e sonde AUNP). La crescita di AUNP dura circa 30 secondi per il completamento. Il cambiamento costante di colorazione mantiene più di 1 ora. ATTENZIONE: Il contatto cutaneo con HAuCl4 potrebbe produrre effetti tossici gravi. Si prega di consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) prima dell&#39;uso. Si prega di indossare guanti e utilizzare una cappa quando si utilizza HAuCl4. </li></ol> 2. Realizzazione di una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet Nota: La piattaforma di manipolazione delle gocce PDMS basata costituito da due componenti: un PDMS membrana (100 micron), con una superficie super-idrofobica e uno strato d&#39;aria canali (5 mm). Senza un processo MEMS, i processi di lavorazione comuni sono stati utilizzati per fabbricare tale dispositivo, che comprende il controllo computerizzato numerico (CNC) microlavorazione per realizzare uno stampo PDMS colata e replicazione per la prototipazione rapida dei componenti microfluidica, e microlavorazione laser per la fabbricazione di una superficie super-idrofobica (vedi Figura 3). <ol><li> Utilizzare la macchina CNC dotato di una punta (0,5 mm) per produrre stampi di master PMMA-base (vedi Figura 3) con microstrutture. Utilizzare una velocità di avanzamento della punta 7 mm / sec ed una velocità di rotazione di 26.000 rpm. Utilizzare un ventilatore di aria e acqua deionizzata per rimuovere il rottame PMMA e per pulire la superficie degli stampi di master. </li><li> Preparare una miscela di base PDMS e il vulcanizzante in rapporto 10: 1. Degassare la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse. </li><li> Versare il PDMS in the stampo master e cuocere il PDMS per 3 ore a 60 ° C in forno per ottenere le microstrutture inverse delle camere d&#39;aria (membrana PDMS) e canali dell&#39;aria (strato PDMS). </li><li> Rimuovere lo strato PDMS dallo stampo master (a mano). Perforare sullo strato PDMS per prese d&#39;aria di aspirazione. </li><li> Mettere la membrana PDMS, lo strato PDMS e il substrato di vetro nella camera del sistema di trattamento ossigeno plasma. Dopo trattamento con ossigeno-plasma, legare la membrana PDMS, lo strato PDMS e il substrato di vetro insieme su una piastra (90 ° C) per 10 min. </li><li> Mettere il chip composito nella macchina taglio laser (PDMS lato della membrana verso l&#39;alto). Importare il file .dwg per definire l&#39;area superhydrophobic (15 mm x 12 mm). Vedere Figura 3. Direttamente incidere la membrana PDMS con una macchina -LASER CO 2 per creare l&#39;area superhydrophobic sulla membrana PDMS (potenza 12 W, velocità di scansione 106,68 millimetri / sec). </li><li> Pulire la superficie superhydrophobic con acqua deionizzata per lavarevia i residui carbonizzati sulla superficie. </li><li> Collegare l&#39;ingresso aria di aspirazione e la pompa del vuoto attraverso una valvola a solenoide (vedere Figura 4). Collegare l&#39;elettrovalvola al computer e controllo con un modulo USB I / O digitale. </li></ol> 3. Il funzionamento per il rilevamento di MNP sulla piattaforma pneumatica Nota: Questa sezione descrive il funzionamento di identificare colorimetrica e rapidamente la MNP sulla piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico (vedi Figura 5). Tutte le operazioni avvengono a 23 ° C (temperatura ambiente) e umidità relativa del 85%. <ol><li> Mettere il campione di gocce DNA bersaglio (10 ml, 0,5 micron) sulla zona superhydrophobic della piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico. </li><li> Posizionare la sonda gocciolina AUNP (10 ml, 25 Nm) sull&#39;area superhydrophobic della piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico. </li><li> Controllare l&#39;aspirazione dell&#39;aria per provocare la deflessione della membrana PDMS di una elettrovalvola e siprogramma mple (ad esempio, Labview). Fornire aspirazione dell&#39;aria in ogni camera d&#39;aria lungo il percorso di migrazione delle goccioline (contenenti rispettivamente DNA bersaglio e sonde AUNP) sulla membrana PDMS tale che le goccioline si scontrano con l&#39;altro e si fondono. Utilizzare una pressione di esercizio della pompa da vuoto di -80 kPa (pressione manometrica). <ol><li> In alternativa, controllare l&#39;aspirazione dell&#39;aria manualmente finché la goccia è completamente miscelato. A mano, collegare o scollegare la pompa del vuoto e insenature della camera d&#39;aria con tubi nelle prime fasi di testing. </li></ol></li><li> Controllare l&#39;aspirazione dell&#39;aria a rotolare la goccia coalescente avanti e indietro per migliorare l&#39;efficienza di miscelazione per 3 min usando il sistema di controllo della valvola solenoide. Il DNA bersaglio e sonde AUNP diventano ben miscelati e ibridato nel raggio di 3 min. Utilizzare una frequenza di guida e una pressione di esercizio di 5 Hz e -80 kPa (pressione relativa), rispettivamente. </li><li> Mettere una goccia contenente NH 2 OH (2 ml, 400 mm) e HAuCl4 (2 microlitri, 25,4 mM) nell&#39;area superhydrophobic della piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica. </li><li> Controllare l&#39;aspirazione dell&#39;aria (-80 kPa pressione manometrica) per permettere le goccioline si scontrano con l&#39;altro e si fondono. Poi controllare l&#39;aspirazione dell&#39;aria (5 Hz e -80 manometro kPa) per lasciare che il rotolo delle gocce coalizzato avanti e indietro per migliorare l&#39;efficienza di miscelazione per 1 min. </li><li> Misurare e registrare il colore della goccia coalescente ad occhio nudo. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

In questo protocollo, un semplice metodo colorimetrico per rilevare MNP può essere implementato a concentrazioni comprese tra 0.11-0.50 micron di provette da microcentrifuga. Inoltre, il metodo di rilevamento MNP proposto è condotta su una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico che ha un elevato potenziale per lo screening del DNA e altre applicazioni biomediche. In pratica, l&#39;intervallo rilevabile della concentrazione di DNA campione dipende l&#39;efficienza di miscelazione delle piattaforme operative. Per garantire che la gocciolina coalescente è completamente miscelato, il passaggio fondamentale in questo protocollo è il controllo dell&#39;aspirazione dell&#39;aria (pressione e frequenza) che dipende dalla dimensione della goccia coalescente. La discrepanza di ibridazione affinità tra il DNA del campione pienamente complementare e il DNA del campione non corrispondenti è difficile distinguere a occhio nudo per un frammento di lunga sequenza di DNA. La limitazione di questa tecnica di rilevamento è quindi la lunghezza del frammento di DNA campione. Per i campioni con lunga DNA sequenze, le dimensioni o conformazione della AUNP crescita sono simili a quelle di campioni di DNA varie contenenti vari disallineamenti. I disallineamenti di campioni di DNA per la sonda appaiono nel segmento centrale in questo protocollo. Con lunghezze identici e disallineamenti omomerici di DNA del campione, la posizione dei disallineamenti potrebbe anche influenzare la dimensione ibridazione affinità e la crescita di AUNP. Molte malattie sono attualmente riconducibili a particolari geni difettosi. Le banche dati del genoma per particolari malattie sono ancora in espansione e miglioramento. Una volta che la variazione di sequenza del DNA del frammento specifico DNA è confermato di essere responsabile di una specifica malattia, la sonda specificamente progettato (con una lunghezza appropriata e la posizione disadattamento del DNA) può essere usata per acquisire il numero dei disallineamenti di DNA campione nella sonda compresa nell&#39;intervallo di concentrazione rilevabile sulla base già testato in questo lavoro. La piattaforma di manipolazione delle gocce pneumatico proposto è eseguirecato in un ambiente aperto. L&#39;evaporazione delle goccioline aumenta la concentrazione di campioni di DNA e influenza la precisione della lettura colorimetrica. Per migliorare la precisione dell&#39;analisi MNP, sono tenuti a temperatura ambiente ed umidità controllate. micromachining laser è stato applicato per fabbricare una superficie superhydrophobic nella piattaforma presentata. Il superhydrophobicity della membrana PDMS non persiste in molte iterazioni del manipolazione gocciolina (&gt; 20 volte). La perdita di superhydrophobicity diminuisce la mobilità e la manovrabilità di questa piattaforma manipolazione delle gocce. Una volta che la piattaforma di manipolazione gocciolina perde superhydrophobicity sulla superficie, remodifying la superhydrophobicity della membrana PDMS (ripetere i passaggi 2,6-2,8) è obbligatorio. La semplice fabbricazione di una superficie superhydrophobic più resistente è in fase di considerazione in futuro. In questo protocollo, abbiamo utilizzato una valvola a solenoide e un semplice programma di controllo (con attrezzature di acquisizione dati) per controllare °aspirazione dell&#39;aria e. Il controllo di aspirazione dell&#39;aria può essere utilizzato in altri modi e con apparecchi incluso ma non limitato all&#39;uso di una elettrovalvola. In questo manoscritto, abbiamo introdotto la combinazione di un semplice metodo colorimetrico di rilevamento del DNA e una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica. Entrambe le tecniche sono uniche e altamente prospettico; abbiamo trovato alcun metodo di rilevazione DNA alternativo (cioè sia rapida e visive) per ottenere gli stessi risultati. Diverse tecniche di manipolazione delle gocce su una superficie aperta tra cui optowetting, 22 dielettroforesi, 23 elettrowetting, 24 vibrazioni 25 e sono stati segnalati thermos-capillare attuazione 26. Gli svantaggi di tutte queste tecniche di manipolazione delle gocce sono state discusse nel nostro lavoro precedente. 20 La piattaforma pneumatica proposto è più biocompatibile rispetto ai metodi di cui sopra. Questa tecnica per rilevare polimorfismi multi-nucleotide ona piattaforma pneumatica manipolazione delle gocce è semplice per i ricercatori nel campo biochimico, il che significa che i campioni ei reagenti possono essere caricati direttamente e raccolte con pipette. L&#39;integrazione della piattaforma presentata viene effettuato con un sistema di controllo automatico e un disegno di un&#39;interfaccia utente per uso migliorata e ampia in futuro.

Polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), che è un singolo differenza base-pair in una sequenza di DNA, è una delle varianti genetiche più comuni. Gli studi attuali riportano che SNP sono associati con il rischio di malattia, efficacia dei farmaci e gli effetti collaterali di individui che alterano la funzione del gene. 1,2 Recenti studi hanno anche rivelato che le mutazioni a due o multi-punto (multi-nucleotide polimorfismo) causano malattie particolari e individuali differenze negli effetti della malattia. 3,4 Il rilevamento di nucleotide polimorfismo è quindi indispensabile in preselezione malattia. Metodi semplici ed efficienti per la rapida individuazione di oligonucleotidi sequenza-specifici sono stati molto sviluppati negli ultimi due decenni. 1,5 approcci in corso per individuare mutazioni del DNA tipicamente coinvolgono procedure, tra cui la sonda immobilizzazione, l&#39;etichettatura di fluorescenza, elettroforesi su gel, ecc, 6,7 ma questi metodi richiedono generalmente un lungo processo analitico, expenattrezzature sive, i tecnici ben addestrati, e il consumo significativo di campioni e reagenti. Una nanoparticella con un elevato rapporto tra superficie e volume e uniche proprietà fisico è un materiale ideale come piattaforma di rilevazione altamente sensibile e conveniente per la biomarker specifici. Nanoparticelle d&#39;oro (AUNP) sono ampiamente utilizzati per la rilevazione del DNA a causa della loro grande capacità di essere modificato con sonde oligonucleotidiche. 8-10 tecniche di rilevamento SNP sono stati sviluppati utilizzando AUNP. 11-13 In questo lavoro abbiamo adottato un approccio colorimetrico romanzo per rilevare la multi-nucleotide polimorfismo (MNP) attraverso il DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP. 14 Questo metodo di sondaggio semplice e rapida si basa sulla teoria che varie lunghezze di DNA a singolo filamento (ssDNA) o DNA a doppia elica (dsDNA) coniugata AUNP influenzare la dimensione di crescita e la forma del AUNP (vedi Figura 1). 15 Questo metodo di rilevazione del DNApresenta un piccolo consumo di reagenti, una piccola durata dosaggio (pochi minuti), e una semplice procedura senza controllo termico che prospetticamente applicabile per la diagnosi clinica e screening medico domestico. Diversi sistemi microfluidici per rilevare la sequenza di DNA sono stati sviluppati; 16 tali sistemi microfluidici, evoluto da protocolli sperimentali tradizionali, richiesto meno pezzi di grandi attrezzature e semplificato protocolli sperimentali in modo da migliorare la sensibilità, limite di rilevamento e la specificità del DNA biosensore. Metodi di rilevamento DNA nei sistemi microfluidici ancora richiedono, tuttavia, strumenti di un processo successivo come una PCR (polymerase chain reaction) Macchina per l&#39;amplificazione del segnale e un lettore di fluorescenza per una singola lettura per identificare il eterogenea SNP. 17,18 Sviluppare un semplice piattaforma senza il successivo trattamento di leggere direttamente i risultati di multi-nucleotide polimorfismoè altamente desiderabile. Rispetto alla ben utilizzato, convenzionale, chiuso sistemi microfluidici, aperta superficie dispositivi microfluidici offrono promettente diversi vantaggi, quali un chiaro percorso ottico, un modo semplice per accedere all&#39;esempio, una accessibilità ambientale diretto e cavitazione non formano facilmente o ostruzione interfacciale in il canale. 19 il nostro lavoro precedente introdotto una piattaforma pneumatica semplice manipolazione open-superficie gocciolina (vedere Figura 2). 20 Su questa piattaforma, goccioline possono essere simultaneamente trasportati e manipolati senza interferenze da un&#39;energia guida utilizzando una forza di aspirazione, che ha un grande potenziale in applicazioni chimiche e biologiche. Questa piattaforma pneumatico è stato quindi utilizzato per eseguire la manipolazione dei campioni di DNA per il rilevamento MNP in combinazione con il metodo colorimetrico utilizzando il concetto di DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP. Il protocollo presentato in questo documento descriveun semplice riconoscimento visivo delle polimorfismi multi-nucleotide sulla piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico su una superficie aperta. Questo lavoro conferma che il multi-nucleotide polimorfismo è rilevabile ad occhio nudo; la piattaforma pneumatica proposto è adatto per applicazioni chimiche e biologiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:245px;">PDMS</td>
			<td style="width:204px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">benchtop engravers</td>
			<td style="width:204px;">&#160;Roland DG</td>
			<td style="width:119px;">EGX-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">laser cutting machine</td>
			<td style="width:204px;">Universal Laser Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VLS 3.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Oxygen plasma treatment system</td>
			<td style="width:204px;">Femto Science Inc. Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solenoid valve</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>home built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">vacuum pump</td>
			<td>ULVAC KIKO, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DA-30D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">13-nm AuNP solution</td>
			<td style="width:204px;">TAN Bead Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;">NG-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">DNA (with 5 -end labeled thiol)</td>
			<td style="width:204px;">MDBio, Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>UniRegion&#160;Bio-Tech,. Taiwan</td>
			<td>PBS001-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:204px;">J. T. baker</td>
			<td style="width:119px;">4095-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Hydroxylamine solution (NH2OH)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Chloroauric acid (HAuCl4)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:204px;">Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">centrifuge</td>
			<td style="width:204px;">Hermle Labortechnik GmbH.</td>
			<td style="width:119px;">Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

Un metodo semplice e visivo per rilevare multi-nucleotide polimorfismo (MNP) è stata eseguita su una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico su una superficie aperta. Questo approccio alla rilevazione DNA colorimetrica è stata basata sulla crescita ibridazione mediata sonde nanoparticelle di oro (sonde AUNP). La dimensione di crescita e la configurazione del AUNP sono dominate dal numero di campioni di DNA ibridato con sonde. Sulla base delle specifiche proprietà ottiche Grandezza- e dipendente dalla forma delle nanoparticelle, il numero dei disallineamenti in un frammento di DNA campione sonde è in grado di essere discriminati. Le prove sono state condotte tramite goccioline contenenti i reagenti ei campioni di DNA, rispettivamente, e sono stati trasportati e mescolati sulla piattaforma pneumatico con l&#39;aspirazione pneumatica controllata della membrana superhydrophobic flessibili PDMS-based. Goccioline possono essere erogati contemporaneamente e precisamente su una superficie aperta sulla piattaforma pneumatica proposto che è altamente biocompatibile senza eff latoect di campioni di DNA all&#39;interno delle goccioline. Combinando i due metodi proposti, polimorfismo multi-nucleotide può essere rilevato a vista sulla piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica; è richiesto alcuno strumento aggiuntivo. La procedura di installare le goccioline sulla piattaforma al risultato finale richiede meno di 5 minuti, molto meno rispetto ai metodi esistenti. Inoltre, questo approccio combinato rilevamento MNP richiede un volume del campione di soli 10 microlitri in ogni operazione, che è notevolmente inferiore a quello di un sistema macro.

In questo lavoro, tre campioni di DNA sono stati testati utilizzando un metodo semplice e romanzo rilevamento attraverso il DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP. Le sequenze di DNA sonda e campioni di DNA di tre tipi, in particolare, CDNA (pienamente complementare alla sonda di DNA), TMDNA (tre paia di basi del DNA non corrispondenti), e SixMDNA (sei paia di basi del DNA non corrispondenti) sono elencati nel protocollo fase 1. i disallineamenti per la sonda dei campioni di DNA testati qui sono sia nei segmenti centrali dei campioni di DNA. la Figura 6 mostra i colori delle soluzioni crescita AUNP per i campioni di DNA a concentrazione varia. Per il DNA perfettamente abbinato (cDNA), le tonalità di soluzioni variano dal rosa al indaco e poi a trasparente con l&#39;aumentare della concentrazione del DNA. Per TMDNA, il colore di soluzioni va dal rosa al viola scuro e poi Indigo, e SixMDNA, il colore va dal rosa al rosa scuro all&#39;aumentare della concentrazione di DNA. La parte D<html> campioni NA possiedono varie affinità di ibridazione al DNA della sonda che ha causato varie dimensioni di crescita del AUNP e colore variegato di soluzioni. Il campione TMDNA, con tre paia di basi mutazione dalla sonda, ha meno affinità ibridazione del campione di cDNA, che ha causato una dimensione di crescita più piccola del AUNP. Come dimostrano i risultati in figura 6 mostra, ci sono distinzioni di colore tra il cDNA e campioni TMDNA, soprattutto a una grande concentrazione di DNA. Attraverso molti disallineamenti con la sonda, campione SixMDNA presenta una debole affinità ibridazione della sonda, che ha portato in pochi dsDNA coniugato AUNP, anche con la concentrazione di DNA maggiore di 0,2 mM. La dimensione crescita AUNP è pertanto piccola in questo esempio SixMDNA, causando la soluzione AUNP per passare dal rosa al amaranto, che ovviamente non è misurata con un occhio nudo. Sulla base delle immagini a colori, il cDNA, TMDNA e SixMDNA sono approssimativamente differenziato per una concentrazione di DNA da 0.11 al 0.50 mM. _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Con i protocolli e metodi qui presentati, è stata dimostrata una piattaforma di manipolazione delle gocce a base di semplice e innovativo per microfluidica open-superficie con l&#39;aspirazione pneumatica come una forza per generare il. superficiale deformazione della membrana PDMS, il trasporto facile e manipolazione delle goccioline può essere raggiunto senza interruzione della bio-campione di DNA in questo caso, nelle goccioline (vedere Figura 7A). la nuova e visivo rilevamento di MNP è dimostrata su questo pneumatica piattaforma manipolazione gocciolina aperta superficie. come risultato, come mostrato in Figura 7B, la rilevazione di una mancata corrispondenza DNA è facilmente osservabile ad occhio nudo. Nello stato originale, la sonda gocciolina AUNP esposto un colore rosso. l&#39;assorbimento ottica massima di sonde AUNP si verifica a 520 nm, che viene attribuito ad una risonanza plasmonica di superficie (SPR). Dopo l&#39;ibridazione con le varie gocce campione di DNA, il target-sonda di DNA duplex di AUNP con una completamente c<html> omplementary DNA (cDNA) campione di gocce divenne trasparente come la caratteristica SPR della maggiore AUNP scomparso. Al contrario, AUNP ibridato con i tre paia di basi di DNA non corrispondenti (TMDNA) e sei paia di basi di DNA non corrispondenti (SixMDNA) erano, rispettivamente, blu e viola. Con questo approccio, la piattaforma proposta e metodo di rilevazione DNA sono combinati e realizzati in modo semplice. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig1.jpg" /> Figura 1. Principio di rilevazione colorimetrica di MNP. Il DNA a singolo filamento tiolo-modificato (ssDNA) o DNA a doppia elica (dsDNA) dalla ibridazione del ssDNA tiolo-modifica AUNP ha influenzato la dimensione di crescita e la forma del AUNP, e causato diverse proprietà ottiche del AUNP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;Fo: together.within-page keep-=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig2.jpg" /> Figura 2. Schema della piattaforma di manipolazione delle gocce pneumatico. Con un pneumatico di aspirazione come una forza per provocare una deflessione della membrana superhydrophobic flessibili PDMS-based, la goccia sulla membrana viene quindi attivato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig3.jpg" /> Figura 3. Realizzazione di una piattaforma di manipolazione delle gocce pneumatica. La fabbricazione incluso computer a controllo numerico (CNC) micromachining, di fusione o di replica tecniche di PDMS, e microlavorazione laser. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un larg</a>versione er di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig4.jpg" /> Figura 4. Apparato sperimentale della piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica. La pompa del vuoto generato un aspiratore per fornire una diminuita pressione nella camera d&#39;aria e provocare la deflessione della membrana PDMS per la manipolazione gocciolina. La pompa del vuoto e l&#39;ingresso del canale dell&#39;aria sono collegati attraverso la valvola a solenoide. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig5.jpg" /> Figura 5. Rappresentazione schematica del funzionamento di questa tecnica di rilevamento MNP. Le goccioline contenenti DNA bersaglio e le sonde AUNP vengono caricati sulla piattaforma, misto e hybridized. La goccia contenente sia NH 2 OH e HAuCl4 viene caricato sulla piattaforma e miscelato per la crescita AUNP. Infine, l&#39;obiettivo-sonda di DNA duplex di AUNP spostato il massimo assorbimento e alterato il colore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig6.jpg" /> Figura 6. Variazione di colore di vari campioni di DNA con la concentrazione. Per il DNA completamente complementare (cDNA), le tonalità di soluzioni variano dal rosa al indaco con l&#39;aumento della concentrazione del DNA. Per TMDNA, il colore di soluzioni va dal rosa al viola scuro, e per SixMDNA, il colore va dal rosa al rosa scuro con l&#39;aumento della concentrazione del DNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un lar</a>Versione ger di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig7.jpg" /> Figura 7. Immagini della gocciolina sulla pneumatica piattaforma. A) le immagini seriali di trasporto gocciolina sulla piattaforma pneumatico con il controllo aereo di aspirazione. B) del corrispondente target-sonda di DNA duplex di AUNP sulla piattaforma manipolazione delle gocce pneumatico proposto. Le condizioni di funzionamento della frequenza di pilotaggio e la pressione di lavoro erano 5 Hz e -80 kPa (pressione relativa), rispettivamente. Nello stato iniziale, la sonda gocciolina AUNP presenta un colore rosso. Il target-sonda di DNA duplex di AUNP in presenza del cDNA era trasparente. Le sonde AUNP ibridata con il TMDNA e SixMDNA erano blu e viola, rispettivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. &lt;</a>/ A&gt;

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Questo lavoro presenta un metodo semplice e visivo per rilevare polimorfismi multi-nucleotide su una piattaforma di manipolazione gocciolina pneumatica. Con il metodo proposto, l&#39;intero esperimento, compresi manipolazione gocciolina e la rilevazione dei polimorfismi multi-nucleotidi, può essere eseguita vicino a 23 ° C senza l&#39;ausilio di strumenti avanzati.

Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.5K Views.  National Taiwan University.  Questo lavoro presenta un metodo semplice e visivo per rilevare polimorfismi multi-nucleotide su una piattaforma di manipolazione gocciolina pneumatica. Con il metodo proposto, l'intero esperimento, compresi manipolazione gocciolina e la rilevazione dei polimorfismi multi-nucleotidi, può essere eseguita vicino a 23 ° C senza l'ausilio di strumenti avanzati. 

Video: The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

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Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively and efficiently. Moreover, given the infrequency of these experiments it is imperative that their impacts be maximized. The rapid advancement of omics technologies offers an opportunity to dramatically increase the volume of data produced from precious spaceflight specimens. To capitalize on this, NASA has developed the GeneLab platform to provide unrestricted access to spaceflight omics data and encourage its widespread analysis. Rodents (both rats and mice) are common model organisms used by scientists to investigate space-related biological impacts. The enclosure that house rodents during spaceflight are called Rodent Habitats (formerly Animal Enclosure Modules), and are substantially different from standard vivarium cages in their dimensions, air flow, and access to water and food. In addition, due to environmental and atmospheric conditions on the International Space Station (ISS), animals are exposed to a higher CO2 concentration. We recently reported that mice in the Rodent Habitats experience large changes in their transcriptome irrespective of whether animals were on the ground or in space. Furthermore, these changes were consistent with a hypoxic response, potentially driven by higher CO2 concentrations. Here we describe how a typical rodent experiment is performed in space, how omics data from these experiments can be accessed through the GeneLab platform, and how to identify key factors in this data. Using this process, any individual can make critical discoveries that could change the design of future space missions and activities.

The NASA GeneLab platform provides unfettered access to precious omics data from biological spaceflight experiments. We describe how a typical mouse experiment is conducted in space and how data from such experiments can be accessed and analyzed.

Esplorare l'effetti del volo spaziale sulla fisiologia del Mouse utilizzando la piattaforma aperta di accesso NASA GeneLab

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...