Work partially funded by Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 to SG and CJD) and the Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 to SG). We would like to thank Dr. Richard Poulin for editorial assistance and Mrs. Chanel Dupont for technical assistance.

הערה: אין שיקול אתיקה מאז תאים מן החי וסרטן האדם נרכשו או בתנאי בחביבות לנו. 1. ביצוע תקעי קולגן (גידול פסאודו-יסודי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פיזור קולגן. Type I הקולגן בגידים זנב חולדה (RTT) ניתן לחלץ או עיקור כפי שדווח בעבר 17, או לרכוש. לפזר קולגן RTT מיובש בהקפאה (3.25-3.50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חומצה אצטית 0.02 N) באמצעות בלנדר (הגדרת מהירות גבוהה; חמש 2 ריצות דקות) עבור ערבוב אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקציר (טריפסין-EDTA, בדרך כלל) ולהשתמש הרחקה כחולה trypan לספירת תאי קיימא באמצעות hemocytometer. התאם את צפיפות התאים הרצוי (5 x 10 4 תאים לכל תקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל פתרונות (NaOH, בסרום שור העובר, DMEM 5x, NaHCO 3) בנפרד (טבלה 1) בתנאים סטריליים ולשמור מקורר על הקרח. הערה: הסדר של תוספת של הפתרונות השונים חשוב למנוע זעזועים האוסמוטי או חומצי בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פיזור תאים (1.25 x 10 6 תאים) לתוך התמיסה קולגן הסופי (5 מ&quot;ל) כמה שיותר מהר. מערבבים היטב (על ידי pipetting למעלה ולמטה), תוך הימנעות בועות אוויר, ולאחר מכן במהירות להפיץ 200 μl של מוכן לשימוש פתרון היטב בכל צלחת 96-היטב. בעדינות להכות את הצלחת רבה גם על משטח העבודה באזור של מכסה מנוע תרבית תאים כדי להסיר בועות אוויר כדי להפיץ את הפתרון באופן שווה בתוך הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מילוי כל הבארות (שלב זה לוקח בערך 15-20 דקות לכל צלחת 96-היטב), ולאחסן אותו לתוך החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב 37 ° C מ 2 שעות עד לילה. Gelation קולגן (כלומר, fibrillogenesis) מתרחש תוך 30 דקות. הוסף בינוני תרבות (100 μl / טוב) לתרבות לבצע דגירת לילה. </li></ol> 2. שכבה ראשונה של ג&#39;ל פיברין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון פיברינוגן. הערה: באותה אצווה של ג&#39;ל הפיברין רצוי לשמש resul לשחזור יותרts, הפיברין היווצרות קריש עשוי להשתנות בין קבוצות שונות של פיברינוגן הקפאת מיובש מסחרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תמיד פתרון פיברינוגן מוכן טרי. תביאו את פיברינוגן מיובש בהקפאה לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוקון כדי למנוע היווצרות גבישים מימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה לפזר את פיברינוגן ב מחומם מראש (37 ° C) מאוזן של האנק מלח פתרון (HBSS) עם Ca 2 + / Mg 2 + בריכוז העבודה של 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל (לשקול הכנת עודף 15% של נפח סופי המינימלי הנדרש למשל, 17.25 מ&quot;ג ב 5.75 מ&quot;ל פתרון 5 מ&quot;ל):. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף dropwise מראש חימם HBSS תחילה solubilize שברי פיברינוגן. לשבור שבר גדול עם מרית בכוס. להתסיס את הכוס מעת לעת כדי להקל ערבוב. אין להשתמש צלחת בוחשת במהלך ההליך. ממס את האבקה הנותרת על ידי pipetting ההשעיה למעלה ולמטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את פתרון פיברינוגן פושר בעוד SteriLizing הפתרון על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הערה: אם HBSS אינו חם מספיק או פיברינוגן לא נמס לגמרי, הפתרון שעלול לסתום את המסנן. במידת הצורך, להחליף פילטר פעם או פעמיים, אשר עשוי להקטין את ריכוז פיברינוגן, ובכך נוקשות הפיברין קריש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים של עניין (למשל, תאי אנדותל) לתוך פתרון פיברינוגן מוכן לשימוש תוך התאמת הנפח הסופי שלה, הכוהל חלופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות טרומבין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות DDH 2 O (50 יחידות NIH / מיליליטר), ואז לעקר אותה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש יחס פיברינוגן / תרומבין ≥1: 0.0075 (v / v) על מנת ליצור את הג&#39;ל הפיברין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת הג&#39;ל הפיברין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את פיברינוגן סטרילית תרומבין פתרונות מניות על קרח במהלך כל השלבים הבאים. הג&#39;לים הפיברין מותרים להיוצר 24 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה כיסוי מידמשטח הדואר של כל טוב עם פתרון פיברינוגן (200 μl / טוב), תוך הימנעות היווצרות בועת אוויר. לעבד 6 בארות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון פיברינוגן מכסה לחלוטין את פני השטח של בארות, להטות את הצלחת בזווית של 45 מעלות ולהוסיף 1.5 μl של פתרון תרומבין אל הבאר הראשונה על ידי הטלת תרומבין למרכז הבאר, ואז בעדינות מערבולת את הצלחת אופקית עבור 1-2 שניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת במצב יציב מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית (5-10 דקות) עד לתום התהליך gelation / קרישה השלים (NB: התהליך פילמור ואסור להפריע, למשל, על ידי הובלת הצלחת אל האינקובטור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שש הבארות הראשונות יש polymerized, לחזור על הרצף הזהה (כלומר 3 שלבים קודמים) במשך שש הבארות הבאות עד שכל הבארות כבר מעובד. </li></ol></li></ol> 3. שכבה שנייה של ג&#39;ל הפיברין הדחוק קולגן Plug <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוֹפְּצִיָהת: (באמצעות תקע קולגן מיד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי השכבה הראשונה של ג&#39;ל הפיברין יש polymerized בכל הבארות על ידי הטיית הצלחת בעדינות. מניחים את צלחת 96-היטב המכיל את הצד אטמי ג&#39;ל קולגן על ידי הצד עם צלחת 24 גם (המכיל את הג&#39;לים הפיברין) כדי להקל העברת המצתים קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של HBSS לבאר כל צלחת המכילה את המצתים קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל תקע קולגן מהבאר עם מחט דקה רכוב על מזרק (המשמש כידית) או באמצעות מיקרו-כף (ראה וידאו). העבר כל תקע קולגן על שכבת ג&#39;ל הפיברין הראשון באמצעות מיקרו-כפיות אחד או שניים, תוך שהוא מוודא את התקע קולגן הוא מרוכז היטב לתוך הבאר ועקרות שמתוחזק היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Overlay הג&#39;ל הפיברין יצר בעבר עם השכבה השנייה של פתרון פיברינוגן (300 μl / טוב) ולהציג את תרומבין כמתואר 2.3, שמירה על 1 מינימאלי:. יחס 0.0075 ו רצף של שש בארות בכל פעם &lt;/ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות ב &#39;(ציפוי תקע קולגן עם שכבה דקה של ממברנה מרתף Growth Factor-מופחת (GFRBM)). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מגניב הפתרונים והמכשירים המוכנים מראש ולשמור אותם ב 4 ° C או על קרח (למשל, טפטפות, טיפים, מבחנות) במהלך טיפול מאז aliquots הקפוא של GFRBM רגישים מאוד שיעור חימום יתר במהלך המפשיר (בהתאם להוראות היצרן) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרת מבארות צלחת, להשרות כל תקע קולגן עבור 2 דקות בתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל על הקרח המכיל 100 μl של פתרון GRFBM טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל תקע מצופה על שכבת הפיברין הראשונה תוך הבטחה זה מרוכז היטב, כפי שתואר קודם לכן. דגירה צלחות המכילות-תקע על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר GRFBM לגבש ג&#39;ל. מוסיפים את שכבת הפיברין השני כמו בשלב 3.1.4. </li></ol></li></ol> 4. Cell תנאי בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל טוב עם בינוני תרבות (400 μl). התקשורת ותוספי התרבות תיבחרנה על בסיס שורת התאים ותנאים ניסיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף aprotinin, סוכן antifibrinolytic, עד בינוני תרבות בריכוז סופי של יחידות מעכב kallikrein 100 (קיו) / מ&quot;ל. הערה: אחסן את הצלחות באינקובטור תרבית תאים בתנאים המשמשים הקו הסלולרי נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדש תרבויות עם מדיום חדש בכל יום אחר או על פי לוח הזמנים הניסיונות, ולהוסיף aprotinin. לפני הוספת בינוני טרי, מעט להטות את הצלחת (בזווית 30-35 מעלות) ו להטות את pipet על הצד של הבאר תוך בחינה זהירה שאיבת בינוני מותנה תחת השגחה מתמדת. </li></ol>

<ol>
	<li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+review:+from+bench+to+bedside.">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).</li><li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems.">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2016).</li><li>Bill, R., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+EMT+in+breast+cancer+metastasis:+Correlation+or+causality.">The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Three-Dimensional+(3D)+Models+in+Cancer+Research:+an+Update.">In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Obenauf, A. C., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+at+a+Distance+Organ-Specific+Metastasis.">Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li><li>Sykes, J. A., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Tumor+Cells+from+Fibroblasts.">Separation of Tumor Cells from Fibroblasts.</a> Human Tumor Cells In Vitro. 1, 1-22 (1975).</li><li>Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Prostate+Epithelial+Morphogenesis+in+Response+to+Stroma+and+Three-Dimensional+Matrigel+Culture.">Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture.</a> Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+Oncogenesis+of+MCF-10A+Mammary+Epithelial+Acini+Grown+In+Three-Dimensional+Basement+Membrane+Cultures.">Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+assays.">Tumor cell invasion assays.</a> Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Dynamic+Reciprocity:+Engineering+Three-Dimensional+Culture+Models+of+Breast+Architecture,+Function,+and+Neoplastic+Transformation.">Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).</li><li>Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Spheroid+Cultures+of+Human+Prostate+Cancer+Cell+Lines.">Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines.</a> Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).</li><li>Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Collagen-Based+Multicellular+Tumor+Spheroid+Model+for+Evaluation+of+the+Efficiency+of+Nanoparticle+Drug+Delivery.">A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery.</a> Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).</li><li>Neto, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Hanging+Spherical+Drop+System+for+the+Generation+of+Cellular+Spheroids+and+High+Throughput+Combinatorial+Drug+Screening.">A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening.</a> Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).</li><li>Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Fibroblasts+are+Required+for+PC-3+Human+Prostate+Cancer+Cells+to+Produce+Capillary-like+Formation+of+Endothelial+Cells+in+a+Three-dimensional+Co-culture+System.">Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System.</a> Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).</li><li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Culture+System+as+a+Model+for+Studying+Cancer+Cell+Invasion+Capacity+and+Anticancer+Drug+Sensitivity.">Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity.</a> Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li><li>Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+shRNA+Screen+Identifies+GAS1+as+a+Novel+Melanoma+Metastasis+Suppressor+Gene.">A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene.</a> Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+Of+Ready-To-Use,+Storable+And+Reconstituted+Type+I+Collagen+From+Rat+Tail+Tendon+For+Tissue+Engineering+Applications.">Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).</li><li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Lung+Cancer-associated+Fibroblasts+in+Three-dimensional+In+Vitro+Co-culture+Model.">Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li><li>Banyard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Genes+Regulating+Migration+and+Invasion+Using+a+New+Model+of+Metastatic+Prostate+Cancer.">Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer.</a> BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).</li><li>Palumbo, J. S., Degen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+Tumor+Cell+Metastasis.">Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis.</a> Haemostasis. 31, 11-15 (2001).</li><li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Stroma,+Tumor+Blood+Vessels,+and+Antiangiogenesis+Therapy.">Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy.</a> Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).</li><li>Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Hypoxia+as+a+Driving+Force+in+Genetic+Instability.">Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability.</a> Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+Relevant+In+Vitro+Tumor+Models+for+Drug+Screening.">Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Pancreatic+Carcinoma+Spheroids+Induce+a+Matrix-rich,+Chemoresistant+Phenotype+Offering+a+Better+Model+for+Drug+Testing.">3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing.</a> BMC Cancer. 13 (95), (2013).</li><li>Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Spatial+Configuration+of+Tumour+Cells+Confers+Resistance+to+Chemotherapy+Independent+of+Drug+Delivery.">Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+Cytotoxicity+of+Human+MCF-7+and+MDA-MB+231+Breast+Cancer+Cells+is+Altered+by+Osteoblast-Derived+Growth+Factors.">Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors.</a> Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).</li><li>Lang, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+Response+of+Cell+Invasion+to+Matrix+Stiffness+in+Three-Dimensional+Biopolymer+Networks.">Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks.</a> Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).</li></ol>

The authors have no disclosure.

בתור הערת שוליים טכני חשוב, זה חיוני כי אין פער קיים בממשק בין מרכזי הג&#39;לים הפריפריה. אחרת, זה עלול להפחית את היכולת של התאים לנדוד / לפלוש הג&#39;ל הפיברין. רווח בין קולגן ג&#39;לים הפיברין עלול להיווצר במהלך תרבות 24 שעות של הראשון אם תרומבין לא דוללו כראוי. אפשר גם כי שורת תאים נבדק עלול להוביל את ג&#39;ל קולגן להתכווץ במהלך התרבות, ובכך לגרום חלל גדול יחסית להיווצר בין שני ג&#39;לים. זה צפוי במיוחד כאשר תאי סטרומה מעורבבים ג&#39;ל קולגן יחד עם תאים סרטניים עקב פעילות myofibroblastic דמוי 18. על מנת להימנע חפץ זה, תקע קולגן צריך להיות מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה ארוכה יותר (≥48 hr ג&#39;ל) כדי לגרום התכווצות לפני הרכבת הכריך הפיברין. בעיה נתקלה גם עם assay היא הנוכחותסיבים או agglomerates הפיברין מפורש של. זה מקנה מעונן במקום היבט שקוף כדי הג&#39;ל הפיברין, אשר מסבך נתונים לפרשנות בשל הפרעות של מסלולים הנודדים תאים הסרטניים. בעיות אלה עשויות לנבוע רעידות לקויות או מוגזמות של הפתרון פיברינוגן במהלך התהליך פילמור צלחות התרבות. זה יכול להיות גם בשל התוספת התקינה של תרומבין לתוך תמיסת פיברינוגן (שלב 2.3). ג&#39;ל הפיברין משובש או מעונן לא ניתן לתקן פעם הקרושה. ג&#39;ל קולגן או הפיברין עשוי להכיל בועות אוויר כי, ברוב המקרים, יתפנו החוצה באופן ספונטני אחרי כמה ימים בחממה; בכל זאת, pipetting ראוי ממזער התרחשותם. מומלץ להציג את סוכן אנטי Fibrinolytic בתחילת תקופת תרבית תאים. פירוק פיברין עלולה להתרחש לאחר תקופה ארוכה של תרבית תאים עקב פעילות הסלולר ואת ההפעלה של אנזימים מפרקי חלבונים (כלומר, מפעיל פלסמינוגן) בתוך גתקע ollagen וגידולי הלווין, בהתאם לסוגי התאים הסרטניים ולשחרר .the 19 אגרסיביויות שלהם של תקע קולגן מן הג&#39;ל הפיברין המושפל מצורף תא התחתון של הצלחות שתי השלכות של פירוק פיברין מוגזם (ראה סעיף פתרון בעיות בלוח 2). הגבלה של הטכניקה הנוכחית היא בעובי של הג&#39;ל הפיברין, אשר יכול להקשות להתבונן תאים דרך ג&#39;ל כולו. עם זאת, השימוש במיקרוסקופ עם מעבה מרחק עבודה ארוך עוזר לעקוף מגבלה זו כדי לפקח תאים לאורך ציר ה- Z כולו. מיקרוסקופיה Confocal או intravital עשויה גם לספק אלטרנטיבה כדי להמחיש את התאים בתוך הג&#39;ל הפיברין. אחת המטרות העיקריות לפיתוח מודל תרבית תאי 3D זה היה לספק תא תאי מטריקס שדרכו תאים סרטניים יכולים לנדוד בחופשיות ולפתח. הפיברין נבחר בגלל נוכחותה גידולים,חייבת להגדלת חדירות כלי דם הנגרמות על ידי דלקת, נימקתי אנגיוגנזה שינתה, ומאז הפיברין ידוע גם כדי להקל על פלישת תאים סרטנית 20,21. הממשק בין שני תאי מציג עניין רב כפי שהוא מחק את הייצור של מטריקס תומכת חדשה, כגון הפיברין, בגידולים. יתר על כן, דיפוזיה חמצן וחומרי הזנה, והן כבר לרוץ, pH יציבות, הם אולי dysregulated בתא קולגן לעומת תא הפיברין היקפי שבו דיפוזיה הוא הקל. בשל מספר הרב של תאים סרטניים מצטברים תחילה תקע קולגן מרכזי, סימני נימק / אפופטוזיס הם נצפו בתוך הגידול הראשוני במהלך התרבות, המדמים את התופעה נצפתה במהלך ההתרחבות של גידולים ראשוניים בחולי 22. יתר על כן, ההיווצרות של גידולי לווין קשור להפליא פי מידת האגרסיביות של תאים סרטניים, כמו גם ההתנהגות גרורתי שלהם. בהתאם לקו התא וסוג of ניסוי, תקופת הדגירה הנדרשים לצפות בתהליכים גרורתי רלבנטית עשויים להתקיים כל עוד 30 ימים. זה בדרך כלל יותר עבור מבחני 3D אחרים, אך העיכוב הוסיף מביא את היתרון של לימוד מודל מייצג בצורה טובה יותר בגידולים באתרו. הוא גם הכיר בכך תאים שגודלו במודלי תרבות 3D להציג הבדלי איתות תא ביטוי גנים לעומת בתרביות תאים בשכבה 5,23. גידול תאים סרטניים 3D גם משפיע רגישותם תרופות כימותרפיות 24-26. תכונה חשובה ואטרקטיבית של מודל תרבית תאי 3D זה מתגוררת את האפשרות לשנות את ריכוז ECM, ובכך את הנוקשות של ג&#39;ל, אשר עשוי לעניין את אלו לעבוד על התכונות ביומכנית של תאי תאים ותא-ECM אינטראקציות, כמו גם את ההשפעה של מאפייני מטריקס על פלישת תא / הגירה מעבדות 27. את assay תרבית תאי 3D המוצג כאן ניתן להתאיםעורך כדי להתאים הגדרות שונות ו / או תנאי הניסוי. לדוגמה, assay וניתן לשנותם עד כדי להכיל מחקרים הדורשים מספר רב של תאים; על ידי הכפלת כמות חומר ואת מספר התאים, תקעי קולגן אפשר להכין צלחת 48-היטב שכבתי על ג&#39;ל הפיברין צלחת 6 באר. מצד השני, זה עלול להיות קשה מגמד את מערכת התרבות ללימודי תפוקה גבוהה ומדידות בגלל ההומוגניות העקבית של הג&#39;ל הפיברין. המבוא של תאים שאינם סרטניים באחת משני תאי ג&#39;ל עשוי לשנות את אופן התפקוד של התאים הסרטניים. למשל, ההיווצרות של גידולי לווין מחריפה כאשר PC3 שורת תאי סרטן הערמונית הוא מעורבב עם פיברובלסטים ותאי האנדותל 14. לחלופין, שורות תאי fluorescently שכותרתו ניתן הציגו במדורים ג&#39;ל לחקור אינטראקציות תאי תאים ו / או לעקוב אחר התאים בתקופת התרבות. יתר על כן, הייניתן להכין חלקים stological לאחר קיבוע ג&#39;ל; עם זאת, את האיכות של תוצאות אימונוהיסטוכימיה עשויה להשתנות בין נוגדנים מאז-תגובות צלב עם הפיברין עלולות להתרחש. מכתים שגרתי סעיפים היסטולוגית כגון עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E) יכול לחשוף ארגון תא בתוך מטריצות ג&#39;ל (איור 3D). זה יחסית קל להסיר את התקע קולגן מן הג&#39;ל הפיברין (למשל, על-ידי משיכת התקע עם טפטפת זכוכית). לכן, תאים וגידולי לווין נוכח הג&#39;ל הפיברין ניתן לגדל בנפרד מאלה המצויות תקע קולגן. תאים מן המושבות הלוויין ניתן לקצור ידי לחילוץ המושבות עם מספריים כירורגיות או אזמל וגידולם במדיום תרבות ללא aprotinin לתאים חינם מן הג&#39;ל הפיברין. תאי איסוף מן התאים השונים של ג&#39;ל מרוכבים יכולים לאפשר מחקרים נוספים שונים, כוללים גן וניתוח ביטוי חלבון. זה יכוללשמש גם כדי לבודד אוכלוסיות תאים עם פנוטיפים אגרסיווי נוסף במבחנה או במחקרי vivo. למשל, מודל התרבות 3D זה שימש לזיהוי גנים המעורבים גרורות מלנומה 16. כל היישומים נציג אלה הראו בבירור את הגמישות מותר על ידי מערכת תרבית תאי 3D דו-compartmental שבו תא שיתוף התרבות יכולה להתבצע. לסיכום, את העיצוב של מערכת תרבות 3D שלנו הוא גמיש ויכול להציע דרכים חדשות לחקור אירועים ביולוגיים ומולקולריים במהלך אפופטוזיס של תאים סרטניים, הגירה וגרורה כמו גם להערכת תרופה נגד סרטן.

חקירת המאפיינים הבסיסיים ואת הביו-רפואיים של פלישת תאים סרטניים / הגירה והקמת גרורות הבאה היא הנושא של 1,2 מחקר אינטנסיבי. גרורה היא לשלב הסופי של הסרטן והניהול הקליני שלה נותר חמקמק. הבנה טובה יותר של גרורות ברמות התאיות ומולקולריות תאפשר הפיתוח של טיפולים יעילים יותר 3. מספר מאפיינים של תאים גרורתי יכולים להיחקר במבחנה 4 כולל stemness והפוטנציאל שלהם לרכוש מדינה מעברת (למשל, מעבר mesenchymal-epithelioid) להגר ולפלוש בתוך מן הגידול הראשוני 5. עם זאת, ההערכה חוץ גופית של תהליכים הפלישה / גרורות כבר אתגר שכן הוא כמעט אינו כולל את התרומה של זרימת הדם / הלימפה. תרבויות Organotypic מטמיעי שברי גידול ג&#39;ל קולגן יש לשנים קודמותערמומי נעשה שימוש כדי לפקח תוקפנות הסרטן. למרות המורכבות של גידולים נשמרות (למשל, הנוכחות של תאים לא סרטניים), שברי גידול נחשפות דיפוזיה בינוני מוגבל, כדי וריאצית דגימה, וכדי גידול יתר של תאי סטרומה 6. שיטה חלופית מורכבת בגידול תאים סרטניים בתוך מרכיבי תאי מטריקס (ECM), אשר מחק את סביבת התא תלת ממדי (3D). הריבוי של שורות תאי סרטן שד ג&#39;ל קולגן ו / או מרתף קרום נגזר מטריקס הוא בין הדוגמות המאופיינות ביותר של תרבית תאי 3D. באמצעות סביבות תרבות תא ספציפיות 3D, ההרכבה לא המאורגנת שנצפתה עבור תאי סרטן השד גדלו בתנאים סטנדרטיים יכולה להיות הפוכה להיווצרות הספונטנית של acini החלב כגלילים 7-10. יתר על כן, היווצרות spheroids הגידול רב-תאיים שמקורם בתאי סרטן אדנוקרצינומה התקהלו שימוש בטכניקות שונות (למשל, תלוי טיפות, צוף spheroids, אגר embedment) מהווה כיום את assay תרבית תאי 3D הנפוץ ביותר 11-13. עם זאת, assay זה הוא מוגבל על ידי הקבוצה המוגבלת של שורות תאי הסרטן שיכול ליצור spheroids ועל ידי התקופה הקצרה הזמינה ללמוד תאים בתנאים אלה. בטכניקה דמיינה זו, אנו בזאת להציג assay תרבות מתוחכם תא 3D שבו תאים סרטניים של עניין מוטבעים ג&#39;ל קולגן לאפשר במבחנת היווצרות גידול פסאודו-יסודיים שניתן מצופה לחלופין עם מטריצת קרום הנגזרות במרתף. מרגע היווצרותם, הגידול פסאודו-יסודיים ואז היא דחוקה מטריקס acellular (ג&#39;ל הפיברין במקרה הנוכחי), אשר מאפשר את התאים הסרטניים לחצות את הממשק בין שני תאי מטריקס (ראה איור 1). מעניין, מבני גידול דמוי משני שמקורם מן הגידול פסאודו-יסודי יחד עם תאי סרטן אגרסיביים מופיעיםג&#39;ל הפיברין. מערכת כזו תרבות 3D מציעה את הגמישות הנדרשת כדי לחקור, למשל, תרופות נגד סרטן, ביטוי גנים תאים תאים ו / או תא-ECM אינטראקציות 14-16. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> איור 1:.. סקירה כללית של שיטת סיכום סכמטי של השיטה כדי ליצור את מערכת תרבית תאי 3D כמודל ללימודי סרטן <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze-dried collagen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7661</td>
			<td>from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (freeze-dried)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F8630</td>
			<td>Type I-S, 65-85% protein with &#8805;75% of protein is clottable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>605157</td>
			<td>&#160;Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Previously from BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6279&#160;</td>
			<td>&#160;solution at 5-10TIU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Micro-spoons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, round base</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>3925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma Chemical, Co.</td>
			<td>D5546</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAA15-701</td>
			<td>FBS, Canadian origin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Chemical, Co.</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Chemical, Co.</td>
			<td>H8264</td>
			<td>HBSS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture assay to explore cancer cell invasiveness and satellite tumor formation

תרבית תאים יונקת monolayers נעשתה שימוש נרחב ללמוד תהליכים פיסיולוגיים ומולקולריים שונים. עם זאת, גישה זו ללמוד תאי גדלים מניבים לעתים חפצים לא רצויים. לכן, תרבית תאים בסביבה תלת ממדי (3D), לעתים קרובות תוך שימוש ברכיבים תאים מטריקס, הגיחה כחלופה מעניינת בשל דמיון הקרוב אל הילידים ברקמות vivo או איבר. פתחנו מערכת תרבית תאי 3D באמצעות שני תאים, כלומר (אני) תא מרכזי המכיל תאים סרטניים מוטבעים מתנהג ג&#39;ל קולגן כגידול macrospherical פסאודו-יסודי (ii) תא היקפי תא ללא עשוי ג&#39;ל הפיברין, כלומר מרכיב תא מטריקס שונה מאלה ששמשו במרכז, שבו תאים סרטניים יכולים לנדוד (מול פלישה) ו / או יוצרים גידולי microspherical המייצג גידולים משניים או בלווין. ההיווצרות של גידולי לווין בתא הפריפריה היאלהפליא בקורלציה פי מידת האגרסיביות ידוע או מוצא גרורתי של תאים סרטניים הילידים, מה שהופך מערכת התרבות 3D זה ייחודי. גישת תרבית תאים זה עשוי להיחשב להעריך הפולשנות תאים סרטניים תנועתיות, אינטראקציות מטריקס-תאיים תא כשיטה להעריך נכסי תרופה אנטי-סרטניים.

כאמור, תכונה מעניינת של assay תרבית תאי 3D זה היא כי תאים סרטניים לא יכולים להעביר רק משקעים קולגן כדי הג&#39;ל הפיברין הסמוך, אלא גם להקים גידולים משניים (למשל, לווין גידול מבנים דמויים). זה ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך בהגדלות נמוכות וגבוהות דרך עובי ג&#39;ל, במיוחד עם מעבה מרחק עבודה ארוכה (איור 2). באמצעות שיטת תרבית תאי 3D זה, התנהגותם של תאים גרורתי ידועים ניתן להשוות בקלות לזה שנמצא בתאים שאינם גרורתי, כפי שהוכחה שוב ושוב עם setups ניסויים שונה 15. לדוגמא, גידולי לווין רבים נמצאים מפוזרים באקראי בתוך הג&#39;ל הפיברין עם B16F10 שורת תאי גרורתי תוך גידולי לווין זעירים מעט מאוד רק יכולים כדי להיות מזוהים עם מקבילו הלא גרורתי, שורת תאי B16F0 (איור 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig2.jpg" /> איור 2:. התנהגות של עכבר מלנומה B16F10 (א) ו B16F0 (ב) תאים בתא 3D מערכת תרבות B16F10 ותא B16F0 קווים ידועים להיות גרורתי בחולשה גרורתי, בהתאמה. מבט העליון של הג&#39;ל מרוכבים מוצג לאחר 15 ימים בתרבות בצלחת 24 גם. תוספת קולגן (*) צמוד שכבת ג&#39;ל הפיברין שבו תאים הגרו (חיצים) ויצרו גידולי לווין כפי שניתן לראות בהגדלה גבוהה יותר. די נוח, שורות תאים אלה מבטאים רמה גבוהה של מלנין המאפשר הדמיה ישירה (כלומר בלי להכתים). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> צורת הגידולים מול הגירה ולווין עשויה להשתנות כתוצאת function של מאפייני שורת התאים. למשל, תאי 4T07 בעכברי חלב בלוט קרצינומה, שהן גרועות גרורתי אבל הם מאוד פולשני מקומיים, לגבש חזית גירה המשתרעת רדיאלית לתוך הג&#39;ל הפיברין (איור 3 א). לאחר 14 ימים של תרבות, התאים האלה התרחקו מהחזית הנודדת ליצירת מבנים בצורת כוכבי הדומי מבנים בלוטת חלב (איור 3-D). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig3.jpg" /> איור 3: תאי 4T07 קרצינומה בלוטת חלב עכבר. תאים אלה להפגין יכולת חזקה כדי להעביר בתוך הג&#39;ל הפיברין (א). השורה המקווקות משרטטת את תקע קולגן החצים מראים את הכיוון של חזית ההגירה. התאים באופן שווה לפלוש מטריקס הפיברין (א), מאורגן היטב, כגלילים מהממים בצורת ניתן לצפות ב -3 D (Bד ג). צפיות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. (A - C) וחתכים היסטולוגית יוכתמו hematoxylin ו eosin (D) מוצגים <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מבני התא ציינו עם מערכת תרבות 3D זה, במיוחד את הגידולים בלווין, ניתן לכמת על ידי הקרנת מישוריים לאחר המכתים בג&#39;לים עם פתרון מתילן כחול כפי שהוצג קודם 16. מכתים דגימות ג&#39;ל עם Hoechst 33258 בשלבים שונים של התרבות התא מאפשר לדמיין את גרעין התא תחת מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה (איור 4). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig4.jpg" /> איור 4: תאי סרטן שד הורמון-Responsive. שד אנושיMCF-7 סרטן התאים נחשפו שונים ריכוזים של טמוקסיפן. גידולים בלוויין ג&#39;לים הפיברין (בשורה העליונה) נצפו על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. דנ&quot;א מן ג&#39;ל קולגן (המעידים על נוכחות של תאים בגידולים פסאודו-יסודי) (בשורה התחתונה), היה מוכתם Hoechst 33258 ו דמיינו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. כצפוי, טמוקסיפן פיצול ה- DNA המושרה כתוצאה אפופטוזיס. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54322/54322fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים </td><td> כֶּרֶך </td></tr><tr><td> 5x DMEM (לא ביקרבונט) כן מאבקת </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.26 M NaHCO 3 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1 N NaOH </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> ddH2O </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> שמור פתרון זה על הקרח </td></tr><tr><td> השעית תא </td><td> 880 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> ובכן לערבב על קרח לבסוף להוסיף במהירות: </td></tr><tr><td> RTT קולגן (3.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נפח כולל </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1:. קולגן תקעים ריאגנטים הנדרש והכנת פתרון קולגן עבור 18-19 המצתים. מערבבים היטב מיד לאחר תוספת של קולגן (על ידי היפוך מיכל למעלה ולמטה), תוך הימנעות בועות אוויר, ואז מיד להפיץ 200 μl היטב כל אחד. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צעדים </td><td><strong&gt; בעיות </td><td> סיבות אפשריות </td><td> פתרונות </td></tr><tr><td rowspan="4"> שלב 1. קולגן תקע </td><td rowspan="2"> בועות אוויר </td><td rowspan="2"> pipetting המתאים * </td><td> מערבב היטב, תוך הימנעות בועות מוגזמות. </td></tr><tr><td> צייר כל 200 μl עם בוכנה פיפטה כל הדרך למטה ולשחרר רק 200 μl (הפוכה pipetting). * </td></tr><tr><td> התכווצות קולגן תקע </td><td> קולגן תקע מתכווץ עם שורות תאים מסוימים, במיוחד כאשר מודגרות לילה. </td><td> בדוק אם התאים לגרום התכווצות קולגן לפני תחילת הניסוי. מומלץ לעקוב אחר התכווצות במשך מספר ימים. אחרת, תקעים רשאים להתנות בתוך הג&#39;ל הדחוקה. </td></tr><tr><td> Gelation אינה מתרחשת </td><td> בדוק ריאגנטים עבור רעננות, molarity, pH, וכו &#39;); לוודא שאף מגיב הושמט. </td><td> להתחיל שוב להתחנןקָדֶנצִיָה. </td></tr><tr><td rowspan="5"> שלב 2. השכבה הראשונה של ג&#39;ל הפיברין </td><td> בועות אוויר </td><td> הערות אותו *; צריך להתאמן. </td><td> אותו פתרון. * בועות אוויר עשויים להישאר בתוך הג&#39;ל הפיברין אבל הם בדרך כלל נעלמים עם הזמן על 37 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gelation אינה מתרחשת </td><td rowspan="2"> כמות שגויה של פיברינוגן בשימוש; לבדוק ריכוז או השפלה תרומבין. </td><td> התחל שוב מהתחלה. </td></tr><tr><td> תניח את תרומבין הפתרון אינו מספק; מעט להגדיל את הריכוז ו / או נפח של תרומבין (למשל, פעמים). </td></tr><tr><td> שלב נוזלי השיורי לאחר gelation </td><td> פתרון פיברינוגן תרומבין לא מעורב היטב. </td><td> התחל שוב מהתחלה. </td></tr><tr><td> הפיברין אינו הומוגני (כלומר מבנים סיביים, agglomerates) </td><td> טרומבין יש מתפזר כהלכה הג&#39;ל; לְשֶׁעָבַרתסיסה cessive או לא מספיק </td><td> צריך בפועל; להתחיל שוב מהתחלה. </td></tr><tr><td rowspan="4"> שלב 3. סנדוויץ / 2 nd שכבת הפיברין </td><td colspan="3"> הערות זהות בשלב 2. </td></tr><tr><td> קולגן הוא תקע (כמה שעות) מוקף במהירות על ידי בשטחים ריקים בתוך הפיברין </td><td> הפיברין לא polymerized כראוי במגע עם ג&#39;ל קולגן </td><td> התחל שוב מהתחלה </td></tr><tr><td rowspan="2"> אטמי קולגן עשוי להיות בהדרגה (ימים-שבועות) מוקף בשטחים ריקים בתוך הפיברין </td><td> תמוגה מקומי; </td><td rowspan="2"> אם היא מוגבלת לכמה מקומות ברחבי התקע, הניסוי יכול להמשיך. אחרת לשקול להתחיל מהתחלה. יכול להיות בגלל התאים מפרישי כמות מוגזמת של activator plasminogen. </td></tr><tr><td> אל תשכחו את סוכן antifibrinolytic! </td></tr><tr><td rowspan="2"> שלב 4 ו -5. celתרבות l ומעקב </td><td> פירוק פיברין </td><td> בעיה עם סוכן antifibrinolytic (שפלה, מינון לא טוב, וכו &#39;.). </td><td> אם כמות נרחבת של גידולי לווין או פלישה, להעלות את המינון של סוכן antifibrinolytic. </td></tr><tr><td> הַחמָצָה </td><td> צמיחת תאים מוגזמת. </td><td> שנה בינוני תרבית תאים בתדירות גבוהה יותר. </td></tr></tbody></table> טבלה 2: פתרון בעיות אפשריות ופתרונות מוצעים..

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation at JoVE.com

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

three-dimensional-culture-assay-to-explore-cancer-cell-invasiveness

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Views.  CHU de Québec Research Centre. Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Video: Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

מודל גידול מאוס של מתח כירורגי כדי לחקור את המנגנונים של דיכוי מערכת חיסוני לאחר ניתוח והערכת immunotherapies Perioperative רומן

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...