This work was supported, in whole or in part, by NIH Grants R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 and T32 DK 007150-38 to AJS and T32 DK 007150-38 to AA. This is original work and is not under consideration elsewhere for publication.

Kan Örneklerinin 1. Koleksiyonu <ol><li> Antekübital fossa önemli bir ven standart olarak damar delinerek (diğer pıhtılaşma önleyiciler göre birçok avantajı vardır) pıhtılaşma önleyici etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden 10 ml&#39;lik plastik tüplere periferal venöz kan örnekleri açlık toplayın. </li><li> kırmızı kan hücreleri ve RNA az miktarda serbest plazma elde etmek için bir masaüstü santrifüj 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1600 x g&#39;de, kan örnekleri santrifüj. </li><li> Sıralı, sırasıyla, kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için WBC ve Trombositler ve 15 dakika daha sonra ilave çıkarmak için 10 dakika boyunca bir sallanan kepçeli rotor içinde 3.000 g (4 ° C) süpernatant santrifüj. </li><li> üretim talimatlarına göre oda sıcaklığında bir dansitometresi kullanılarak plazma yoğunluğunu ölçün. Not: yoğunluk ayarı (d = 1.023 g / ml),% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile eksozomlann çıkarılması ancak önceden yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü sonrası gerekebilir. </li></ol&gt; Plazma 2. Exosome Kaldırma <ol><li> HDL benzer bir yoğunluğa sahip dolaşan eksozomlar çıkarın ve miRNA 3 sayısal olarak önemli bir kaynağını temsil etmektedir. <ol><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kuluçkalandı ve ardından 1 mL plazmaya 252 ul eksozom çökelme çözeltisi ekleyerek bu fazlası. eksozomlar üzerinden pelet için 4 ° C sıcaklıkta 1500 g&#39;de 30 dakika boyunca karışımın santrifüjlenir. </li><li> HDL, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile daha fazla işlenmek üzere bir polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne elde edilen süpernatan transferi 1 mi izole etmek için (aşağı bakınız). </li></ol></li></ol> 3. Yoğunluk Gradient Ultrasantrifügasyon (Şekil 1). <ol><li> HDL sabit açılı rotor 448.811 x G çalışan ve 8 ° C, sırasıyla bir kat ultrasantrifüjdeki kullanan bir 3 aşamalı bir süreci kullanmak ayırmak için. </li><li> Üç farklı yoğunluk çözeltileri, sırasıyla, her izolasyonu için taze hazırlayın. <ol><li> Çözelti A Hazırlama (VLDL izolasyonu, d = 1.006 g / ml) 11.4 gr NaCI (NaCI: 0.195 mol) eritilmesi ile otoklava damıtılmış su 1000 ml, 0.1 g EDTA * 2Na, 1 ml 1 N NaOH. Daha sonra otoklav damıtılmış su ilave 3 ilave edin. </li><li> 100 mi A çözeltisi (NaCI 0.195 mol, NaBr 2.44 mol), 25.2 gr, NaBr ekleyerek Çözelti B hazırlanması (LDL izolasyonu, d = 1.182 g / ml). </li><li> Çözelti A, 100 ml (NaCI 0.195 mol, NaBr 7.7 mol) 78.8 g, NaBr karıştırılarak (d = 1.470 g / ml HDL izolasyonunu) Çözüm C hazırlayın. Bir dansitometresi kullanılarak oda sıcaklığında uygun yoğunluğu onaylayın. sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de, tüm çözümler tutun. </li></ol></li></ol> VLDL 4. İzolasyonu <ol><li> Plazma 1 ml (ortalama yoğunluğu = 1.023 g / ml), 6.5 mi polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne Yağ Kırmızı 7B ve nükleaz bilgilerini 200 ul karıştırın. </li><li> Sonra dikkatlice karışımın üstüne çözelti A 5 ml katman. Gerekirse, çözüm A t üstünde ek Yağ Kırmızı 7B ekleyino Her tüpün ağırlığını dengeleyecek. - 2 saat (5 hızlanma) için santrifüj (yavaşlama - 7). Not: Santrifüj sırasında, lipoproteinler kendi denge yoğunluk bölgelerinde bir bant olarak biriktirilir. </li><li> çalışma sonunda 2 kat gözlemlemek. 4 ° C &#39;de üst tabaka ve mağaza temsil VLDL fraksiyonunun 1.5 mL çıkarın. </li><li> Son olarak, LDL içeren tüpün tabanından bir pipet aktarım işlemlerinin 4 ml kullanılarak, HDL, LDL izolasyonu için yeni bir polikarbonat tüpüne albumin ve yağ asidi fraksiyonu. </li></ol> LDL 5. İzolasyon <ol><li> sırasıyla LDL ve HDL fraksiyonu (bölüm 4) ihtiva eden bir tüpe B çözeltisi ve 100 ul nükleaz serbest yağlı kırmızı 7B 2 ml karıştırın. </li><li> Ardından 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için dışarı santrifüj. Daha sonra, üst tabaka temsil LDL fraksiyonu 1.5 mL çıkarın ve -80 ° C &#39;de 4 ° C ya da mağaza tutun. Son olarak, HDL içeren tüpün tabanından 4 ml aktarmakYeni bir polikarbonat tüp kısmı. </li></ol> HDL&#39;nin 6. İzolasyonu <ol><li> 2 solüsyonu C ml, 100 ul nükleaz serbest yağ Kırmızı 7B sırasıyla, HDL fraksiyonu ihtiva eden bir tüpe% 98 β-merkaptoetanol 15 ul karıştırın. </li><li> 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için santrifüj. Bundan sonra üst tabaka temsil HDL fraksiyonu 2 ml çıkarın ve -80 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de devam veya mağaza ya da. </li></ol> 7. Tuzdan arındırma ve Lipoprotein Fraksiyonlarının Konsantrasyon <ol><li> sonraki agaroz jel elektroforezi ve PCR ile bir girişimi engellemek için, üreticinin talimatlarında belirtildiği şekilde (LDL / HDL için VLDL ve 10K tüp 3K tüp) uygun molekül ağırlığı kesme ile santrifüj filtre cihazları kullanılarak yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon sırasında eklenen aşırı tuz kaldırmak. <ol><li> Kısaca, soğuk bir PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) içinde 2.5 ml eklenmesinden sonra SantrifüjGE tüm VLDL fraksiyon toplandı-sırasında yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme 4 ° C&#39;de bir sallanma kepçe rotor kullanılarak 60 dakika boyunca. </li><li> 30 dakika her biri için 10 ml buz gibi soğuk PBS ile iki kez, LDL fraksiyonu desalt. Daha sonra, HDL fraksiyonu tuzdan arındırma iki kez 13 ml buz gibi soğuk PBS kullanın. yüksek PBS hacmi agaroz jel elektroforezi ile mobiliteyi geliştirmek için gereklidir. Santrifüj işleminden sonra, lipoprotein içeren çözünmüş çıkarın ve 4 ° C&#39;de tutun veya -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol></li></ol> 8. Agaroz Jel Elektroforez <ol><li> şu şekilde üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle kiti kullanılarak lipoprotein agaroz jel elektroforezi perfrom. NOT: Bu adım konsantre lipoprotein örneklerinin kalite ve saflık değerlendirmek için sadece budur. <ol><li> Kısaca, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile tuzdan arındırılmış lipoprotein fraksiyonu 6 ul elde edilir ve bir ön dökme lipoprotein jel üzerine yüklenir. İnsan lipop kullanınboyutu, referans olarak VLDL, LDL ve HDL için rotein standartları. Rep Hazırlık tampon kullanarak 60 dakika boyunca 100 V oda sıcaklığında elektroforez yürütmek. </li><li> 10 dakika için jel Kuru ve yağlı kırmızı 7B ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boyanır. 5 dakika boyunca tekrar metanol-su 75:25 (v / v) ve kuru bir karışımı içinde jel destain. </li></ol></li></ol> 9. RNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması <ol><li> Serum / plazma MiRNA izolasyon ve saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılmış insan HDL ile miRNA&#39;nın izole perfrom. <ol><li> Kısaca, bir vortexer ile karıştırın ve daha sonra nükleoprotein kompleksleri ve RNases inaktivasyonu tam ayrılmasını sağlamak üzere, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırılır, saflaştırılmış HDL 200 ul RNA liziz reaktifi 1 ml. </li><li> (1.6 x 10 8 kopya / ml cel-miR-39) karışım içine daha sonra sentetik Caenorhabditis elegans microRNA 3.5 ul başak. Daha sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA özütleme gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> cevap verecek gerçekleştirinüreticinin talimatlarına göre uzaklaştırma spin kolonların ile ekstre-miRNA üzerinde. Bir spectrophorometer ile saflaştırılmış HDL gelen miRNA konsantrasyonu ölçün. NOT: Spin sütunlarından miRNA sıyrılması RNaz içermeyen su 16 ul kullandı. </li></ol> 10. Ters Transkripsiyon (RT-PCR) <ol><li> HDL&#39;den miRNA&#39;nın 100 ng izole sentetik miRNA (Cel-miR-39) ve ters transkripsiyon kiti kullanılarak ve imalatçının talimatlarına göre bir 20 ul reaksiyon hacmi içinde, ters kopyalanmış ile arttı. </li><li> Şablon miRNA (NTC) olmadan ve ters transkriptaz enzim karışımı (NRT) olmadan uygun kontroller gerçekleştirin. </li></ol> 11. Real-time PCR (QRT-PCR) <ol><li> cDNA 2 seyreltme, 10 ul PCR karışımı, 2 ul genel primer 2 MiRNA primerler ul 4 ul RNaz içermeyen su bir 1: 2 ul 20 ul bir toplam hacim içinde gerçek-zamanlı PCR perfrom. </li><li> Reacti çalıştırın15 saniye ve 30 saniye boyunca 55 ° C ve 30, 70 ° C de uzatma aşaması 94 ° C&#39;de 45 döngü, 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de 96 oyuklu plakalar, içeri üç kez tüm reaksiyonlar perfrom s.ec . </li><li> Sonraki üreticinin talimatlarına göre sentetik temizlik gene normale döndükten sonra 2 -ΔΔ Ct yöntemini kullanarak miRNA calcuate göreceli miktarları. </li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma.">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).</li><li>Vickers, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+185,+96,+and+223+repress+selective+high-density+lipoprotein+cholesterol+uptake+through+posttranscriptional+inhibition.">MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition.</a> Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).</li><li>Rayner, K. J., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+of+high-density+lipoprotein+metabolism+and+function.">MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function.</a> Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+endosomal-derived+vesicles+shipping+extracellular+messages.">Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).</li><li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation.">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li><li>Foreman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+human+serum+lipoproteins+by+single-spin+gradient+ultracentrifugation:+quantification+of+apolipoproteins+B+and+A-1+and+lipid+components.">Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components.</a> J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+LDL-+and+HDL-cholesterol+determined+by+ultracentrifugation+and+HPLC.">Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC.</a> J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).</li><li>Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low+temperature+flotation+method+to+rapidly+isolate+lipoproteins+from+plasma.">low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma.</a> J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).</li><li>Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+apolipoprotein+(a)+and+lipoprotein+(a-)+derived+from+the+dissociation+of+human+plasma+lipoprotein+(a).">Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a).</a> J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).</li><li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR.">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).</li><li>Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNA:+a+new+source+of+biomarkers.">Extracellular microRNA: a new source of biomarkers.</a> Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).</li><li>Stefanie, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+biomarker+profiling+with+microRNAs.">Cancer biomarker profiling with microRNAs.</a> Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).</li><li>Prasun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+promising+biomarkers+in+cancer+diagnostics.">MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics.</a> Biomarker Research. 2 (19), (2014).</li><li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease?.">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease?.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li><li>Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , (2015).</li><li>Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs,+novel+biomarkers+of+acute+myocardial+infarction:+a+systemic+review.">Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review.</a> World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

kandan yeni biyomarkerlerin tanımlanması çeşitli hastalıkların klinik tanı ve prognoz yardımcı olacaktır. MikroRNA&#39;lar biyomarkerların tüm niteliklere sahip olduğu bilinen ve çeşitli çalışmalarla 14-17 de gösterilmiştir. Bu çalışmada, plazma HDL Mirna izole etmek için hızlı ve basit bir kolay bir yöntem gösterilmiştir. VLDL, LDL ve HDL izolasyonu geleneksel yoğunluk gradyanı, ultra-santrifüj yöntemi plazma doğru örnekleme, tampon çözeltisi tam bir şekilde hazırlanması, yoğunluk ve taban lipoprotein fraksiyonları, 8 kantitatif transfer ölçümü bağlıdır. HDL 8 -11 izole etmek için tarif edilmiş bir çok yöntem vardır. Bu yöntemler genellikle çok zahmetli olan veya tuzsuzlaştırma izole lipoproteinler için plazma ve geniş diyaliz büyük hacimli gerektiren ve tamamen miRNA&#39;lar 3 kaynağı olarak eksozomlar ve lipoproteinler çıkarmayın. Bu si kurduk biz bu eksiklikleri gidermek içinmple ve plazma HDL gelen miRNA izolasyon hızlı bir yöntemdir. temel amacı ve bu çalışmanın temel amacı ayırmak ve eritrosit olmadan Ultrasantrifügasyon HDL-miRNA kompleksi izole etmek oldu, ince beyaz tabaka, ekzozomlar, salgı vezikülleri, VLDL, LDL ve Lipoproteinler (a) girişim, daha sonra arıtılmış HDL gelen miRNA&#39;lar izole. HDL ile bu bileşenlerin herhangi kirlenmesi ve parazit beklenen deneysel sonuçlar ve miRNA profilleme verileri değiştirecektir. Kandan DNA RNA ve miRNA&#39;lar izolasyonu nedeniyle karmaşık yapısından çok zor bir iştir. Her zaman hücreler, dokular ve organ örnekleri 18 göre ekstraksiyon ve saflaştırma (miRNA&#39;ların dahil) Nucleic Acids teknik zorluklar çok teşkil edilmiştir. Ayrıca kan hücrelerinin dolaşımdaki mevcut görece daha az miRNA genler vardır. Kan 18 görece daha az olan Eksozomlann, salgı veziküller ve ücretsiz dolaşan miRNA&#39;lar ile birlikte HDL, bilinen bir taşıyıcısıdır. Bu nedenle, daha büyük bir birkan plazma numune hacminin bağlama HDL-MiRNA kompleks işleme ve izolasyon için gereklidir. Buna ek olarak, miRNA&#39;ların ve hedef dizilerin kısa doğal bile zordur standart PCR oligonükleotid teknolojileri ile yeterli bir özgüllük elde etmeyi mümkün kılar. Kanın hücresel bileşenleri her zaman sıcaklık, mikroorganizma ve toksinler veya stres gibi dış ortamda değiştirmek için yanıt olarak miRNA ve mRNA salgılamaya bilirler. Kanda nükleazlar, RNaslar, dolaşımdaki proteinlerin ve diğer enzimlerin varlığı, bu MiRNA izolasyonu etkileyecektir. Mah-PCR ΔΔCt yöntemini kullanırken dolaşan miRNA amplifikasyon aynı zamanda veri normalleşmesi için β-aktin veya GAPDH gibi köklü bilinen temizlik genleri yoksundur. Bu da yine kan serum veya plazma 19 dolaşan profil miRNA için önemli engel bir teşkil etmektedir. Yaygın kısa olmayan kodlama snoRNAs kullanılan ve snRNAs nadiren kan ve bu m cinsinden ifade edilmiştiriç kontrol genler olarak kullanılmasında daha da zor akes. snoRNAs ve snRNAs bu dezavantajları çözmek ve üretici protokolüne göre takip gibi iç kontrol geni olarak tahlillerde Serum / Plazma sentetik Spike-In kontrolü kullanılan herhangi bir teknik zorluklar önlemek için. Herhangi bir spesifik olmayan amplifikasyonu için normalleşme yardımcı olur ve değişiklikler miRNA arıtma ve PCR reaksiyonu 18 sırasında meydana geldi. Hatta miRNA&#39;nın bozulması veya herhangi bir özel MiRNA amplifikasyon sinyalleri yokluğunda, başak in QRT-PCR reaksiyonlarında yükseltmek ve oldukça sabit ve muntazam bir Ct değerine sahip bir beklenen sinyal verecektir kontrol. Üç negatif kontroller ve pozitif kontroller ile birlikte kontrol amplifikasyon başak dayanarak, miR-223 gen için iyi optimum veri doğrulama var. Biz bu basit yöntemle plazma HDL dolaşan miR-223 iyi verim var olduğunu doğruladı. Sonuç olarak, bir yöntem o kurdukPlazma HDL&#39;den miRNA&#39;nın saflaştırılması için β-merkaptoetanol ilavesiyle F yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme (DGUC). Yöntem, bir çok avantaja sahiptir: (a) VLDL, LDL ve HDL 24 gereken diğer yöntemlere karşılaştırın kat ultrasantrifüjdeki tarafından kısa bir süre içinde ayrılır - 96 saat 8-11; (b) LDL ve HDL, diyaliz, tuz giderme / konsantre, 24 veya daha fazla saat 8,9 aldı diğer yöntemler ile karşılaştırın 1 saat içinde yer alır; Lipoproteinler (c) kontaminasyonu HDL fraksiyonu β-merkaptoetanol ile ayrılmış, ancak LDL fraksiyonu kullanılmak üzere tasarlanmamıştır; (D) Gerekli örnek hacmi, tüm aşamalı VLDL, LDL için sadece 1 ml ve HDL izolasyonların daha örnek hacmini gereken diğer yöntemlerle karşılaştırılması; (e) izolasyon sırasında 11 HDL oksidatif hasarı minimize; (F) 12 numune maksimum tek lipoprotein ayırma analitik vadede analiz edilebilir; (G) çıkarılan HDL 250 ul numune hacmi m analiz etmek yeterliIRNA konsantrasyon / saflığı agaroz jel elektroforezi, protein konsantrasyonu, mikrodizi RT-qPCR işlemleri. Bizim yönteminin sınırlamaları HDL-miRNA&#39;nın küçük bir yüzdesi, eksozom çöktürme aşaması esnasında kaybedebilir ve gereken plazma numunesi hacminin HDL-miRNA izole etmek için birden fazla 200 ul olmasıdır. Son olarak, plazma mikroRNAlar sadece dolaşımdaki bozuk veya dönek kan hücrelerinden değil, aynı zamanda sağlıklı, normal kan hücreleri ve vücudun sürekli sağlık durumunun etkilenen çeşitli sağlıklı ve hastalıklı doku ve organların yer aldığı diğer bölgelerinden gelen hücrelerden türetilmiş değildir 20. Bu mevcut çalışma sistematik insan plazmasından izole HDL olgun miR-223 saf olan. Bu çalışma açıkça, oldukça saflaştırılmış HDL plazmada olgun miR-223 seviyeleri böylece büyük ölçüde lipoproteinler, li için futurity testlerinin klinik kullanımının kolaylaştırılması, saptanabilir istikrarlı, tekrarlanabilir ve bireylerin örnek arasında tutarlı olduğunu gösterirver, kardiyovasküler ve diğer metabolik sendromlar. Şaşırtıcı bir şekilde, HDL plazma, özellikle miR-223, olgun miRNA&#39;lar muhtemelen potansiyel saflaştırılmış HDL miR-223 stabilitesini açıklar sindirim ve diğer sert koşullarına nükleaz dirençlidir. RNases için miR-223 direnç mekanizması daha fazla çalışma gerektirmektedir. Açıkçası, bu arıtılmış HDL plazmada miRNA ifade profillerini inceleyerek çeşitli hastalıkların tedavi okuyan geleceğin miRNA belirteçleri üzerine ışık tutacağını. plazmadaki Bu HDL ilişkili mikroRNAlar bir potansiyel klinik tanı biyomarkerların olarak kullanılan ve gelecekte tıp kişiselleştirilebilir.

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs1. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases2. More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier 3, 4. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex 5, 6.
To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs3, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="965">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:172px;">366643</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&#160;</td>
			<td style="width:172px;">75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Densito 30PX densitometer</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:172px;">MT51324450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoQuick solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:172px;">4484451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:172px;">O3237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall WX100 ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:172px;">46902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fat Red 7B&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:172px;">201618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:172px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:172px;">UFC800308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickGel Lipo kit&#160;</td>
			<td>Helena Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:172px;">3344,3544T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL</td>
			<td>LipoTrol; Helena Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">5069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rep Prep buffer&#160;</td>
			<td>Helena Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:172px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MinElute spin columns&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop 1000 analyzer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:172px;">218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Touch real-time PCR detection system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miRNeasy Serum/Plasma Kit</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">217184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miScript Primer Assays</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">141078139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miScript SYBR Green PCR Kit&#160;</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">219610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and simplified method for high through-put isolation of mirna from highly purified high density lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Eksozomlann Cerrahisi Sonrası Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein İzolasyonu Yüksek derecede saflaştırılmış HDL gelen miRNA edinmek için miRNA kontaminasyon 7 kaynağı temsil eksozomlar kaldırmak için gereklidir. Bu ticari olarak temin edilebilir kit ile yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü önce yapıldı. Pratik amaçlar için ticari şirket tarafından geliştirilen bir üç adım standart yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyon protokolü (Şekil 1) modifiye edildi. Bu protokol, 54,000 rpm&#39;de 3, 8, 9 ve 10&#39;a kadar santrifüj kuvvetleri ile yaygın olarak kullanılan protokoller büyük ölçüde daha hızlıdır 140,000 rpm bir hızda bir sabit açılı rotor santrifüj gerektirir. Bir olan yaygın olarak kullanılan T 1270 bir rotor 70.000 rpm maksimum kuvvet, santrifüj ilk santrifüj kuvvetlerine direnmek için başarısız polyallomer tüpleri ile gerçekleştirilmiştir. tüplerin çöküşü önlemek için,polikarbonat borular başarıyla kullanılmıştır. Santrifüj süresi lipoprotein oksidasyonu ve potansiyel miRNA bozulması 11 için kritik öneme sahiptir. 8 ila 96 saatlik bir toplam kadar nedenle çeşitli santrifüj kez test edilmiştir. Santrifüj gerçekleştirildiği hangi Ayrıca temperatürünün, sırası ile santrifüj zaman ve kuvvet, göre ayarlanmıştır. Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein Kesirler saflığı İzole yüksek yoğunluklu lipoprotein fraksiyonları saflığı agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildi. 2. gradyan ultra santrifüj yoluyla izole HDL çıkarma için tipik bir elektroforez sonuçlarını gösterir Şekil. Açıkça HDL, VLDL herhangi kontaminasyon yoksun olduğunu gösterdi ve tipik α-hareketlilik sergiliyor. VLDL ve LDL fraksiyonları herhangi α-göç lipoproteinlerin yokluğu ultracent sırasında HDL gelen tam iyileşme gösteriyorrifugation adım. HDL fraksiyonu, ancak, aynı zamanda bağlı lipoproteinler ile kontaminasyon (Lp (a)) 12 β-hareketlilik, bilinen bir elektroforetik bantlama desenli bir iz göstermiştir. İzole HDL adlı Lp (a) Eleme HDL taşınan miRNA&#39;lar incelenmesi yüksek saflıkta HDL izole edilmesini gerektirmektedir. Lp Girişim (a) HDL ile potansiyel LDL taşınan miRNA&#39;ların ile HDL&#39;nin çapraz kontaminasyon katkıda bulunur. HDL&#39;nin bu kirlenme en aza indirmek için, β-merkaptoetanol, 10 15 ul Son santrifüj aşamasından (Şekil 1) çözeltisi C ilave edildi. Β-merkaptoetanol eklenmesi HDL yoğunluğu özellikleri 10 değiştirmek için gösterilmiştir. Şekil 3&#39;te de gösterildiği gibi, β-merkaptoetanol eklenmesi Lp (a) çok etkili bir şekilde çıkarılması ile tutarlı bir B-göç lipoproteinlerin olmaması ile sonuçlandı. miRNA Arıtma HDL dan miRNA&#39;nın izolasyonu ilk yaygın kandan RNA ekstraksiyonu için kullanılır kullanılarak parçalama reaktifi denendi. Bu yöntem çok iyi bir RNA verimi (91,45 ng / ul) ama sonra sonuçlandı rağmen spektrofotometrik analiz yetersiz RNA saflık gösterdi. fenol kaldırarak izole RNA&#39;nın ek arıtma saflığını gelişmiş ama RNA verimi artık anlamlı olarak düşüktü. Daha sonra, bir kit olarak kabul edilebilir bir RNA saflık (1.7 260/280 nm oranı), fakat RNA verimi 26 kat daha düşük liziz reaktifi (3.45 genel 91,45 ng / ul) ile karşılaştırılmıştır gösterdi test edilmiştir. (1.6 260/280 nm oranı 48.2 ng / | il) ve bu nedenle, bu ekstraksiyon prosedürü, daha sonra izole edilmiş Mirna saptanması için kullanılan bir verimle olarak kabul edilebilir bir RNA saflığı en iyi sonuçlar miRNeasy serum / plazma kit ile elde edilmiştir HDL lipoprotein fraksiyonu. <p class="jove_content" fo:kBu yöntemle arıtılmış insan HDL taşınan miRNA&#39;lar ölçmek için fizibilite göstermek için eep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt;, biz miR-223 yükseltmek için seçti. MiR-223 HDL 3 kargo tespit edilmiştir ve HDL kolesterol alımını 5 bastırmak gösterilmiştir çünkü bu miRNA seçildi. Şekil 4A. PCR miR-223 için tepki ve optimizasyonu sonrası bazal eşik ve eşik döngüsü değerlerini karşılaştırarak amplifikasyon eğrileri tipik bir günlük grafiğini göstermektedir çivili-Cel-mir-39. Plazmadaki miRNA bilinen normalizasyon kontrol hiçbir çalışma vardır, bu sentetik gen, iç kontrol olarak kullanıldı. Buna ek olarak, RNU6-2, RNU-48 gibi pek çok olası endojen hazırlık geninin, HY3 tespit edilememiştir ve SNORD95 saflaştınlmış HDL tespit edilebilir, ancak, miR-223 ve SNORD95 Ct değerleri arasındaki fark (en az beş veri gösterilemiyor). Şekil 5&#39;de gösterilen Erime eğrisi analizi açıkça tek bir belirgin gösterirYukarıdaki PCR seçici bir miRNA amplifikasyonu ile tutarlı en yüksek. Şekil 4B. Gösterildiği gibi, miR-223 ve referans hem Cel-Mir-39 sürekli olarak altı Pro bantlar tespit edilebilir. Tüm bireyler arasında nispeten küçük varyasyonları miR-223 ile karşılaştırıldığında Cel-mir-39 gözlenmiştir. Bu bulgular, MiRNA yük algılama sağlamak için, yüksek saflıkta HDL izole destekler. Saf HDL miR-223 Algılama Gerçek zamanlı kantitatif PCR yöntemi tek iplikli miRNA çift saç tokası yapısı miRNA öncüleri ölçmek için kullanıldı. Bu yöntem, bir ileri / geri gene özgü primerleri ve cDNA&#39;ya miRNA&#39;nın saç tokası yapısını dönüştürmek için ısıya dayanıklı bir ters transkriptazı gerekmektedir. cDNA daha sonra yükseltilir ve SYBR Green algılama yardımıyla gerçek zamanlı QPCR kullanılarak ölçüldü. serum, plazma ve arıtılmış, HDL plazma mikroRNA profile doğru olabilirEd MiRNA RT-PCR Sistemi kullanılarak. Ortalama miR-223 gen ifadesinin deneysel ürünü saflaştırılmış HDL 30.9 bir Ct değeri gösterdi ve karşılık gelen negatif kontroller kesme 35 üzerindedir (NTC = 38.1 Ct değeri, NRT ve NAC amplifiye değil). Bu deneyde, düşük erime sıcaklığına sahip saflaştınlmış HDL örneklerinde primer-dimer oluşumunu testere (Mir-223 73 ° C ve 75.5 ° C Cel-miR-39) ve spesifik MiRNA deneyleri daha yüksek CT değeri (Tablo 1). Tablo 1 &#39;de primer-dimerler için çözelti içinde primerler yüksek konsantrasyonu, muhtemelen ortaya çıkar. Astar moleküller 30 PCR döngüsü 13 sonra birbirlerine taktığınızda Bu çoğunlukla oluşur. Bu onları yok templat (diğer astar moleküllere ve yürürlükte tavlama doğrusal mini şablonlar olmak ve daha yüksek arka plan neden olur ve C t değeri &lt;NTC için 40 kuşağının yol açabilir sağlare kontrolü) örnekleri. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54257/54257fig1.jpg" /> Şekil 1. HDL İzolasyon Prosedürü şematik gösterimi. HDL, üç santrifüj adımları bir dizi yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile elde edilmiştir. Yoğunluk gradyanı lipoprotein bantları ve orta kısımların dağılımı gösterilmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54257/54257fig2.jpg" /> Β-merkaptoetanol içermeyen İzole Lipoproteinler Şekil 2. Agaroz jel elektroforez. VLDL, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile izole LDL ve HDL kısımlarındaki Çözelti Cı demonst için β merkaptoetanol eklemedenHDL fraksiyonu, Lp (a) &#39;nın varlığını değerlendirmek. Geçitler 1, 2, 9 ve 10, her boyut işaretleyici temsil eder; Şerit 3/4, 5/6 ve 7/8 sırasıyla VLDL, LDL ve HDL temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54257/54257fig3.jpg" /> Β-merkaptoetanol ile yalıtılmıştır. Son santrifüj aşamasından önce çözelti C β merkaptoetanol ekleme HDL Şekil 3. Agaroz jel elektroforezi HDL fraksiyonuna (a) Lp kaldırıldı. Her bir boyut işaretleyici temsil 9 ve 10, sütun 1, 2; Şerit 3-8 HDL temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 4. Amplifikasyon İki Farklı miRNA&#39;ların Arsa ve Cel-miR-39 ve miR-223 ifadesi. Tarif edildiği gibi (A) Gerçek zamanlı kantitatif PCR izole HDL kullanılarak gerçekleştirilmiştir. PCR 45 döngü ve eğri eşiği C T -Değer olduğu kesiştiği noktaya çalıştırılmıştır. Veri ekspresyonunu göstermektedir Cel-miR-39 (sol panel) ve miR-223 (sağ panel), sırasıyla. Yatay çizgi algılama eşiği temsil etmektedir. 35 kişilik bir döngü sayısı pozitif yükseltilmesi için kesim olarak belirlenmiştir. 6 örneklerden elde edilen izole HDL (B) Temsilcisi real-time PCR veri gösterilir. Ham Ct değerleri olan ekspresyon düzeyleri, farklı bir donörden 6 numuneler, her biri arasında saflaştırılmış HDL plazma fraksiyonunda az 2 Ct değeri değişir Cel-miR-39 ve miR-223 için gösterilmiştir anlamına gelir. İfade profilleme PCR Sistemi ve İnsan Serum &amp; Plazma mirn kullanılarak gerçekleştirildiBir Mah-PCR. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54257/54257fig5.jpg" /> Cel-miR-39 ve miR-223 için Şekil 5. Erime eğrileri. Gösterildiği gibi, tek bir tepe noktası varlığı. Cel-miR-39 (sağ panel) ve miR-223 (sol panel), sırasıyla, belirli bir amplifikasyon gösterir <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig5large.jpg" target="_blank">lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54257/54257table1.jpg" /> Negatif ve pozitif sentetik Cel-miR-39 kontrol ve miR-223 serum, plazma, cDNA özelliği ve saflaştırılmış HDL fraksiyonu Tablo 1. Sıra CT değeri. NTC (No template kontrolü), NRT (No ters transkripsiyon enzim), NAC (Mah-PCR yok amplifikasyon kontrolü, sadece su ve reaktif).

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein at JoVE.com

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

MikroRNA&#39;lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA&#39;ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University.  MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik. 

Video: Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Toz numuneler mutlak Kuantum Verimi Ölçümü

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.