We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. Fare <ol><li> fareler içeren tüm çalışmalar Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Fareler 12:12 saat ışık-karanlık döngüsünde tutulmuştur. <ol><li> Ticari olarak C57BL / 6 fareleri elde edin. LoxP siteleri tarafından çevrili Klf5 allelleri (Klf5 f l / f l) taşıyan C57BL / 6 fareler elde edin. Bu fareler, daha önce 21 tarif nazikçe Dr. Ryozo Nagai tarafından temin edildi. </li></ol></li><li> Lgr5 organizatörü (Lgr5 EGFP / CreERT2 fareler) düzenlemesi altında indüklenebilir Cre rekombinaz geni taşıyan C57BL / 6 fareler satın alın. </li><li> Lgr5 EGFP / CreER T2 / Klf5 f l / f l fareler kurmak, çapraz Klf5 fl / f Lgr5 EGFP / CreER T2 fareler ve daha sonra Klf5 fl / f l döl geri-melez l fareler </sup&gt; fareler. </li><li> Protokole göre tamoksifen ile muamele fareler daha önce 22 nitelendirdi. Birbirini takip eden 5 gün süre ile, steril bir mısır yağı içinde çözülmüş tamoksifen 1 mg (10 mg / ml), 8 haftalık bir deney ve kontrol fareleri intraperitonal (İP) enjekte edilir. </li><li> İlk tamoksifen enjeksiyondan sonra 14. günde, 2. gaz kaynağı CO bağlı bir bölme yerleştirerek CO2 boğulmaya kullanılarak fareler kurban. fareler bilinçsiz ve tüm hareketleri sona erene kadar gaz odasına akmasına izin verin. ötanazi servikal dislokasyon gerçekleştirmek sağlamak. </li></ol> 2. Doku Hazırlama ve İsviçre Rolling <ol><li> diseksiyon forseps ve makas kullanılarak, karın tarafı deride bir kesi kesti. forseps bir çift ile, kesi cildi tutun ve yavaşça karın kas dokusundan çekin. karın kasları, karın cildi kesip maruz bir makas kullanın. </li><li> Tutun ve pe yukarı çekinforseps ile ritoneum. tutan ve bağırsakların çekerek olmamak emin olun. Dikkatle periton dokusunda bir kesi yapmak ve karın kasları ortaya çıkarmak için cildi kesilip devam ediyor. Dikkatle karın kaslarının bir kesi yapmak ve bağırsakları maruz onları uzak kesme devam ediyor. </li><li> kolon tanımlamak ve rektum / anüs katıldı uzak ucuna iz. bir makas ile, mümkün olduğu anal açıklık yakın olarak kesilir. </li><li> mide tanımlamak ve ince bağırsak ile birleştiği yerde iz. bir makas ile yaklaşık 1 cm uzakta mideden bağırsak özgür kesmek. fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden temiz Petri kabı serbest ince bağırsak ve kolon tüm uzunluğu aktarın. </li><li> Bir yandan ya da forseps bir çift ile, kolon distal ucunu tutun ve yavaşça herhangi mezenterik bağ ve / veya yağ dokusundan kolonun tüm uzunluğu çözülmeye diğer elinizi kullanın. </li><li> çekum tanımlamak(Küçük ince ve kalın bağırsak arasındaki kese) ve çekum ve kolon kolon serbest (kolon proksimal ucunu) katılmak nerede kesti. </li><li> Bir yandan ya da forseps bir çift, küçük bağırsak tutun ve yavaşça herhangi mezenterik bağ ve / veya yağ dokusundan ince bağırsağın tüm uzunluğu çözülmeye diğer elinizi kullanın. çekum kesip ve bunun için gerek varsa atın. Bir gecede süreç (dH 2 O% 50 etanol /% 5 asetik asit) modifiye Bouin fiksatif dışarı disseke bağırsak kuluçkaya burada durdurulabilir ve ertesi gün prosedürü devam Not:. </li><li> bağırsak (ince bağırsak ya da kolon) bir kesimi Taşıma, modifiye Bouin fiksatif ile 10 ml şırınga doldurmak ve bunun için bir sonda iğne takılır. barsak segmentinin ön açılışında yarım santimetre hakkında iğne takın. </li><li> Bir alet ile firma basınç uygulayarak bağırsak segmenti içinde gavaj iğne tutunbarsak segmenti üzerinde. Öte yandan şırınga tutarken, modifiye Bouin fiksatif kullanarak barsak segmentinin içeriğini temizlemek için yumuşak ama tutarlı baskı uygulayın. Bu adım bağırsak segmenti ve hemen tespitin eşzamanlı temizlenmesini sağlar. akış atıkları toplamak için bir Petri kabı kullanın. Tespit opak çevirerek kolon renk ile görülebilir. Not: ateş basması ya da bağırsak segmenti açık patlama olabilir sırasında çok fazla baskı uygulamak için değil emin olun. </li><li> makas kullanarak, mezenterik hat boyunca uzunlamasına bağırsak segmenti açmak kesti. forseps bir çift ile tutun ve PBS içeren bir Petri kabındaki kısaca durulayın. <ol><li> proksimal, orta ve distal: 3 eşit parça halinde ince bağırsak kesti. proksimal parça mide hemen sonra biridir ve distal segmenti kolon hemen önce bir tanesidir. proksimal segmenti için duodenum, jejunum orta ve distale eşdeğerdirileum. </li><li> Her segment için proksimal ve distal ucunu işaretleyin. Proksimal uç başlangıçta mide doğru işaret ediyordu biri ve kolon işaret etti uzak olduğunu. </li></ol></li><li> temizlenmeli ve açılan bağırsak segmenti yerleştirmek için Petri kabı üst kullanın. lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bağırsak segmenti yerleştirin. <ol><li> kolon, genişliği boyunca çalışan variegations / sırtlar lümen yan belirlemek ve yakın ucunda yer almaktadır. orta ve distal bölgelerde uzunlamasına çalışan bazı variegations var. ince bağırsak için, villuslar işaretleri kaba görünen yüzeyi ile luminal yan tespit. Not: ince bağırsak için, proksimal, orta ve distal bölgelerde harici makroskopik anatomik sınır vardır. Bununla birlikte, bu bölgeler mikroskop altında bölümlerde tanımlanan de bağlanabilir. Nerede olduklarını villus distalde giderek daha kısa proksimal bölgede uzun ve olmakuzunluğunda kısa. Mikroskopik olarak, kolon kriptler da, sırtlar varlığı ile tespit edilebilir yakın bölgede kısa bulunmaktadır. Kolon kriptler henüz yakın bölgede hala daha uzun uzak bölgede Midsection en yüksek ve daha kısadır. </li></ol></li><li> İsviçreli kolon haddeleme devam edin: <ol><li> düz açık kolon tutmak ve Petri kabı kenarına doğru proksimal ucundan forseps ile çekin. </li><li> yukarı bakacak şekilde lümen tarafını tutmak ve tek elle forseps ile proksimal ucunu tutun ve diğer elinizle bir kürdan tutun. </li><li> forseps kullanarak kürdan etrafında ucunun kenarı sarın ve hafifçe yerinde tutmak için kürdan karşı sarılmış kenar çimdik. </li><li> Ve yavaşça bir İsviçreli rulo oluşturacak şekilde kürdan etrafında kolon rulo parmaklarıyla kürdan haddeleme başlar. </li><li> Tüm kolon uzunluğu sıvadı edildikten sonra, dikkatlice c slayt forseps bir çift kullanınkürdan kapalı ve bir doku işleme / katıştırma kasete Olon İsviçre rulo. gece boyunca oda sıcaklığında% 10 tamponlu formalin içine kaseti yerleştirin. </li></ol></li><li> İsviçre ince bağırsak haddeleme devam edin: <ol><li> Bir seferde bir kesimi Taşıma, luminal kenarında düz açık segmenti tutmak ve Petri kabı kenarına doğru proksimal ucundan forseps ile çekin. </li><li> kolon için anlatıldığı gibi İsviçre haddeleme ile devam edin. </li></ol></li><li> parafine için formalin ile fikse dokular işleme devam edin. Aşağıdaki adımları takip edin: NOT: (detaylar için malzeme ve ekipmanlar görelim) otomatik işlemcisi kullanın. <ol><li> Doku kasetinde iken sabitleştirici tamamen kaldırılması, PBS ile doku yıkayın. </li><li> Aşağıdaki sırayla etanol kullanılarak doku kurutmak:% 50 etanol, 10 dakika,% 70 etanol 10 dakikada,% 80 etanol için 10 dakika, 10 dakika süre ile,% 95 etanol, 10 dakika boyunca% 100 etanol,% 100 etanol 10 dakika boyunca ve 110 dakika boyunca% 00 etanol. </li><li> aşağıdaki sırayla ksilen Exchange etanol: 2: 1 etanol: 10 xylene - 15 dakikada, 1: 1 etanol: 10 xylene - 15 dakikada, 1: 2 etanol: 10 xylene - 10 15 dakika,% 100 iksilen - 15 dakika, 10% 100 iksilen - 15 dakika, 10% 100 iksilen - 15 dakika. DİKKAT: Ksilen böylece işyeri uygun bir başlık ve personel tarafından giydi gereken uygun koruyucu ekipman ile bir lokal egzoz havalandırması ile donatılmış olmalıdır bir sağlık tehlikesi vardır. </li><li> parafin Exchange ksilen. 2: 1: ksilen: 30 dakika için parafin, 1: 1 ksilen: 30 dakika için parafin, 1: 2 ksilen: 30 dakika için parafin,% 100 parafin 58 ° C - Fırın 54 bir vakum, aşağıdaki adımları 1 - 2 saat ve 1% 100 parafin - 2 saat veya gece. Not: Bu parafin polimerler aşağılamak ve sert ve kırılgan hale getirecek, çünkü parafin uzun süre için 60 ° C&#39;yi izin vermeyin. </li><li> de taze yeni parafin ve şark dokusunda gömparafin sertleşir önce sired. İsviçre rulo, doku paraffinization ardından, parafine sırasında yana her rulo yeniden konumlandırmak için önemlidir. Bu kesme işlemi sırasında, her bir rulonun tüm uzunluğu bölümleri imal edilmesini sağlar. </li></ol></li><li> boyama için, mikrotom kullanılarak 5-mikron kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. ; Yüklü slaytlar üzerinde bölümleri toplayın ve fırın gecede 65 ° C onları (fırında) kurutmak oda sıcaklığına soğutun ve daha sonra boyama için onları kullanmış olsun. Not: pişirme süresi 1 kısaltılmış olabilir - slaytlar nasıl taze kesilmiş bağlı 2 saat. kesit beri bir aydan daha az ise, o zaman bir gecede pişirmek için tavsiye edilir. Bir aydan fazla olmuş, o zaman 1 - pişirme 2 saat zaman kazanmak için yeterlidir. Zaman tükeniyor ise, gecede destek her zaman kullanılabilir. </li></ol> 3. Histolojik Analiz ve Immunoflorasan Boyama Histolojik analiz ve immunoflu gerçekleştirmeorescence boyama daha önce modifikasyonlarla, 23,24 tarif. gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) immünofloresan için: <ol><li> 1 saat boyunca 65 ° C fırın içinde slaytlar fırında endojen alkali fosfataz etkinliğini aktif hale getirmesi ve daha sonra ksilen deparaffinize. </li><li> endogen dokunun peroksidazlar engellemek için, metanol içinde% 3 hidrojen peroksit banyosunda bölümleri inkübe; daha sonra 10 dakika boyunca 125 ° C &#39;de sitrat tampon çözeltisi içinde, antijen alma ve ardından azalan alkol banyosu serisi (% 100,% 95,% 70) içinde inkübe edilerek, (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween-20, pH 6.0) rehidrate bir decloaking odacığı kullanılarak. </li><li> hidrofobik bariyer sağlar kalem işareti kullanılarak doku bölümleri etrafında bir daire çizin ve (EGFP karşı birincil antikor ile daha sonra seyreltme 1 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (TBS-Tween içinde% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini [BSA]) bloklama tamponu ile bölümleri inkübe : gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 ° C&#39;de 500) hafifçe çalkalandı.</li><li> bölümleri yıkayın ve 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca uygun bir konsantrasyonda flüoresan etiketli ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> Hoechst ile sekonder antikor tedavisi ve leke çekirdekleri sonra slaytlar yıkayın ve montaj medya ile monte edin. <ol><li> Klf5 / EGFP / Ki-67 eş-boyama için, işlem slaytlar adımları 3.1 de tarif edildiği gibi - 3.3 ve Klf5 antikor (seyreltme 1: 150) ile inkübe edilerek Klf5 boyama yerine gece boyunca karıştırılmıştır. </li><li> protokole göre slaytlar tavşan AP polimer algılama uygulayın. </li><li> Klf4 üreticinin protokol başına kadar kromojen immünohistokimyasal boyama ile boyanarak ortaya koymaktadır. </li><li> Daha önce tarif edilen protokol 25 kullanılarak antikor elüsyon gerçekleştirin. Glisin-SDS içinde 50 ° C&#39;de (pH 2.0), 1 saat boyunca çalkalama ile çözüme slaytlar inkübe edin. </li><li> Yıkama damıtılmış su ile iyice kayar ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca (TBS-Tween içinde% 2.5 BSA) tampon engelleme inkübe edin. </li><li> Ki-67 ekleyin (seyreltme 1: 500) ve EGFP (seyreltme 01:500) eş zamanlı olarak antikor ve 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (Veriler gösterilmemiştir) Hoechst ile boyamadan önce uygun bir sekonder antikor ile flüoresan tespiti gerçekleştirmek ve yerleştirme ortamı ile monte edilir. </li></ol></li><li> Hematoksilen ve eozin (H &amp; E) 26 5-mikron bölümleri boyanarak üzerine dokuların histolojik morfolojisini gözlemleyin. Floresan görüntüler için, sırası ile, EGFP, Klf5, Ki-67 renklendirme görselleştirmek için 535, 646 ve 700 emisyon dalga boylarını kullanır. </li></ol>

<ol>
	<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+achaete+scute-like+2+controls+intestinal+stem+cell+fate.">Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate.</a> Cell. 136 (5), 903-912 (2009).</li><li>Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+is+expressed+in+vivo+in+intestinal+stem+cells.">Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells.</a> Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).</li><li>Montgomery, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+telomerase+reverse+transcriptase+(mTert)+expression+marks+slowly+cycling+intestinal+stem+cells.">Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+between+intestinal+stem+cell+populations+in+distinct+niches.">Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches.</a> Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).</li><li>May, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+putative+gastrointestinal+stem+cell+and+adenoma+stem+cell+marker,+doublecortin+and+CaM+kinase-like-1,+following+radiation+injury+and+in+adenomatous+polyposis+coli/multiple+intestinal+neoplasia+mice.">Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice.</a> Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).</li><li>Powell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pan-ErbB+negative+regulator+Lrig1+is+an+intestinal+stem+cell+marker+that+functions+as+a+tumor+suppressor.">The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor.</a> Cell. 149 (1), 146-158 (2012).</li><li>Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+transcription+factors:+a+functional+family.">Kruppel-like transcription factors: a functional family.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).</li><li>McConnell, B. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Kruppel-like+factors+in+health+and+diseases.">Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases.</a> Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).</li><li>McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Kruppel-like+factors+4+and+5+in+epithelial+biology+and+pathobiology.">The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology.</a> Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).</li><li>Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+essential+for+proliferation+and+survival+of+mouse+intestinal+epithelial+stem+cells.">Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).</li><li>Gelberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy,+physiology,+and+mechanisms+of+disease+production+of+the+esophagus,+stomach,+and+small+intestine.">Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine.</a> Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).</li><li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AOM/DSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis:+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies.">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10 (9), (2011).</li><li>Magnus, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+presence+of+intestinal+epithelium+in+the+gastric+mucosa.">Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).</li><li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"Swiss+roll":+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine.">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li><li>Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+practical+'swiss+roll'+method+of+preparing+tissues+for+paraffin+or+methacrylate+embedding.">A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding.</a> J Microsc. 145, 115-120 (1987).</li><li>Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+chromogenic+in+situ+hybridization+to+detect+genetic+aberrations+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+material,+including+tissue+microarrays.">Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays.</a> Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+are+essential+for+the+adaptive+response+of+the+murine+heart+to+pressure+overload.">Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload.</a> J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>McConnell, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+important+for+maintenance+of+crypt+architecture+and+barrier+function+in+mouse+intestine.">Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).</li><li>Nandan, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+a+crucial+mediator+of+intestinal+tumorigenesis+in+mice+harboring+combined+ApcMin+and+KRASV12+mutations.">Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations.</a> Mol Cancer. 9 (63), (2010).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

İsviçre haddeleme tekniği büyük ölçüde, histolojik ve morfolojik değerlendirmesi için bağırsak doku hazırlanması için güçlü bir yöntemdir. Ilk dondurulmuş bölümleri 18,19 hazırlanması için geliştirilmiş daha önce tarif edilen Swiss-haddeleme tekniği, aksine, burada sunulan prosedür formalinle tespit ve parafine (FFPE) istemi bağırsak doku hazırlanması ve tespit sağlar. Dondurulmuş doku ile karşılaştırıldığında, FFPE dokusu çok daha uzun bir raf ömrüne sahiptir ve bu nedenle daha iyi bir doku bütünlüğü histolojik analizi için doku tercih edilen tipidir. İsviçre haddeleme protokol kritik parçaları haddeleme ve boyama postfiksasyon İsviçre haddeleme bütünlüğü ve doku kalitesini korumak için doku esnekliği gerektirir. Bağırsak dokusunun FFPE standart İsviçre rulo tekniği genellikle zahmetli ve zaman alıcı (2 gün) 18,19 olduğunu. Ayrıca, bu standart yöntem genellikle r bağırsak dokusu elde edilirelatively sert ve kolay değil bir İsviçre rulo kurmaya. % 10 tamponlu formalin içine kesilir intestinal doku, gece boyunca inkübasyon doku haddeleme önce gerekli olan olmasıdır. FFPE amacıyla tekniğin diğer modifikasyonları da geliştirilmiştir, ancak bağırsak dokuları eğiliminin önemli bir sorun göz önüne sermek ve / veya silindirin merkezi deforme olması için gerekir. bu tekniklerde kullanılan doku bağırsak tarafından üretilen mukus kaygan taze tespit edilmemiş dokuda, olmasıdır. Burada gösterilen yeni modifiye edilmiş tekniğin Bouin fiksatifi değiştirilmiş bir şeklini kullanarak bu sorunların üstesinden gelmektedir. Orijinal Bouin fiksatifi asetik asit, etanol, pikrik asit ve paraformaldehit (ya da formalin) içindeki bir karışımından oluşur. iki en tehlikeli bileşenler, pikrik asit ve paraformaldehit (ya da formalin), bir asetik asit / etanol karışımı ile fiksatif daha güvenli kullanımına izin vermek için kaldırılmıştır. Pikrik asit patlama tehlikesi ve PARAFOR sunarFormaldehit (ya da formalin) bir kanser tehlikesi. modifiye Bouin fiksatifi kullanılmasının önemi, (1) orijinal formüle kıyasla daha az tehlikeli olmasıdır, (2), en laboratuarlarında hazır nispeten nonexpensive reaktiflerle hazırlanması kolaydır, ve (3), hızlı sağlar, neredeyse anında doku fiksasyon yıkama için kullanıldığında. Bildiğimiz kadarıyla, bu modifiye tekniği kullanarak bilinen hiçbir sınırlama yoktur. Ayrıca, bu karışımla hızlı tespit son derece çok daha hızlı ve daha kolay doku haddeleme izin bağırsak dokusunun kayganlığını azaltır. Bu tespit edici aynı zamanda histolojik ve immün Analiz için doku ve hücre bütünlüğünün çok korunmasını sağlar. Bu nedenle, ince bağırsak dokusudur başka hazırlama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu geliştirilmiş bir teknik ölçüde hız ve kullanım kolaylığı çeşitli teknik sorunlar ve hibe üstesinden gelmektedir. Ayrıca, bu modifiye sabitleştirici diğer kalın ile kullanmak için faydalıdırHızlı tespiti gerektiren dokular. Çünkü iken aynı zamanda uygulanan fiksasyon kalın dokuya hızlı nüfuz kapasitesine sahip asetik asit ve etanol doğası, evi. Biz hızlı bir şekilde karaciğer, dalak ve böbrek gibi kalın doku düzeltmek için başarılı bir şekilde kullanmıştır. 20 dakika - Örneğin, modifiye Bouin fiksatifi kullanılarak erişkin fare, tüm karaciğer sabitleme genellikle 15 içinde elde edilir. Bu kolayca karaciğer içine bir kesitini kesme ve karaciğer derin bölgeleri gri kan kırmızı renk değişip değişmediği gözlemleyerek karar olabilir. renk değişimi tespit göstergesidir. Doku zaten bu noktada sabit olarak, değiştirilmiş hücresel / doku kompozisyonu hiçbir korku ile 48 saat - Bu tespit daha sonra 24 tamponlu formalin kullanarak çapraz bağlama tarafından takip edilmektedir. derin doku fixati elde etmek için 48 saat - Buna karşılık, bir yetişkin fare bütün karaciğer yalnız kullanımı, geleneksel tamponlu formalin tespit yöntemi 24 gerektirecektir, Derin doku değiştirilmiş hücresel bileşiminde riski. Kalın dokuların hızlı bir tespit yöntemleri vücuttan organ / doku ayrılmasından sonra, hipoksi gibi koşullar, strese tepki olarak en az hücresel bileşenleri değiştirilmesini azaltma birçok avantajı vardır. Bu modifiye edilmiş sabitleyici istendiği kalın bir doku / organların sabitleme daha hızlı bir şekilde hayvan perfüzyon kullanılabileceğini öngörmektedir. Böylece, sonuç olarak, bu yöntem ve değiştirilmiş sabitleyici hızla diğer kalın dokuların / organları düzeltmek için kullanılabilir bağırsak doku hasat ve tespit ve modifiye sabitleyici için kullanılan geleneksel yöntemler üzerinde birden fazla avantaj sağlar.

Memeli bağırsak epitel sütun hücrelerinin tek bir katman ihtiva eder. farklılaşmış hücreler villus bölgesini işgal ederken ince bağırsakta, proliferatif hücreler crypts sınırlıdır. kalın bağırsakta hiçbir villus olduğundan Ancak, proliferatif hücreler kriptalarının altına lokalize ve farklılaşmış hücrelerin kriptalarının üst bölgesini işgal edilmiştir. crypts içinde proliferatif hücrelerin sürekli bölünmesi ile tahrik edilir - (5 gün yaklaşık 3) bağırsak epiteli hızlı ikmal uğrar. Kript proliferatif hücrelerin homojen popülasyon değildir ve daha fazla kök hücre ve transit amplifiye (TA) hücreleri 1 bölünür. 2 çok alttan 5 hücreleri - kök hücreler ilk 4 içinde, crypt dibinde bulunur. crypt baz sütunlu (CBC) kök hücre ve rezerv hareketsiz kök hücreleri: Mevcut model iki kök hücre tiplerinin varlığını destekler. CBC sTEM hücreleri etkin bir şekilde çoğalan ve Lösin açısından zengin tekrar içeren, G-proteine ​​akuple bir reseptör 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 ile Achaete Scute benzeri 2 (Ascl2) 5 ile işaretlenmiştir. Öte yandan, rezerv hareketsiz kök hücreleri, B hücre spesifik, Moloney kemirgen lösemi virüsü entegrasyon Bölge 1 (Bmi1) 6 fare telomeraz ters transkriptaz (mTert) 7 ile etiketlenir, HOP Homeobox (Hopx) 8 doublekortin-mi CAM Kinaz benzeri 1 (Dclk1) 9, ve lösin -Cys ve immünoglobülin benzeri sahalar 1 (Lrig1) 10. etkin bir şekilde çoğalan kök hücreler daha sonra emme hücreleri (enterositler) ve salgılayıcı hücreler (enteroendokrin, kadeh, Paneth ve Elyaf hücreleri) içine daha fazla farklılaşma tabi ta hücrelere yol açar. onlar apoptoz geçmesi ve olan villus, üst ulaşana kadar proliferatif bölgede sürekli hücre bölünmesi crypt-villus ekseni boyunca epitel hücrelerinin yukarı doğru hareketi ile sonuçlanırepitelyum yüzeyinden dökülür. Intestinal epitelyal hücrelerin farklı (örneğin, barsak goblet hücrelerinin lizozim karşı antikorla bir MUC2 ve Paneth hücrelerine karşı bir antikorla boyama ile tanınabilir) farklı proteinlerin ekspresyonu ile işaretlenir. Biz bağırsak epiteli 11-13 homeostazında ve patobiyolojisinde Kruppel benzeri faktörler (KLFs) rolünü incelemek. Değiştirilmiş Swiss-haddeleme tekniğinin fizibilitesini destekleyici Burada sunulan sonuçlar etkin bir şekilde çoğalan bağırsak epitel kök hücrelerin 14 bakımında Kruppel benzeri faktör rolü 5 (KLF5) önceki çalışmalara dayanmaktadır. KLF5 yüksek ölçüde aktif, bağırsak kök ve ta hücreleri 12 olarak ifade edilen bir çinko parmak kopyalama faktörüdür. Daha önceki çalışmalar, KLF5 Ki-67, bağırsak kript bilinen bir proliferatif işaretleyici ile birlikte ifade olduğunu göstermiştir. gastrointestinal tr<html> hareket bir yapısal veya işlevsel homojen bir doku değildir. ince barsak proksimal, orta ve distal parçaya bölünmüş ikinci, bundan başka, duodenum, jejunum ve ileum ve çekum ve kolon içine kalın bağırsak ayrılmıştır. Bu bölümlerin her biri kendine özgü histolojik özellikleri vardır ve farklı roller 15 oynar. Bu nedenle, hakaret etkileri ve bağırsak epiteli tepkisinin derecesi çalışılan dokuda 16 bölgeye bağlı olabilir. Buna ek olarak, farklı fare suşları, çalışmalarda 16 kullanılan hasara türüne göre histolojik düzeyde yanıt çeşitliliği gösterir. Bu durumda, dokunun hazırlama yakışır uygun histolojik ve bağırsak dokuları moleküler analizi izin vermek için gereklidir. Bu nedenle, İsviçre rulo tekniği hibe tek seferde bağırsak epiteli tam uzunlukta analizi ve böylece kapsamlı bilgilere dayanarak bilgili sonuçlar tespit eder. e_content &quot;&gt; Swiss-haddeleme tekniği ilk Magnus 17 tarafından belirtildiği ve Moolenbeck ve RUITENBERG and Park ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. dokuların hazırlanması ve histolojik gerçekleştirmek için bir yöntem olup, kemirgen bağırsak 18,19 sırasıyla. protokolü analizleri olarak tanılama amacıyla zamanında ve güvenilir doku hazırlanması için izin orjinal yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu, bu yayında sunulur tarif. Bu modifiye edilmiş tekniğin etkin koleksiyonları ve immünohistokimya, immünofloresans, hem de evrensel kullanılan teknikler, intestinal epitel hazırlanmasını sağlar ek değerlendirme (floresan ve kromojenik 20), in situ hibridizasyon gibi. Ayrıca, Hazırlama yöntemi örneği değiştirilmiş doku hızlı doku fiksasyon bir yöntem sunan hazır ve nispeten ucuz reaktifler kullanır ve protein, DNA elde sağlar ve RNA. Alınan birlikte, this tekniği bağırsak epiteli, histopatolojik patolojik ve moleküler özelliklerinin kapsamlı değerlendirme için mükemmeldir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Stainless Steel Dissecting Kits</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25640-002</td>
			<td style="width:403px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Decloaking Chamber</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Syringe 10ml</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td>
			<td style="width:179px;">Simport</td>
			<td>M515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Manual Slide Staining Set</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish Green</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish White</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Oven</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td>6243</td>
			<td>for baking slides at 65 degree</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Methanol</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>281000ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Xylene</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Hydrogen peroxide 25% solution in water</td>
			<td style="width:179px;">ACROS</td>
			<td>202465000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10% bufered formalin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Bovine serum fraction V, heat shock</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Tween 20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gavage needle</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20068-624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Klf5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-22797</td>
			<td>Dilution 1: 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Chicken anti EGFP antibody</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB16901</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">CRM325B</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">M3R533L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Warp red chromogen kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">WR806 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lgr5-EGFP/CreERT2 mice&#160;</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>008875&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Automated processor</td>
			<td style="width:179px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

immünohistokimyasal boyama ile birlikte İsviçreli haddeleme tekniği küçük veya büyük bağırsak dokusunun kapsamlı bir analiz sağlar. Bir C57BL / 6 fare (Şekil 1) bir kalın barsak H &amp; E boyama örnek fizibilite bir tasviridir ve bu tekniğin etkinliğidir. Proksimal, orta ve distal: Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, görüntü kolon tüm bölümlerini yakalamak edebilmektedir. Bu nedenle, bu kapsamlı bir histolojik değerlendirmesi için olanak sağlar. İsviçreli haddeleme ve küçük ya da büyük bağırsak dokusunun tüm uzunluğu yakalama yeteneği heterojen gen ifadesi ve işaretleyici boyanması veya hakaret bağırsak dokusunun bir değişken tepki için son derece yararlıdır. Bir örnek Lgr5 EGFP / CreER T2 farelerde EGFP boyama şeklidir. Bu fare modelinde, EGFP ekspresyonu ile tahrik edilirSadece aktif çoğalan bağırsak kriptlerde aktif Lgr5 organizatörü. transgen ekspresyonunun - (% 10, yaklaşık 5) penetrans Ayrıca, bu fare modeli, düşük ile karakterize edilir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, bağırsak dokuları EGFP ifade modeli değişkendir. Sonuç olarak, dokusunun büyük bir görünümü yakalamak için yetenek ilgi bölgeyi tanımlamak için yardımcı olur. Burada anlatılan teknik, özellikle de multifluorophore boyama uygulanması ile güçlüdür. Burada, Swiss-haddeleme tekniği kullanılarak hazırlandı intestinal doku trifluorophore boyanma bir örneğini gösterir. Bu çalışmanın temel amacı, Lgr5 işaretleyici ifade eden bağırsak kök hücrelerin korunmasında Klf5 rolünü araştırmaktır. Bu nedenle, biz Lgr5 EGFP / CreER T2 farelerde Lgr5-pozitif bağırsak kök hücrelerden Klf5 silinmiş ve gününde bağırsak dokuları toplananİlk tamoksifen enjeksiyondan sonra 14. immünohistolojik analizi için, dokular uygulandı EGFP (Lgr5 belirteci), Klf5 ve Ki-67, bu makalede sunulmuştur protokol ve boyama göre hazırlandı. Lgr5 EGFP / CreER T2 olarak ifade kontrol farelerinde, iki muayene zaman noktalarında Klf5 Ki-67 için EGFP-pozitif (mavi oklarla gösterilmiştir) ve EGFP-negatif kriptler (beyaz oklar ile işaretlenmiştir) arzetmiştir eş boyama Hem Şekil 3 boyutlu olarak gösterildiği gibi. Buna karşılık, Lgr5-EGFP / CreER T2 in / Klf5 fl / fl ince bağırsak dokusu, Klf5 / Ki-67 ortak boyama EGFP-pozitif CBC kök hücrelerin eksik (mavi oklarla işaretli) ancak mevcut olduğu EGFP-negatif Şekil 3H de gösterildiği gibi, (beyaz oklar ile gösterilmiştir), yeşil crypts bitişik kript. Bu Burada sunulan doku hazırlama teknikleri olumsuz boyama kalitesini etkileyen etmediğini mükemmel bir örnektir. Bir C57B L / 6 fare. Gösterildi bir kalın barsak Şekil 1. H &amp; E boyama kalın bağırsağın tüm uzunluğu kompozit görüntü. siyah ve turuncu çizgiler orta işaretler ve turuncu çizgi ve portakal ok arasındaki kalın bağırsağın distal parçası işaretler arasında siyah ok ve siyah çizgi arasındaki kısmı proksimal parçası işaretler. Ölçek çubuğu = 1,000 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54161/54161fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54161/54161fig2.jpg" /> Bir Lgr5 EGFP / CreER T2 Mouse Küçük Bağırsak Şekil 2. İmmünofloresan Boyama. E Kompozit görüntüBir Lgr5 EGFP / CreER T2 fare ince bağırsak bölümlerinin GFP (etiketleme Lgr5-pozitif epitel hücreleri) boyama. Lgr5 EGFP / CreER T2 fare kriptlerde Lgr5-pozitif epitel hücreleri etiketler protein marker (EGFP) heterojen immünofloresan boyama örneği. Çekirdekler Hoechst ile görüntülendi. Beyaz oklar EGFP ifadesi için pozitif crypts işaretleyin. Ölçek çubuğu = 500 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54161/54161fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54161/54161fig3.jpg" /> Lgr5 EGFP / CreER T2 Şekil 3. Klf5 Silme / Klf5 fl / fl Fareler Lgr5 EGFP-pozitif Crypts Uzun Vadeli ısrarla. </stRong&gt; görüntülerin üst ve alt kümesi Lgr5 EGFP / CreER T2 kontrol ve Lgr5 EGFP / CreER T2 günü / Klf5 fl / fl fareler sırasıyla birinci tamoksifen enjeksiyondan sonra 14 gün, temsili ince bağırsak dokusu vardır. Paneller AD ise Lgr5 EGFP / CreER T2 panelleri EH göster boyama Örnek / Klf5 FL / fl farenin Lgr5 EGFP / CreER T2 kontrol farelerinden elde edilen dokudan boyama temsil etmektedir. Kırmızı Paneller A ve E ekran Klf5 immunofluorescent boyama; Paneller B ve F yeşil EGFP boyama göstermektedir; sarı panel C ve G gösterisi Ki-67 boyama; ve paneller D ve H gösterisi Klf5, EGFP ve Ki-67 lekeleri görüntüleri birleşti. Mavi oklar yeşil crypts işaret; beyaz oklar Birleştirilmiş görüntülerde nongreen crypts etmektedir. Lgr5 EGFP / CreER T2 / Klf5 fl / fl fareler sadece EGFP etiketli CBC hücreleri 14 Klf5 uzun süreli kaybı gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54161/54161fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses at JoVE.com

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

68.0K Görüntüleme.  Stony Brook University School of Medicine.  Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır. 

Video: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Biyoloji

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

Yaya Uzay-zaman Aktivite Çalışmaları Yörünge Veri Analizleri

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...