This work was supported, in whole or in part, by NIH Grants R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 and T32 DK 007150-38 to AJS and T32 DK 007150-38 to AA. This is original work and is not under consideration elsewhere for publication.

혈액 샘플 1. 컬렉션 <ol><li> 전주 포사에서 눈에 띄는 정맥의 표준 정맥 천자에 의해 (다른 항응고제에 비해 몇 가지 장점이 있습니다) 항응고제 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 10 ML의 플라스틱 튜브에 말초 정맥 혈액 샘플을 금식 수집합니다. </li><li> 적혈구 및 RNA 소량의 자유 혈장을 얻었다 탁상 원심 분리기로 4 ℃에서 20 분 동안 1,600 XG에서 혈액 샘플을 원심 분리기. </li><li> 순차적으로 각각 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 WBC 및 혈소판 15 분 후 추가를 제거하는 10 분 동안 스윙 버킷 로터에서 3,000g (4 °에 C)에서 상층 액을 원심 분리. </li><li> 제조 지시에 따라 RT에서 농도계를 이용하여 플라즈마의 밀도를 측정한다. 주 : 농도 조정 (d = 1.023 g / ㎖) 0.9 % 식염수 용액 엑소 좀을 제거하지만, 종래 밀도 구배 초 원심 분리 후 필요하다. </li></올&gt; 플라즈마 2. 엑소 좀 제거 <ol><li> HDL 유사한 밀도가 순환 엑소 좀을 제거하고 miRNA의 (3)의 양적 중요한 소스를 나타냅니다. <ol><li> 4 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 1 ml의 플라즈마에 252 ㎕의 엑소 좀 침전 솔루션을 추가하여이 작업을 수행합니다. 엑소 좀을 펠릿, 4 ℃에서 1,500g에서 30 분 동안 혼합물을 원심 분리. </li><li> HDL, 밀도 구배 초 원심 분리하여 더 처리 카보네이트 두꺼운 초 원심 분리 튜브에 얻어진 상등액 전송 한 용액을 분리 (아래 참조). </li></ol></li></ol> 3. 밀도 구배 초 원심 분리 (그림 1). <ol><li> HDL은 고정 각 로터 448,811 X G에서 동작하는 8 ° C 각각과 바닥 초 원심 분리기를 사용하는 3 단계 프로세스를 사용하여 분리해서한다. </li><li> 세 가지 다른 밀도 솔루션 순차적으로 각각의 분리를위한 신선한를 준비합니다. <ol><li> 용액 A를 준비 (VLDL의 분리 D = 1.006 g / ㎖) 11.4 g의 NaCl (염화나트륨 : 0.195 몰)을 용해하여 멸균 증류수 1,000 ㎖에 0.1 g의 EDTA2Na 1 ml의 1N NaOH를합니다. 그런 다음 멸균 증류수의 추가 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 100 ㎖ 용액 A (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 2.44 몰)을 25.2 g의 NaBr은을 추가하여 용액 B를 준비 (LDL의 격리, D = 1.182 g / ㎖). </li><li> 용액 A의 100 ㎖ (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 7.7 몰) 78.8 g의 NaBr은을 혼합하여 (D = 1.470 g / ㎖ HDL의 분리) 솔루션 C를 준비합니다. 농도계를 사용하여 실온에서 적절한 밀도를 확인합니다. 더 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 솔루션을 보관하십시오. </li></ol></li></ol> VLDL 4. 분리 <ol><li> 플라즈마 1 ㎖ (평균 밀도 = 1.023 g / ㎖) 6.5 ㎖의 폴리 카보네이트 두꺼운 벽으로 둘러싸인 초원 심 분리기 튜브에 지방 레드 7B와 뉴 클레아 무료 200 μl를 섞는다. </li><li> 조심스럽게 혼합 위에 A 액 5 ㎖ 계층. 필요한 경우, 용액 A의 t의 상단에 추가로 지방 레드 7B를 추가O 각 튜브의 무게 균형. - 2 시간 (5 가속도)에 대한 원심 분리기 (감속 - 7). 주 : 원심 동안 지단백질가 평형 농도 영역에서 대역으로 축적된다. </li><li> 실행의 끝에서 2 층을 관찰합니다. 4 ° C에서 상단 층 및 저장소를 나타내는 VLDL 분획의 1.5 ml의를 제거합니다. </li><li> 마지막으로, LDL을 포함하는 튜브의 바닥으로부터 피펫 전사 4 용액을 이용하여, HDL, LDL을 분리하기위한 새로운 폴리 카보네이트 튜브 알부민 및 지방산 분획. </li></ol> LDL 5. 분리 <ol><li> 각각 LDL과 HDL 비율 (4 절)를 포함하는 튜브에 용액 B 100 ㎕를 뉴 클레아 무료 지방 레드 7B 2 ㎖를 섞는다. </li><li> 그런 다음 3 시간 (가속 9, 감속 7)을 위해 밖으로 원심 분리기. 그 후, 상단 층을 나타내는 LDL 분획의 1.5 ml의 제거 및 -80 ° C에서 4 °의 C 또는 저장하시오. 마지막으로, HDL을 함유하는 튜브의 바닥에서 4 ml의 전송새로운 폴리 카보네이트 튜브 부분. </li></ol> HDL 6. 분리 <ol><li> 이 용액 C의 용액, 100 μL 클레아없는 지방 레드 7B 및 각각 HDL 분획을 함유하는 튜브에 98 % β 메르 캅토 에탄올의 15 μl를 섞는다. </li><li> 3 시간 (가속 9, 감속 7)에 대한 원심 분리기. 그 후, 상부 층을 나타내는 HDL 분획이 용액을 제거하고 -80 ℃에서 4 ℃에서 보관하거나 저장하거나. </li></ol> 7. 탈염 및 지단백질 분획의 농도 <ol><li> 이후의 아가로 오스 겔 전기 영동 및 PCR과의 간섭을 방지하기 위해, 제조업체의 지침에 의해 설명 된 바와 같이 (LDL / HDL에 대한 VLDL 및 10K 튜브에 대한 3K 관) 적절한 분자량의 컷오프와 원심 필터 장치를 사용하여 밀도 구배 초 원심 분리 동안 추가 과도한 소금을 제거합니다. <ol><li> 간단히, 차가운 PBS (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCL, 8 밀리미터의 Na2HPO4, 2 mM의 KH2PO4, pH를 7.4) 2.5 ml에 추가 한 후 centrifuGE 전체 VLDL 분획 수집-동안 밀도 구배 초 원심 분리 4 ° C에서의 스윙 버킷 회 전자를 사용하여 60 분 동안. </li><li> 30 분마다 10 ml의 빙냉 PBS로 두 번 LDL 분획을 탈염. 다음으로, HDL 분획을 탈염 두 번 13 ml의 얼음 차가운 PBS를 사용합니다. 높은 PBS 부피는 아가 로스 겔 전기 영동으로 이동도를 개선하는 것이 필요하다. 원심 분리 후, 지질 단백질 함유 용질을 제거하고 4 ° C에서 보관 또는 -80 ° C에 저장됩니다. </li></ol></li></ol> 8. 아가 로스 젤 전기 영동 <ol><li> 다음과 같이 제조업체의 지침의 약간의 수정과 함께 키트를 사용 지단백 아가로 오스 겔 전기 영동을 Perfrom. 참고 :이 단계는 집중 지질 단백질 샘플의 품질과 순도를 평가하기 위해 단지이다. <ol><li> 요약하면, 밀도 구배 초 원심 분리하여 탈염 지단백질 분획 6 μl를 구해서 미리 주조 지단백질 젤 상에 로딩. 인간의 lipop를 사용하여크기 기준으로 VLDL, LDL과 HDL에 대한 rotein 표준. 담당자 준비 버퍼를 사용하여 60 분 동안 100 V에서 RT에서 전기 영동을 수행하십시오. </li><li> 10 분 동안 겔을 건조하고 지방 레드 7B와 함께 RT에서 10 분 동안 염색. 5 분 동안 다시 메탄올 - 물 75:25 (v / v)의 건조 혼합물에 겔 Destain. </li></ol></li></ol> 9. RNA 추출 및 정제 <ol><li> 혈청 / 플라즈마 miRNA의 분리 및 정제 키트를 사용하여 정제 된 인간의 HDL에서의 miRNA의 분리를 Perfrom. <ol><li> 간단히하는 vortexer를 혼합 한 후 핵 단백질 복합체 및 RNases의 불 활성화의 완전한 분리를 보장하기 위해 RT에서 5 분 동안 배양, 정제 HDL 200 μL에 RNA 용해 시약 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> (1.6 × 10 8 복사 / μL CEL-은 miR-39) 혼합물에 다음 합성 Caenorhabditis 엘레 간스 마이크로 RNA의 3.5 μl를 스파이크. 그런 다음, 제조자의 지시에 따라 RNA의 추출을 실시한다. </li></ol></li><li> purificati를 수행제조업체의 지침에 따라 용출 스핀 열 추출-miRNA의의에. spectrophorometer와 정제 HDL에서의 miRNA의 농도를 측정한다. 참고 : 스핀 컬럼에서의 miRNA의 용출 된 RNase없는 물 16 μl를 고용했다. </li></ol> 10. 역전사 (RT-PCR) <ol><li> HDL에서의 miRNA 100 NG를 분리하여 miRNA의 합성 (CEL-은 miR-39)과 역전사 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 20 ㎕의 반응 부피로 역전사 타서. </li><li> 템플릿의 miRNA (NTC)없이 역전사 효소 믹스 (NRT)없이 적절한 제어를 수행합니다. </li></ol> 11. 실시간 PCR (QRT-PCR) <ol><li> cDNA를 2 희석, 10 ㎕의 PCR 혼합물, 2 μL 유니버설 프라이머 2의 miRNA 프라이머 μL, 4 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 물 : 1 2 ㎕를 20 ㎕의 총 부피로 리얼 타임 PCR을 Perfrom. </li><li> 를 Reacti을 실행15 초, 30 초 동안 55 ° C 및 30 ~ 70 ° C의 확장 단계에 94 ° C의 45주기 다음 15 분 동안 95 ° C에서 96 웰 플레이트에서의 삼중의 모든 반응을 Perfrom s.ec . </li><li> 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 합성 하우스 키핑 유전자에 정상화 후 2 -ΔΔ 코네티컷 방법을 사용하여 miRNA의의 Calcuate 상대적인 양. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

혈액에서 새로운 바이오 마커의 식별은 각종 질병의 임상 진단 및 예후에 도움이됩니다. 마이크로 RNA는 바이오 마커의 모든 자질을 가지고하는 것으로 알려져하고 다양한 연구 14-17에 표시되어있다. 이 연구에서 우리는 플라즈마 HDL에서의 miRNA를 분리하기 위해 신속하고 간단한 쉬운 방법을 증명하고있다. VLDL, LDL 및 HDL의 분리의 종래의 밀도 구배 초 원심 분리 방법은, 플라즈마의 정확한 샘플링 완충액 정밀 제조, 밀도 및 하부 지단백질 분획 8 정량적 전송 측정에 의존한다. HDL 8 -11을 분리 설명 된 여러 가지 방법이 있습니다. 이러한 방법은 종종 매우 힘든 중 하나 또는 탈염 고립 지질 단백질에 대한 플라즈마 및 광범위한 투석의 많은 양을 필요로 완전히의 miRNAs 3의 소스로 엑소 좀과 지질 단백질을 제거하지 마십시오. 이시를 설립 우리는 이러한 단점을 해결하기 위해mple 플라즈마 HDL에서의 miRNA의 분리의 빠른 방법. 주요 목표와 본 연구의 주요 목적은 분리 적혈구없이 초 원심 분리에 의해 HDL-miRNA의 복합체를 분리하는 것이 었습니다, 버피 코트, 엑소 좀, 분비 소포, VLDL, LDL과 지방 단백질 (a)에 간섭하고 정제 된 HDL에서의 miRNAs는 분리. HDL와 이러한 구성 요소의 오염의 간섭이 예상되는 실험 결과 miRNA의 프로파일 데이터를 변경한다. 혈액에서 DNA, RNA와의 miRNAs의 분리로 인해 복잡한 특성으로 매우 어려운 작업입니다. 그것은 항상 세포, 조직 및 장기 샘플 (18)에 비해 추출 및 정제 (의 miRNAs 포함) 핵산의 기술 과제의 많은 제기되고있다. 또한 혈액 세포 순환 존재 상대적의 miRNA 유전자들이있다. 혈액은 18 상대적으로 적게 엑소 좀, 분비 소포 무료 순환의 miRNAs와 함께 HDL에 대한 알려진 캐리어입니다. 따라서, 큰혈액 혈장 샘플 볼륨의 마운트는 HDL-miRNA의 복합체의 처리 및 분리가 필요합니다. 또한 miRNA가 그들의 표적 서열의 짧은 본​​질은 어려운 표준 PCR 올리고 뉴클레오타이드 기술 충분한 특이성을 달성 할 수있다. 혈액의 세포 성분은 항상 온도, 미생물 및 독소 나 스트레스를 포함한 외부 환경의 변화에​​ 대응하여 miRNA의와 mRNA의 분비 알고 있습니다. 또한 혈액 클레아 제, RNases, 순환 단백질과 다른 효소의 존재는 이러한 miRNA의 분리에 영향을 미칠 것입니다. QRT-PCR의 ΔΔCt 방법을 사용하는 동안 순환 miRNA의 증폭은 데이터 정상화를위한 β - 굴지 또는 GAPDH 같은 잘 설립 알려진 하우스 키핑 유전자 없다. 이는 다시 혈액의 혈청 또는 혈장 (19)를 순환에서 프로파일의 miRNA의 주요 장애물 중 하나 포즈. 일반적으로 짧은 비 코딩 snoRNAs를 사용 snRNAs는 거의 혈액이 m로 표시되지 않습니다내부 통제 유전자로를 활용에 더 어려운 AKE를. snoRNAs 및 snRNAs의 이러한 단점을 해결하기 위해 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 다음과 같이 우리가 내부 통제 유전자와 분석에서 혈청 / 플라즈마 합성 스파이크-에서 컨트롤을 사용하는 기술적 인 문제를 방지 할 수 있습니다. 그것은 어떤 비특이적 증폭 정상화에 도움 변화가 miRNA의 정화 및 PCR 반응 (18) 동안 오류가 발생했습니다. 비록 miRNA의 열화 또는 특정 miRNA의 증폭 신호의 부재의 경우에, 스파이크의 QRT-PCR 반응에서 증폭 상당히 일정하고 균일 코네티컷 값과 예상 된 신호를 제공한다 제어. 세 개의 음성 대조군과 양성 대조군과 함께 제어 증폭의 스파이크를 바탕으로 우리는은 miR-223 유전자에 좋은 최적의 데이터 유효성 검사를 얻었다. 이것은 우리가이 간단한 방법에서 플라즈마 HDL을 순환에서은 miR-223의 좋은 수율을 가지고 있음을 확인. 결론적으로, 우리는 방법 O를 설립혈장 HDL로부터 miRNA의 정화용 β 머 캅토 에탄올의 첨가 F 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC). 이 방법은 몇 가지 장점이있다 : (a) VLDL, LDL 및 HDL 24해야하는 다른 방법과 비교 바닥 초 원심 분리기에 의해 단시간에 분리 - 96 시간 8-11; (b)는 LDL과 HDL 투석, 탈염 / 농축, 24 시간 이상 8,9했다 다른 방법과 비교 1 시간 내에 일어날; 지단백질 (c) 오염 HDL 분획 β 머 캅토 에탄올로 제거되지만 LDL 분획에 사용되는 것은 아니다; (d)는 요구되는 샘플 부피는 모두 단계적 VLDL, LDL에만 한 용액이며 HDL 아이솔레이션 개 시료 부피를 필요로하는 다른 방법과 비교; (전자)은 분리 11시 HDL에 산화 적 손상을 최소화; (F) 12 샘플의 최대 단일 지단백질 분리 분석 실행을 분석 할 수있다; (g) 추출 된 HDL의 250 μL 샘플 볼륨 m을 분석하기에 충분IRNA 농도 / 순도, 아가 로스 겔 전기 영동, 단백질 농도, 마이크로 어레이와 RT-qPCR의 절차. 우리의 방법의 한계는 HDL-miRNA의 작은 비율은 엑소 좀 침전 단계에서 잃을 수 있으며, 필요한 플라즈마 샘플 볼륨이 HDL-miRNA를 격리하는 200 개 이상의 μl를해야한다는 것입니다. 마지막으로, 플라즈마 마이크로 RNA에만 순환 손상 또는 배신자 혈액 세포에서뿐만 아니라 건강한 정상 적혈구와 신체의 지속적인 건강 상태에 의해 영향을받는 다양한 건강과 질환 조직 및 기관을 포함하는 신체의 다른 부분에서 세포로부터 유래하지 (20)이 본 연구는 체계적으로 인간 혈장의 격리 HDL에서 성숙은 miR-223를 정제하고있다. 이 연구는 명확하게 고순도 HDL 플라즈마의 성숙은 miR-223의 수준은 이에 크게 지질 단백질, 리튬에 대한 미래 검사의 임상 적 사용을 촉진, 검출 안정, 재현성 및 개인 샘플 간의 일관성이 있는지 보여줍니다버전, 심장 혈관 및 기타 대사 증후군. 놀랍게도, HDL 플라즈마에서 특히은 miR-223 성숙의 miRNAs는, 아마 잠재적으로 정제 HDL 미르-223의 안정성을 설명 소화와 다른 가혹한 조건을 클레아에 내성이다. RNases에은 miR-223의 저항의 메커니즘은 더 많은 연구를 필요로한다. 물론, 이러한 정제 HDL 플라즈마에서의 miRNA 발현 양상을 연구하는 다양한 질병을 연구 미래 miRNA의 마커에 빛을 흘릴 것입니다. 혈장 HDL 연관된 이러한 마이크로 RNA는 잠재적 임상 진단 바이오 마커로서 사용하고 향후 약을 개인화 할 수있다.

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs1. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases2. More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier 3, 4. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex 5, 6.
To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs3, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:172px;">366643</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&#160;</td>
			<td style="width:172px;">75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Densito 30PX densitometer</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:172px;">MT51324450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoQuick solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:172px;">4484451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:172px;">O3237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall WX100 ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:172px;">46902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fat Red 7B&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:172px;">201618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:172px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:172px;">UFC800308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickGel Lipo kit&#160;</td>
			<td>Helena Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:172px;">3344,3544T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL</td>
			<td>LipoTrol; Helena Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">5069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rep Prep buffer&#160;</td>
			<td>Helena Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:172px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MinElute spin columns&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop 1000 analyzer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:172px;">218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Touch real-time PCR detection system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miRNeasy Serum/Plasma Kit</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">217184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miScript Primer Assays</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">141078139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miScript SYBR Green PCR Kit&#160;</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control</td>
			<td style="width:279px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:172px;">219610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and simplified method for high through-put isolation of mirna from highly purified high density lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

엑소 좀 제거 후 고밀도 지단백의 분리 고순도 HDL에서의 miRNA를 얻으려면이 miRNA의 오염 (7)의 소스를 대표하는 엑소 좀을 제거 할 필요가있다. 이것은 상업적으로 이용 가능한 키트 밀도 구배 초 원심 분리에 앞서 수행 하였다. 실용적으로 상업 회사에 의해 개발 된 3 단의 ​​표준 밀도 구배 초 원심 프로토콜 (도 1)를 변형시켰다. 이 프로토콜은 54,000 rpm으로 3, 8, 9, 10까지의 원심 분리 힘으로 일반적으로 사용되는 프로토콜보다 상당히 빠르다 140,000 rpm의 속도로 고정 각 로터로 원심 분리를 필요로한다. A의 널리 사용할 T-1270 로터를 채용 70,000 rpm으로 최대 힘 원심 분리는 처음 원심 분리 힘 레지스트 못했다 polyallomer 튜브 행했다. 튜브의 붕괴를 방지하기 위해,폴리 관이 성공적으로 사용되었다. 원심 분리 시간은 지단백의 산화 및 잠재적으로 miRNA의 저하 (11)에 대한 중요하다. 8 내지 96 시간의 총 레인 징 따라서 여러 번 원심 분리, 테스트 하였다. 원심 분리가 수행되었을 때의 온도 또​​한 각각 원심 시간 및 힘에 기초하여 조정되었다. 고밀도 지단백질 분획의 순도 절연 고밀도 지단백질 분획의 순도는 아가로 오스 겔 전기 영동으로 확인 하였다. 2. 구배 초 원심 분리에 의해 격리 HDL 빼기위한 전형적인 전기 영동 결과를 도시한다. 그것은 분명 HDL이 VLDL의 오염은없는 것으로 나타났다 전형적인 α-이동성을 나타낸다. VLDL 및 LDL 분획의 모든 α-마이그레이션 지질 단백질의 부재는 ultracent 동안 HDL의 완전한 회복을 보여줍니다rifugation 단계. 고밀도 지단백 분획 그러나 인해 오염 지단백질 (LP (a)) (12)에 β-이동성 공지 영동 줄무늬 패턴의 일부 추적 하였다. 격리 HDL에서 LP (a)의 제거 HDL에서 수행의 miRNAs를 공부하는 것은 가장 높은 순도의 HDL의 분리가 필요합니다. 지단백의 간섭 (a)는 HDL과 LDL 잠재적에서 수행의 miRNAs와 HDL의 교차 오염에 기여한다. HDL이 오염을 최소화하기 위해, β 머 캅토 에탄올 (10)의 15 μL 마지막 원심 분리 공정 (도 1) 중 용액 C를 첨가 하였다. β 머 캅토 에탄올의 첨가는 HDL 농도 특성 (10)를 변경하지 않는 것으로 나타났다. 도 3에 표시된 바와 같이, β 머 캅토 에탄올의 첨가는 LP (a) 매우 효과적으로 제거와 일치하는 B-이주 지단백질의 부재의 결과. &quot;1&quot;&gt;의 miRNA의 정화를 HDL에서 된 miRNA의 분리는 초기에 일반적으로 혈액으로부터 RNA 추출을 위해 사용되는 이용 용해 시약을 시도 하였다. 이 방법은 아주 좋은 RNA 수율 (91.45 NG / μL)이 아니라 후 결과 있지만 분광 분석은 만족스럽지 못한 RNA의 순도를 보여 주었다. 페놀을 제거하여 분리 된 RNA의 추가의 정제하여 순도를 향상되지만 RNA 수율 이제 크게 낮았다. 다음으로, 다른 키트는 허용 RNA 순도 (1.7의 280 분의 260 nm의 비율)하지만, RNA 수율이 26 배 낮은 용해 시약 (3.45 대 91.45 NG / μL)과 비교 하였다을 보여 주었다있는 테스트되었습니다. (1.6의 260/280 nm의 비율 48.2 NG / μL) 따라서이 추출 과정 이후 격리에서의 miRNA의 검출을 위해 사용 된 양호한 수율로 허용되는 RNA 순도에 대한 최상의 결과를 miRNeasy 혈청 / 혈장 키트 얻었다 HDL 지단백질 분획. (3)화물에서 확인하고, HDL 콜레스테롤 흡수 (5)를 억제하는 것으로했기 때문에이 miRNA의이 선택되었다. 그림의 4A. PCR을의 미르-223에 대한 반응의 최적화 후베이스 라인 임계 값 및 임계 사이클 값을 비교 증폭 곡선의 전형적인 로그 플롯을 표시 아군 된 CEL-미르-39. 플라즈마에서의 miRNA 알려진 정규화 제어에 대한보고가없는 한 이러한 합성 유전자는 내부 대조군으로서 사용 하였다. 또한, RNU6-2, RNU-48과 같은 몇 가지 잠재적 인 설립 내생 하우스 키핑 유전자, HY3가 감지 할 수없는 및 SNORD95는 정제 HDL 검출 할 수 있지만, 미르-223과 SNORD95의 코네티컷 값의 차이 (5 개 미만이다 데이터) 미도. 그림 5에 도시 녹는 곡선 분석은 분명히 하나의 뚜렷한 표시앞의 PCR의 선택의 miRNA의 증폭과 일치 피크. 도 4b. 도시 된 바와 같이, 결과 miR-223 및 기준 모두 CEL-미르 39 일관 여섯 프로 대역에서 검출 될 수있다. 모든 개인 사이의 비교적 작은 변형은 miR-223에 비해 CEL-미르-39 관찰되었다. 이러한 연구 결과는 miRNA의화물을 검출 할 수 있도록 고순도 HDL의 격리를 지원합니다. 정제 된 HDL 미르-223의 검출 실시간 정량적 PCR 법은 단일 가닥의 miRNA 이중 헤어핀 구조의 miRNA 전구체를 정량화 하였다. 이 방법은 정 / 역 유전자 특이 프라이머 및 cDNA를로의 miRNA의 머리 핀의 자형 구조를 변환하는 내열성 역 효소를 필요로한다. cDNA를 연속적으로 증폭 SYBR 그린 검출의 도움으로 실시간 qPCR에를 사용하여 정량 하였다. 혈청, 혈장 및 정제 HDL 플라즈마에서 마이크로 RNA는 PROFIL 정확하게 할 수있다에드는 miRNA의 RT PCR 시스템을 사용. 평균은 miR-223 유전자 발현의 우리의 실험 제품은 정제 HDL에 30.9의 코네티컷 값을 보였고, 그 대응하는 음성 대조군은 차단 35 이상이었다 (NTC = 38.1 코네티컷 값, NRT 및 NAC는 증폭되지 않았다). 이 실험에서는, 저 융점 온도 정제 HDL 샘플에 프라이머 - 이량 체 형성을보고 (미르 - 223 73 ° C 및 75.5 ° C CEL-은 miR-39) 및 특정의 miRNA 분석법보다 C의 t 값 (표 1). 표 1의 프라이머 - 다이머 때문에 용액 프라이머 고농도 아마 발생한다. 프라이머 분자 30 PCR 사이클 13 후에 서로 부착 할 때 주로 발생한다. 이것은 그들이 어떤 templat (다른 프라이머 분자 효과에 어닐링되지 선형 미니 템플릿되고 더 높은 배경의 원인이됩니다 및 C t 값 &lt;NTC 40 세대로 이어질 수 있습니다전자 제어) 샘플. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54257/54257fig1.jpg" /> 그림 1. HDL 격리 절차의 도식 표현. HDL은 세 원심 분리하는 일련의 단계에서 밀도 구배 초 원심 분리하여 제조 하였다. 밀도 구배 지단백 밴드와 중간 분수의 분포가 도시되어있다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54257/54257fig2.jpg" /> β 머 캅토 에탄올없이 격리 지단백질도 2 아가 로스 겔 전기 영동. VLDL, 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 단리 LDL 및 HDL 분획 용액 C의 demonst에 β 메르 캅토 에탄올을 첨가없이고밀도 지단백 분획 LP (a)의 존재를 평가. 레인 1, 2, 9, 및 10 각각은 사이즈 마커를 나타내고; 레인 3/4, 5/6 및 7/8은 각각 VLDL, LDL과 HDL을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54257/54257fig3.jpg" /> β-머 캅토 에탄올로입니다. 마지막으로 원심 분리 단계 이전에 솔루션 C에 β 메르 캅토 에탄올을 추가 HDL의 그림 3. 아가로 오스 겔 전기 영동은 HDL 분획에서의 (a) 지단백의 제거 결과. 각 사이즈 마커를 나타내는도 9 및도 10, 레인 1, 2; 레인 3-8은 HDL을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 4. 증폭 두 개의 다른의 miRNAs의 플롯 및 CEL-은 miR-39은 miR-223의 발현. 한 바와 같이 (A) 실시간 정량 PCR 격리 HDL 채용 행했다. PCR을 45 사이클 곡선이 임계 값 C가 T - 값이다 교차하는 지점에 대해 실행 하였다. 데이터의 표현을 보여 CEL-은 miR-39 (왼쪽 패널) 및은 miR-223 (오른쪽 패널), 각각. 수평 라인이 검출 임계 값을 나타냅니다. (35)의 사이클 수는 긍정적 증폭 컷오프로 설정 하였다. (6) 샘플로부터 얻어진 절연 HDL에서 (B) 주제 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 원시 코네티컷 값이 발현 수준이 다른 기증자로부터 6 샘플, 각각의 사이에 정제 HDL 혈장 분획 미만 2 코네티컷 값을 변화 CEL-은 miR-39은 miR-223에 대한 표시됩니다 것을 의미한다. 발현 프로파일은 PCR 시스템 및 인간 혈청 및 혈장 miRN를 사용하여 수행 하였다QRT-PCR은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54257/54257fig5.jpg" /> CEL-은 miR-39은 miR-223 그림 5. 녹는 곡선입니다. 도시 된 바와 같이 단일 피크의 존재는. CEL-은 miR-39 (오른쪽 패널)과은 miR-223 (왼쪽 패널), 각각의 특정 증폭을 나타냅니다 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54257/54257fig5large.jpg" target="_blank">하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54257/54257table1.jpg" /> 음과 양의 합성 CEL-은 miR-39의 제어은 miR-223의 혈청, 혈장, cDNA를 특징으로, 정제 HDL 분획의 표 1. 행 C의 t 값입니다. NTC (없음 templat 없습니다전자 제어), NRT (없음 역전사 효소), NAC (QRT-PCR 없음 증폭 제어, 단지 물과 시약).

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Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

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Nanyang Technological University

Research

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11.8K 조회수.  Virginia Commonwealth University.  마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

파우더 샘플의 절대 양자 수율 측정

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.