Work partially funded by Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 to SG and CJD) and the Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 to SG). We would like to thank Dr. Richard Poulin for editorial assistance and Mrs. Chanel Dupont for technical assistance.

NOT: insan ve hayvan kanser hücreleri satın alınabilir veya lütfen bize sağlanan beri yok etik dikkate. Yapma 1. Kollajen Fiş (Sözde birincil Tümör) <ol><li> Bir kollajen dağılımını hazırlayın. Daha önce 17 ya da satın bildirdiği gibi ben de ayıklanır ve sterilize edilebilir sıçan kuyruğu tendonları (RTT) den kollajen yazın. (Beşi 2 dakika çalışır yüksek hız) üniform bir karışımı için dondurularak kurutulmuştur RTT kollajen (0.02 N, asetik asit içinde 3.25-3.50 mg / ml), bir karıştırıcı kullanılarak dağıtılır. </li><li> Hasat (tripsin-EDTA, genellikle) ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak için tripan mavisi dışlama kullanın. İstenilen hücre yoğunluğu (fiş başına 5 x 10 4 hücreler) ayarlayın. </li><li> Steril koşullar altında tüm çözümler (NaOH, fetal sığır serumu, DMEM 5x, NaHCO3) Bileşen (Tablo 1) Hazırlama ve buz üzerinde soğutulmuş tutun. Not: çeşitli çözümler eklenme sırası hücreleri ozmotik veya asidik şokları önlemek için önemlidir. </li><li> Olabildiğince hızlı bir şekilde son kolajen çözeltisi (5 mi) içine hücre dispersiyonu (1.25 x 10 6 hücre) uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek ve daha sonra hızlı bir şekilde 96 oyuklu plakanın her bir hazır kullanımlı çözeltisi 200 ul dağıtma ise (aşağı yukarı pipetleme) tarafından iyice karıştırın. Yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için hücre kültürü kaput çalışma alanı yüzeyinde çoklu plaka grev ve kuyuların içinde eşit çözüm yaymak için. </li><li> Tüm oyuklara doldurduktan sonra inkübatör içine saklamak, (bu adım 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 15-20 dakika sürer). </li><li> gece boyunca 2 saat 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Kollajen jelasyon (yani, fibrillogenesis), 30 dakika içinde meydana gelir. Bir gecelik inkübasyondan gerçekleştirmek için kültür kültür ortamı (100 uL / ​​oyuk) ilave edin. </li></ol> Fibrin Gel 2. İlk Katman <ol><li> Fibrinojen solüsyonu hazırlanması. Not: fibrin jel aynı parti, ideal daha tekrarlanabilir Resul için kullanılmalıdırts, fibrin jel oluşumu, ticari dondurularak kurutulmuş fibrinojen farklı yükleri arasında değişebilir. <ol><li> Her zaman taze hazırlanmış fibrinojen çözümü kullanın. Hidrat kristal oluşumunu önlemek için, şişeyi açarken, oda sıcaklığına kadar dondurularak kurutuldu fibrinojen getirin. </li><li> Kademeli önceden ısıtılmış (37 ° C), Ca2 + ile Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) / 3 mg / ml çalışma konsantrasyonunda Mg2 + (en az son hacminin% 15 fazlalık hazırlanması düşünülebilir gerekli fibrinojeni çözülür : örneğin, 5 ml çözelti için 5.75 ml 17.25 mg) verdi. <ol><li> fibrinojen parçaları çözmek için ilk başta önceden ısıtılmış HBSS damla damla ekleyin. beher bir spatula ile büyük parçaları yıkmak. zaman ve karıştırma işleminin kolaylaştırılması için zaman beher çalkalayın. İşlem sırasında bir karıştırıcı plaka kullanmayın. yukarı ve aşağı süspansiyon pipetleme kalan tozu eritin. </li></ol></li><li> Steri ise ılık fibrinojen çözüm tutun0.22 um&#39;lik bir filtreden geçirilerek çözelti lizing. Not: HBSS yeterince sıcak değil veya fibrinojen tamamen çözülmüş değilse, çözüm filtreyi tıkayabilir. Varsa, fibrinojen konsantrasyonunu azaltmak ve böylece fibrin pıhtı sertliği olabilir, bir veya iki kez filtreyi değiştirin. </li><li> Bir alternatif prosedür olarak, son hacmi ayarlarken hazır kullanım fibrinojen çözeltisi içine ilgi hücreleri (örneğin, endotel hücreleri) süspanse edin. </li></ol></li><li> Trombin Çözümleri hazırlanması. <ol><li> GKD 2 O (50 NIH birim / mi) içinde bir stok çözelti hazırlayın, daha sonra bir 0.22 mikron filtre kullanılarak sterilize edin. </li><li> bir fibrinojen / trombin oranı ≥1 kullanın: 0.0075 (h / h), fibrin jel oluşturmak için. </li></ol></li><li> Fibrin Jel oluşturuluyor. <ol><li> Steril fibrinojen tutmak ve tüm sonraki adımlar boyunca buz üzerinde stok solüsyonları trombin. fibrin jel 24 oyuklu plakalar içinde oluşturmak üzere izin verilir. </li><li> Derhal bindirme inciHer bir E yüzeyi de hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek fibrinojen solüsyonu (200 ul / oyuk). Bir seferde 6 kuyu işleyin. </li><li> fibrinojen çözüm tamamen kuyu yüzeyini kaplayan sonra, bir 45 ° açıyla plaka yatırmak ve iyi merkezi haline trombini bırakarak ilk kuyuya trombin çözeltisi 1.5 ul ekleyin ve sonra yavaşça için yatay plaka girdap 1-2 sn. <ol><li> Laminer akış kaputu (5-10 dk) jelleşme / pıhtılaşma işlemi tamamlanıncaya kadar altında stabil pozisyonda plaka bırakın (Not: polimerizasyon işlemi inkübatör plaka taşıyarak, örneğin, rahatsız edilmemelidir). </li></ol></li><li> İlk altı kuyu polimerize sonra tüm kuyular işlendikten kadar, önümüzdeki altı kuyuları için aynı diziyi (yani 3 Önceki adımlar) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Fibrin Gel ve sandviç Kollajen Plug 3. İkinci Kat <ol><li> seçenekA: (hemen Kollajen Tak Kullanarak). <ol><li> fibrin jel ilk kat ince plaka eğerek bütün kuyularda polimerize emin olun. kolajen fişleri transferini kolaylaştırmak için (fibrin jeller ihtiva eden), 24 oyuklu bir plaka ile yan kollajen jel fişler yan ihtiva eden 96 oyuklu plaka koyun. </li><li> kolajen fişleri ihtiva eden plakanın her oyuğuna HBSS bir damla ekleyin. </li><li> İnce (bir kolu olarak kullanılır) bir şırınga üzerine monte iğne veya (video) bir mikro-kaşık kullanarak iyi her kollajen fişini çıkartın. kollajen fiş de kuyuya merkezli ve kısırlık bakımlı olduğundan emin yaparken, bir veya iki mikro-kaşık kullanarak ilk fibrin jel tabakası üzerine her kollajen fiş aktarın. </li><li> fibrinojen çözeltisi, ikinci tabaka ile daha önce oluşan fibrin jel Yerleşimi (300 ul / oyuk) ve 2.3 de tarif edildiği gibi en az 1 tutarak, trombin tanıtmak. seferinde 0.0075 oranı altı kuyu bir sekans &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> (Büyüme Faktörü-azaltılmış Bodrum Membran (GFRBM) ince bir tabaka ile Kollajen Tak Kaplama) Seçenek B. <ol><li> Serin, tüm Hazırlanan çözümler ve aletleri önceden ve GFRBM donmuş alikotları beri işlenmesi sırasında (örneğin, pipet, ipuçları, test tüpleri), 4 ° C&#39;de veya buz üzerinde saklayın (üreticinin talimatlarına uyun) çözülme sırasında aşırı ısınma oranına çok duyarlı . </li><li> plaka oyuklarından ayrılmasından sonra, saf GRFBM çözeltisi 100 ul buz ihtiva eden bir 1.5-ml santrifüj tüpü içinde 2 dakika boyunca her kollajen fiş ıslatın. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi sağlanması, iyi merkezli iken ilk fibrin tabakası üzerine her kaplanmış fişi aktarın. 5 dakika GRFBM bir jel oluşturmak için izin vermek için 37 ° C&#39;de eklenti ihtiva inkübe edin. Adım 3.1.4 olarak ikinci fibrin katmanı ekleyin. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Kültürü Ortamı koşullar <ol><li> (Kültür ortamı ile de 4 her dolum00 ul). Kültür ortamları ve takviyeleri hücre çizgisi ve deneysel koşullara bağlı olarak seçilir. </li><li> 100 kallikrein önleyici birim (KIU) / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda kültür ortamına aprotinin bir antifibrinolitik ekleyin. NOT: test edilen hücre hattı için kullanılan şartlar altında, bir hücre kültürü inkübatöründe plakaları saklayın. </li><li> Her gün taze ortam ile kültürler doldurun veya deneysel şemasına göre ve aprotinin ekleyin. Taze orta eklemeden önce biraz (30-35 ° açıyla) plaka yatırın ve dikkatle sürekli gözlem altında klimalı ortam aspirasyon sırasında kuyunun kenarına pipet eğin. </li></ol>

<ol>
	<li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+review:+from+bench+to+bedside.">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).</li><li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems.">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2016).</li><li>Bill, R., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+EMT+in+breast+cancer+metastasis:+Correlation+or+causality.">The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Three-Dimensional+(3D)+Models+in+Cancer+Research:+an+Update.">In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Obenauf, A. C., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+at+a+Distance+Organ-Specific+Metastasis.">Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li><li>Sykes, J. A., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Tumor+Cells+from+Fibroblasts.">Separation of Tumor Cells from Fibroblasts.</a> Human Tumor Cells In Vitro. 1, 1-22 (1975).</li><li>Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Prostate+Epithelial+Morphogenesis+in+Response+to+Stroma+and+Three-Dimensional+Matrigel+Culture.">Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture.</a> Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+Oncogenesis+of+MCF-10A+Mammary+Epithelial+Acini+Grown+In+Three-Dimensional+Basement+Membrane+Cultures.">Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+assays.">Tumor cell invasion assays.</a> Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Dynamic+Reciprocity:+Engineering+Three-Dimensional+Culture+Models+of+Breast+Architecture,+Function,+and+Neoplastic+Transformation.">Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).</li><li>Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Spheroid+Cultures+of+Human+Prostate+Cancer+Cell+Lines.">Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines.</a> Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).</li><li>Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Collagen-Based+Multicellular+Tumor+Spheroid+Model+for+Evaluation+of+the+Efficiency+of+Nanoparticle+Drug+Delivery.">A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery.</a> Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).</li><li>Neto, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Hanging+Spherical+Drop+System+for+the+Generation+of+Cellular+Spheroids+and+High+Throughput+Combinatorial+Drug+Screening.">A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening.</a> Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).</li><li>Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Fibroblasts+are+Required+for+PC-3+Human+Prostate+Cancer+Cells+to+Produce+Capillary-like+Formation+of+Endothelial+Cells+in+a+Three-dimensional+Co-culture+System.">Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System.</a> Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).</li><li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Culture+System+as+a+Model+for+Studying+Cancer+Cell+Invasion+Capacity+and+Anticancer+Drug+Sensitivity.">Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity.</a> Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li><li>Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+shRNA+Screen+Identifies+GAS1+as+a+Novel+Melanoma+Metastasis+Suppressor+Gene.">A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene.</a> Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+Of+Ready-To-Use,+Storable+And+Reconstituted+Type+I+Collagen+From+Rat+Tail+Tendon+For+Tissue+Engineering+Applications.">Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).</li><li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Lung+Cancer-associated+Fibroblasts+in+Three-dimensional+In+Vitro+Co-culture+Model.">Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li><li>Banyard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Genes+Regulating+Migration+and+Invasion+Using+a+New+Model+of+Metastatic+Prostate+Cancer.">Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer.</a> BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).</li><li>Palumbo, J. S., Degen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+Tumor+Cell+Metastasis.">Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis.</a> Haemostasis. 31, 11-15 (2001).</li><li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Stroma,+Tumor+Blood+Vessels,+and+Antiangiogenesis+Therapy.">Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy.</a> Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).</li><li>Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Hypoxia+as+a+Driving+Force+in+Genetic+Instability.">Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability.</a> Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+Relevant+In+Vitro+Tumor+Models+for+Drug+Screening.">Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Pancreatic+Carcinoma+Spheroids+Induce+a+Matrix-rich,+Chemoresistant+Phenotype+Offering+a+Better+Model+for+Drug+Testing.">3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing.</a> BMC Cancer. 13 (95), (2013).</li><li>Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Spatial+Configuration+of+Tumour+Cells+Confers+Resistance+to+Chemotherapy+Independent+of+Drug+Delivery.">Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+Cytotoxicity+of+Human+MCF-7+and+MDA-MB+231+Breast+Cancer+Cells+is+Altered+by+Osteoblast-Derived+Growth+Factors.">Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors.</a> Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).</li><li>Lang, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+Response+of+Cell+Invasion+to+Matrix+Stiffness+in+Three-Dimensional+Biopolymer+Networks.">Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks.</a> Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).</li></ol>

The authors have no disclosure.

önemli bir teknik dipnot olarak, bir boşluk, merkezi ve periferik jeller arasındaki ara yüzeyde mevcut olması gereklidir. Aksi takdirde, / göç fibrin jel işgal hücrelerin kapasitesini azaltabilir. Trombin uygun seyreltilmiş edilmemiş ise, kollajen ve fibrin jel arasındaki boşluk kültür ilk 24 saat içinde meydana gelebilir. Kollajen jel neden olabilir test edilen hücre hattı, böylece, her iki jeller arasındaki oluşturmak için göreceli olarak büyük bir alan neden kültür sırasında sözleşme olması da mümkündür. Stromal hücrelerin bağlı miyofibroblastik benzeri aktivitesi 18 kanser hücreleri ile birlikte kollajen jel ile karıştırılır, bu durum özellikle beklenir. Bu yapıyı önlemek için, kollajen fişi daha uzun bir süre için 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilmelidir (≥48 saat ) fibrin sandviç montaj öncesinde jel daralma ikna etmek. Ayrıca, tahlil karşılaşılan bir sorun varlığıfibrin fibrilleri ya da topakları ve fark edilebilir. Bunun nedeni kanser hücresi göç yollarının pertürbasyonuna veri yorumlama zorlaştırmaktadır fibrin jel, bir bulanık yerine saydam yönünü verir. Bu tür konularda kültürü plakaları polimerizasyon işlemi sırasında fibrinojen çözümünün yetersiz veya aşırı sallayarak kaynaklanabilir. Aynı zamanda fibrinojen solüsyonu (adım 2.3) içine trombin uygunsuz ek nedeniyle olabilir. Yanlış şekillendirilmiş veya bulutlu fibrin jel kez sabit katılaşmış edilemez. Kollajen veya fibrin jel, bir çok durumda, kendiliğinden inkübatör bir kaç gün sonra serbest kalacaktır hava kabarcıkları ihtiva edebilir; Bununla birlikte, uygun bir pipet ortaya çıkmasını en aza indirir. Hücre kültür periyodunun başlangıcında, bir anti-fibrinolitik madde tanıtmak için tavsiye edilir. Fibrinoliz bağlı hücresel aktivite ve C olan proteolitik enzimler (örneğin, plazminojen aktivatörü) aktivasyonu hücre kültürü uzun bir süre sonra ortaya çıkabilirollagen fiş ve kanser hücre tipleri ve plakaların altına bozulmuş fibrin jel ve hücre eki kolajen fişinin onların saldırganlık 19 hayranlarıyla sürümü bağlı uydu tümörleri, aşırı fibrinoliz iki sonuçları (Tablo sorun giderme bölümüne bakın vardır 2). Mevcut tekniğin bir sınırlama zor tüm jelden hücreleri gözlemlemek için yapabilirsiniz fibrin jel, kalınlığı. Ancak, uzun bir çalışma mesafesi kondansatör ile kullanımı bir mikroskop, bu sınırlama aşmak için ve tüm Z ekseni boyunca hücrelerin izlenmesi için yardımcı olur. Konfokal veya Intravital mikroskopi da fibrin jel hücreleri görselleştirmek için bir alternatif sunabilir. Bu 3D hücre kültürü modeli geliştirmek için önemli amaçlarından biri kanser hücrelerinin serbestçe göç ve geliştirmek edebiliyoruz hangi aracılığıyla bir hücre dışı matris bölme sağlamak oldu. Fibrin nedeniyle tümörlerde varlığını seçildibu enflamasyon, nekrozu ve değişken anjiyogenez ile indüklenen vasküler geçirgenliğin artmasına borçlu, fibrin, tümör hücresi istilasını 20,21 kolaylaştırmak için bilindiğinden. bu tümörlerde, örneğin fibrin olarak, yeni destekleyici matris üretimini taklit olarak iki bölme arasındaki arayüz çok ilgi sunuyor. Ayrıca, oksijen ve besin difüzyon ve uzun vadede, pH stabilitesi, muhtemelen difüzyon kolaylaştırılmış olduğu periferal fibrin bölmesine göre kollajen bölmesine düzensiz edilir. Nedeniyle başlangıçta merkezi kollajen fiş toplanan kanser hücrelerinin çok sayıda, nekroz / apoptoz belirtileri hastanın 22 primer tümörlerinin büyümesi sırasında gözlemlenen fenomeni taklit kültür sırasında primer tümöre içinde gözlenir. Üstelik, uydu yayını tümör oluşumu önemli ölçüde kanser hücrelerinin saldırganlık gibi metastatik davranışı ile ilgilidir. hücre hattı ve tip o bağlı olarakf deney, sürece 30 gün olarak olabilir ilgili metastatik süreçleri gözlemlemek için gerekli kuluçka süresi. Bu diğer 3D deneyleri için genellikle daha uzundur, ancak ilave gecikme in situ tümörlerinde modeli daha temsilcisine okuyan avantajı getiriyor. İyi 3D kültür modellerinde yetiştirilen hücreler, tek tabakalı hücre kültürleri 5,23 ile karşılaştırıldığında hücre sinyal iletimi ve gen ekspresyonu farklılıklarını gösterir olduğu kabul edilmektedir. 3D kanser hücrelerinin üretimi de kemoterapötik maddeler 24-26 duyarlılıklarını etkiler. Bu 3D hücre kültürü modelinin önemli ve çekici özelliği dolayısıyla ECM konsantrasyonu ve hücre-hücre ve hücre-ECM biyomekanik özellikleri üzerine çalışanların ilgisini çekebilecek jel sertliği, değiştirme imkanı bulunduğu etkileşimleri yanı sıra hücre işgali üzerine matriks özelliklerinin etkisi / göç 27 işler. Burada sunulan 3D hücre kültürü tahlil adapte edilebilired farklı ayarlar ve / veya deneysel koşullar uygun. Örneğin, tahlil hücrelerinin çok sayıda gerektiren bir çalışmayı barındıracak kadar ölçeklendirilebilir; malzeme miktarı ve hücre sayısının iki katına çıkararak, kollajen fişler 48 oyuklu bir plaka içerisinde hazırlanabilir ve 6 oyuklu plaka içerisinde bir fibrin jel üzerine katmanlı. Öte yandan, yüksek verimli çalışmalar nedeniyle fibrin jel tutarsız homojenlik ölçümü için kültür sistemi küçültmek için zor olabilir. İki jel bölmelerin birinde kanserli olmayan hücrelerin, kanser hücrelerinin davranışını değiştirebilir. Prostat kanseri hücre hattı PC3 fibroblastlar ve endotel hücreleri 14 ile karıştırıldığında Örneğin, uydu tümör oluşumu artar. Seçenek olarak ise, floresan etiketli hücre çizgileri hücre-hücre etkileşimleri incelemek ve / veya kültür döneminde hücreleri izlemek için jel bölümlerinde sokulabilir. Ayrıca, selamstological bölümler jel fiksasyon sonra hazırlanabilir; fibrin ile çapraz reaksiyonlar oluşabilir çünkü ancak, immünhistokimya sonuçlarının kalite antikorlar arasında değişebilir. Böyle hematoksilen ve eozin (H &amp; E) ile olduğu gibi histolojik kesitlerin rutin boyama jel matrisler (Şekil 3D) içindeki hücre organizasyonu ortaya çıkarabilir. (Bir cam pipet ile fişi çekerek, örneğin) fibrin jel kolajen fişi çıkarmak nispeten kolaydır. Bu nedenle, hücreleri ve fibrin jel içinde mevcut uydu tümörleri kollajen fiş bulunanlara ayrı yetiştirilebilir. Uydu kolonilerden hücreler cerrahi makas veya bir bisturi ile koloniler ekstre edilmesi ve fibrin jel serbest hücrelere aprotinin olmayan bir kültür ortamı içine giderek artan hasat edilebilir. Kompozit jel farklı lokalizasyonlardan Toplama hücreler gen ve protein ifadesi analizi de dahil olmak üzere çeşitli ileri çalışmalar, izin verebilir. Bu olabilirAyrıca hakkında daha fazla in vitro ya da in vivo çalışmalar agresif fenotipleri ile hücre popülasyonlarının izole etmek için kullanılabilir. Örneğin, bu 3D kültür modeli melanom metastazı 16 katılan genleri tanımlamak için kullanıldı. Tüm bu Örnek uygulamalar açık hücresi eş-kültür yapılabilir olan bir iki bölmeli 3D hücre kültürü sistemine izin esneklik göstermektedir. Sonuç olarak, 3D kültür sisteminin tasarımı esnek ve kanser hücresi apoptoz, göç ve metastaz sırasında yanı sıra antikanser ilaç değerlendirilmesi için biyolojik ve moleküler olayları araştırmak için yeni yollar sunabilir.

Kanser hücre işgali / göç ve sonraki metastaz kurulması temel ve biyomedikal özelliklerini inceleyen yoğun araştırma 1,2 konusudur. Metastaz kanser nihai aşamasıdır ve klinik yönetim belirsizliğini koruyor. Hücresel ve moleküler düzeyde metastaz daha iyi anlaşılması daha etkin tedavilerin 3 gelişmesini sağlayacaktır. Metastatik hücrelerin çeşitli özellikleri kendi stemness ve göç içinde ve primer tümörün 5&#39;ten işgal etmeye bir geçiş durumu (örneğin, epiteloid-mezenkimal geçiş) elde etmek için potansiyeli de dahil olmak üzere in vitro 4 keşfedilebilir. Neredeyse kan / lenfatik dolaşımı katkısını hariç çünkü Ancak, işgali / metastaz süreçlerinde in vitro değerlendirilmesi bir meydan okuma olmuştur. kollajen jel tümör fragmanları gömmek organotipik kültürlerinin Previou bilgisisinsi kanser saldırganlık izlemek için kullanılmaktadır. Tümörlerin karmaşıklığı korunmuş olsa da (örneğin, kanserli olmayan hücrelerin varlığı), tümör fragmanları örnekleme varyasyonuna, sınırlı orta difüzyon maruz ve stromal hücrelerinin 6 aşırı büyümesi için vardır. Alternatif bir yöntem, üç boyutlu (3D) hücre ortamı taklit eden hücre dışı matris (ECM) bileşenleri içinde mevcut kanser hücrelerinin büyüyen oluşur. kollajen jel ve / veya bir bazal membran türetilen matriks içinde meme kanseri hücre çizgilerinin proliferasyonu 3D hücre kültürünün en iyi karakterize örnekleri arasındadır. Belirli bir 3D hücre kültür ortamları kullanılarak standart koşullar altında yetiştirilen göğüs kanseri hücreleri için gözlemlenen dağınık düzeneği meme asinüs ve boru şeklindeki yapılar 7-10 kendiliğinden oluşumuna ters çevrilebilir. Ayrıca, adenokarsinom kanser hücrelerinden türetilen çok-hücreli tümör parçacıklarının oluşumunun (başka teknikler kullanılarak toplanmışÖrneğin, şu anda en yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü tahlil 11-13 oluşturmaktadır) gömme ağar, sferoidler yüzen, damla asılı. Bununla birlikte, bu deney, parçacıklarının oluşturabilen kanseri hücre çizgilerinin sınırlı dizi ve bu koşullarda hücrelerin çalışma süresinin kısalığı ile sınırlıdır. Bu görsel teknik olarak, bu tarifnamede ilgi kanser hücrelerinin alternatif olarak bir bazal membran türetilmiş matris ile kaplanabilir sözde primer tümörün in vitro oluşumunu sağlamak için, bir kollajen jel gömülü gelişmiş bir 3D hücre kültürü analizinde getirmektedir. Oluştuktan sonra, psödo-primer tümör sonra kanser hücrelerinin, iki matris bölme arasında bir arayüz çapraz sağlayan bir hücresel olmayan matris (mevcut durumda fibrin jel) içinde sandviç (Şekil 1 e bakınız). İlginç bir şekilde, agresif kanser hücreleri ile sözde primer tümörden kaynaklanan sekonder tümör benzeri yapılar görünürfibrin jel. Bu 3 boyutlu bir kültür sistemi, örneğin, anti-kanser ilaçları, gen ifadesi ve hücre-hücre ve / veya hücre-ECM etkileşimleri 14-16 için araştırmak için gerekli esnekliği sunmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Şekil 1:.. Yöntem bakış kanser çalışmaları için bir model olarak 3D hücre kültür sistemi oluşturmak için yöntemin şematik özeti <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze-dried collagen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7661</td>
			<td>from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (freeze-dried)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F8630</td>
			<td>Type I-S, 65-85% protein with &#8805;75% of protein is clottable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>605157</td>
			<td>&#160;Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Previously from BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6279&#160;</td>
			<td>&#160;solution at 5-10TIU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Micro-spoons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>3925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma Chemical, Co.</td>
			<td>D5546</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAA15-701</td>
			<td>FBS, Canadian origin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Chemical, Co.</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Chemical, Co.</td>
			<td>H8264</td>
			<td>HBSS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture assay to explore cancer cell invasiveness and satellite tumor formation

mono tabakaları memeli hücre kültürü çok çeşitli fizyolojik ve moleküler süreçleri incelemek için kullanılır. Ancak, artan hücrelerin incelemek için bu yaklaşım, genellikle istenmeyen eserler üretir. Bu nedenle, genellikle hücre-dışı matris bileşenlerini kullanarak üç boyutlu (3D) bir ortamda, hücre kültürü, in vivo bağlı doku veya organ nativ yakından benzerlik için ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Bir fibrin jel yapılmış bir sözde primer macrospherical tümör ve (ii) bir çevresel hücresiz bölme bir kollajen jel hareket gömülü kanser hücrelerini ihtiva eden bir merkez bölme iki bölme, yani: (i) ile 3 boyutlu bir hücre kültür sistemi geliştirmiştir örneğin, merkezi kullanılandan farklı bir hücre dışı matris bileşeni, burada kanser hücrelerinin göç (yayılma ön) ve / veya ikincil veya uydu tümörler temsil mikroküresel tümörler oluşturabilir. periferal bölme uydu tümör oluşumuoldukça bu 3D kültür sistemi benzersiz kılan doğal tümör hücrelerinin bilinen saldırganlık veya metastatik kökenli korelasyon. Bu hücre kültürü Kanserin hücre istilası ve motilite, hücre-hücre üstü matris etkileşimlerini ve anti-kanser ilaç özelliklerini değerlendirmek için bir yöntem olarak değerlendirilmesi için kabul edilebilir.

Daha önce de belirtildiği gibi, bu 3D hücre kültürü deneyinde ilginç bir özelliği, kanser hücreleri sadece bitişik fibrin jel kolajen fiş göç değil, aynı zamanda, ikincil tümörlerin (örneğin, uydu, tümör benzeri yapılar) tesis olup olmasıdır. Bu, doğrudan doğruya, özellikle uzun bir çalışma mesafesi kondansatör (Şekil 2) ile birlikte, jel kalınlığı boyunca düşük ve yüksek büyütmelerde bir ters faz kontrast mikroskop ile gözlenebilir. Farklı deney düzenekleri 15 ile tekrar tekrar gösterildiği gibi, bu 3D hücre kültür yöntemi kullanılarak, bilinen metastatik hücrelerinin davranışı kolaylıkla, metastatik olmayan hücrelerde bulunan edilene karşılaştırılabilir. Yalnızca çok az sayıda küçük uydu tümörler böylece onun metastatik olmayan muadili B16F0 hücre dizisi (Şekil 2 ile tespit edilebilir iken, örneğin, çok sayıda uydu tümörler rasgele metastatik hücre dizisi B16F10 olan fibrin jel içinde dağılmış bulunan). <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig2.jpg" /> Şekil 2:. 3B hücre kültürü sisteminde fare melanoma B16F10 (A) ve B16F0 (B) Hücreleri Davranış B16F10 ve B16F0 hücre çizgileri metastatik ve zayıf metastatik sırasıyla olduğu bilinmektedir. Kompozit jel bir üstten görünüşüdür, 24 oyuklu bir plaka içerisinde kültürde 15 gün sonra gösterilir. kollajen fişi (*) daha yüksek bir büyütmede görüldüğü gibi hücreler, uydu tümörleri (oklar) göç oluşmuş olan bir fibrin jel tabakası bitişiktir. Oldukça elverişli, bu hücre hatları (boyama olmadan yani) Doğrudan görselleştirme sağlar melanin yüksek düzeyde ifade ediyor. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> göç ön ve uydu tümörlerin şekli fonksiyon olarak değişebilirhücre çizgisi karakteristikleri tion. Örneğin, metastatik zayıf ama yerel olarak çok invaziv murin meme bezi karsinomu 4T07 hücreleri, fibrin jel (Şekil 3A) radyal olarak uzanan bir geçiş ön oluşturur. Kültür 14 gün sonra, söz konusu hücreler, yakın meme bezi yapıları (Şekil 3B-B) benzer yıldız-şekilli yapıları oluşturmak üzere göç eden ön uzak çekti. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54322/54322fig3.jpg" /> Şekil 3: fare meme bezi karsinoması 4T07 hücreler. Bu hücreler fibrin jel (A) taşımak için güçlü bir kapasite göstermiştir. kesikli çizgi kollajen fiş delineates ve oklar göç ön yönünü gösterir. Hücreler eşit fibrin matrisi (A) işgal ve yıldız şekilli boru şeklinde yapılar 3D görülebilir, iyi organize (B bird C). Faz kontrast mikroskopta Gösterim. (A - C) ve hematoksilen ve eozin (D) ile boyanan histolojik kesitler gösterilmektedir <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu 3D kültür sistemi, özellikle de uydu tümörlerde gözlenen hücre yapıları, daha önce 16 gösterilen bir metilen mavisi çözeltisi ile jeller boyandıktan sonra düzlemsel çıkıntı tarafından tayin edilebilir. Hücre kültürünün çeşitli aşamalarında Hoechst 33258 ile jel örnekleri Boyanma Epifloresans ters mikroskobu (Şekil 4) altında hücre çekirdekleri görselleştirmek sağlar. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54322/54322fig4.jpg" /> Şekil 4: Hormon-Duyarlı Meme Kanseri Hücreleri. İnsan GöğüsKanser MCF-7 hücreleri Tamoksifen Farklı yoğunluklara maruz bulundu. Fibrin jel (üst sıra) Uydu tümörleri, faz kontrast mikroskobu ile izlendi. (Alt sıra) (yalancı primer tümörlerde hücrelerin varlığını gösteren) kollajen jel DNA, Hoechst 33258 ile boyanmış ve epifloresans mikroskopi kullanılarak görselleştirildi. Beklendiği gibi, apoptoz sonucu uyarılan DNA parçalanması tamoksifen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> hacim </td></tr><tr><td> DMEM 5x (yok bikarbonat) toz hazırlayın </td><td> 1 mi </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 0.5 mi </td></tr><tr><td> 0.26 M NaHCO 3 </td><td> 0.5 mi </td></tr><tr><td> 1 N NaOH </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> ddH2O </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Buz üzerinde, bu çözüm tutun </td></tr><tr><td> Hücre süspansiyonu </td><td> 880 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Peki buz üzerinde ve eklemek hızla sonunda karıştırın: </td></tr><tr><td> RTT Kollajen (3.5 mg / ml) </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 5 mi </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Kollajen Fişler Reaktifler gerekli ve 18-19 fişler için bir kollajen çözüm hazırlanması. kollajen eklenmesinden sonra hava kabarcıkları kaçınarak, ve sonra derhal her kuyuya 200 ul dağıtmak iken, (yukarı ve aşağı kabı tersini) de hemen karıştırın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> adımlar </td><td><strong&gt; sorunlar </td><td> olası nedenler </td><td> Çözümler </td></tr><tr><td rowspan="4"> Aşama 1. kollajen fiş </td><td rowspan="2"> Hava balonları </td><td rowspan="2"> Uygunsuz pipetleme * </td><td> Aşırı kabarcıklar kaçınarak iyi iken karıştırın. </td></tr><tr><td> tüm yol aşağı pipet pistonlu her 200 ul çizin ve sadece 200 ul (ters pipetleme) bırakın. * </td></tr><tr><td> Kollajen fiş daralma </td><td> gece boyunca inkübe zaman Kollajen fişi özellikle, bazı hücre hatları ile küçülür. </td><td> Hücreler deney başlamadan önce kolajen daralma neden olmadığını kontrol edin. Birkaç gün içinde daralma izlemek için tavsiye edilir. Aksi takdirde, fişler sandviç jel anlaşma yapabilir. </td></tr><tr><td> Jelleşme oluşmaz </td><td> tazelik, molarite, pH, vs.) için reaktifler kontrol edin; Hiçbir reaktif çıkarılmıştır emin olun. </td><td> beg tekrar başlatınatış. </td></tr><tr><td rowspan="5"> Adım 2. Fibrin jel Birinci tabaka </td><td> Hava balonları </td><td> Aynı yorumlar *; uygulama gerekir. </td><td> Aynı çözelti. * Hava kabarcıkları fibrin jel kalabilir, ancak bunlar genellikle, 37 ° C&#39;de, zaman içinde kaybolur. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Jelleşme oluşmaz </td><td rowspan="2"> kullanılan fibrinojen yanlış miktarı; trombin konsantrasyonu veya bozulmasını kontrol edin. </td><td> baştan tekrar başlatın. </td></tr><tr><td> çözüm yetersizdir trombini varsayalım; hafif konsantrasyonu ve / veya trombin hacmi (örneğin, iki kez) artar. </td></tr><tr><td> jelleşme sonrası kalan sıvı faz </td><td> Fibrinojen çözüm ve trombin değil iyice karıştırılır. </td><td> baştan tekrar başlatın. </td></tr><tr><td> Fibrin homojen değildir (yani fibriler yapıları, topaklar) </td><td> Trombin yetersiz jel yayılmış olan; eskiaşır veya yetersiz ajitasyon </td><td> pratiğe ihtiyacım var; baştan başlatın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Aşama 3. Sandviç / 2. fibrin tabakası </td><td colspan="3"> 2. adımda aynı yorumlar. </td></tr><tr><td> Kolajen fişi hızla bir (birkaç saat) fibrin boş alanlar ile çevrili </td><td> Fibrin kollajen jel ile temas içinde yeterli polimerize henüz </td><td> baştan başlayın </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kollajen fişler aşamalı olabilir (gün-hafta) fibrin boş alanlar ile çevrili </td><td> Yerel lizis; </td><td rowspan="2"> o fişi etrafında birkaç yerde sınırlı ise, deney gidebilirsiniz. Aksi takdirde baştan başlamak düşünün. plazminojen aktivatör aşırı miktarda salgılayan hücrelere bağlı olabilir. </td></tr><tr><td> antifibrinolitik unutmayın! </td></tr><tr><td rowspan="2"> Adım 4 ve 5. cell kültür ve takip </td><td> fibrinoliz </td><td> Antifibrinolitik ajan sorun (bozulma, optimal doz, vb.). </td><td> uydu tümörler veya işgalin geniş miktarda varsa, antifibrinolitik ajan dozunu artırmak. </td></tr><tr><td> asitleştirme </td><td> Aşırı hücre büyümesi. </td><td> daha sık hücre kültür ortamı değiştirin. </td></tr></tbody></table> Tablo 2: giderme Olası sorunlar ve çözüm önerileri..

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation at JoVE.com

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

three-dimensional-culture-assay-to-explore-cancer-cell-invasiveness

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Görüntüleme.  CHU de Québec Research Centre. Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Video: Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Tıp

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Ameliyat sonrası Immunosupressjon&#39;un ve Mekanizmaları keşfedin ve Roman Perioperatif İmmünoterapiler Değerlendirmesinde Cerrahi Stres Fare Tümör Modeli

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...