We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. topi <ol><li> Tutti gli studi che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Stony Brook University Istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). I topi sono stati mantenuti in un ciclo luce-buio 12:12 hr. <ol><li> Commercialmente ottenere C57BL 6 topi /. Ottenere C57BL / 6 topi portatori alleli Klf5 fiancheggiati da siti loxP (Klf5 f l / f l). Questi topi sono stati precedentemente descritti 21 e gentilmente forniti dal Dr. Ryozo Nagai. </li></ol></li><li> Acquisto C57BL / 6 topi portatori del gene inducibile Cre ricombinasi sotto controllo del promotore Lgr5 (topi Lgr5-EGFP / CreERT2). </li><li> Per stabilire Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 f l / f l topi, attraversare Klf5 fl / f topi l con topi Lgr5-EGFP / créer T2 e quindi backcross la progenie di Klf5 fl / f l </sup&gt; topi. </li><li> Topi Trattare con tamoxifene come da protocollo descritto in precedenza 22. Iniettare topi di controllo sperimentale e 8 settimane di età intraperitoneale (IP) con 1 mg di tamoxifene (10 mg / ml), disciolto in olio di mais sterili, per 5 giorni consecutivi. </li><li> Il giorno 14 dopo la prima iniezione tamoxifene, sacrificare i topi con CO 2 asfissia mettendoli in una camera collegata al CO 2 fonte di gas. Lasciare che il gas di fluire nella camera fino a quando i topi sono inconscio e tutti i movimenti cessa. Per garantire l&#39;eutanasia eseguire dislocazione cervicale. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto e Swiss rotolamento <ol><li> Utilizzando pinze dissezione e forbici, tagliare un&#39;incisione nella pelle del lato addominale. Con un paio di pinze, tenere la pelle in incisione e tirare delicatamente via dal tessuto muscolare addominale. Utilizzare un paio di forbici per tagliare la pelle addominale ed esporre i muscoli addominali. </li><li> Tenere e tirare su la peritoneum con le pinze. Assicurarsi di non essere in possesso e tirando l&#39;intestino. fare attenzione un&#39;incisione nel tessuto peritoneale e continuare a tagliare via la pelle per esporre i muscoli addominali. fare attenzione un&#39;incisione nei muscoli addominali e continuare a tagliare via per esporre l&#39;intestino. </li><li> Identificare i due punti e tracciare fino alla fine distale dove si unisce il retto / ano. Con un paio di forbici, tagliare il più vicino all&#39;apertura anale possibile. </li><li> Identificare lo stomaco e tracciare dove si unisce con il piccolo intestino. Con un paio di forbici, tagliare liberare l&#39;intestino di circa 1 cm di distanza dallo stomaco. Trasferire l&#39;intera lunghezza del piccolo intestino e colon liberato ad un piatto pulito Petri contenente tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Con una mano o un paio di pinze, tenere l&#39;estremità distale del colon e utilizzare l&#39;altra mano per svelare delicatamente l&#39;intera lunghezza del colon da qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso mesenterico. </li><li> Identificare il cieco(Piccolo sacchetto tra intestino tenue e crasso) e tagliare dove il cieco e il colon uniscono (l&#39;estremità prossimale del colon) per liberare il colon. </li><li> Con una mano o un paio di pinze, tenere il piccolo intestino e utilizzare l&#39;altra mano per svelare delicatamente l&#39;intera lunghezza del piccolo intestino da qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso mesenterico. Tagliare il cieco e scartare se non c&#39;è bisogno. Nota: Il processo può essere fermato qui incubando intestini sezionati in modificato fissativo di Bouin (50% etanolo / 5% di acido acetico in dH 2 O) durante la notte e continuare la procedura del giorno successivo. </li><li> Manipolazione un segmento di intestino (intestino tenue o del colon), riempire una siringa da 10 ml con fissativo modificata di Bouin e inserire un ago sonda gastrica ad esso. Inserire l&#39;ago circa mezzo centimetro nell&#39;apertura anteriore del segmento intestinale. </li><li> Tenere l&#39;ago sonda gastrica all&#39;interno del segmento intestinale mediante l&#39;applicazione di una pressione decisa con uno strumentosul segmento intestinale. Con l&#39;altra mano che tiene la siringa, esercitare una leggera ma consistente pressione svuotare il contenuto del segmento intestinale utilizzando fissativo modificata di Bouin. Questa fase consente pulizia simultanea del segmento intestinale e fissaggio immediato. Utilizzare una capsula di Petri per raccogliere i rifiuti flow-through. Fixation può osservare dal colore colon tornitura opaco. Nota: Assicurarsi di non applicare troppa pressione durante il lavaggio o il segmento intestinale potrebbe scoppiare aperta. </li><li> Utilizzando le forbici, tagliare aprire il segmento intestinale longitudinalmente lungo la linea mesenterica. Tenerlo con un paio di pinze e sciacquare brevemente in una capsula di Petri contenente PBS. <ol><li> Tagliare il piccolo intestino in 3 segmenti uguali: prossimale, medio e distale. Il segmento prossimale è quello immediatamente dopo lo stomaco, e il segmento distale è quella immediatamente prima del colon. Il segmento prossimale è equivalente al duodeno, la metà a digiuno, e distale perl&#39;ileo. </li><li> Per ogni segmento segnare prossimale e l&#39;estremità distale. L&#39;estremità prossimale è quella che originariamente rivolta verso lo stomaco, e distale puntato verso il colon. </li></ol></li><li> Usare la parte superiore di un piatto Petri per posizionare il segmento intestinale puliti e aperto. Posizionare il segmento intestinale con il lato luminale rivolto verso l&#39;alto. <ol><li> Per il colon, identificare il lato luminale dalle screziature / creste che attraversano la sua larghezza e sono presenti alla fine prossimale. Le regioni medie e distali hanno alcuni variegature che corrono longitudinalmente. Per il piccolo intestino, identificare il lato luminale dalla superficie ruvida-apparire, che segna il villi. Nota: Per il piccolo intestino, non ci sono macroscopici delimitazione anatomica esterna prossimale, centrale e le regioni distali. Tuttavia queste regioni possono essere identificate possono nelle sezioni al microscopio. I villi sono più lungo della regione prossimale e diventano via via più breve distale dove sonola più breve in lunghezza. Microscopicamente, le cripte del colon sono più breve nella regione prossimale che può anche essere identificata dalla presenza di creste. Le cripte del colon sono più alto nella parte centrale e più brevi nella regione distale ma ancora più alto nella regione prossimale. </li></ol></li><li> Procedere con Swiss rotolare i due punti: <ol><li> Mantenere il colon piatta aperto e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo del piatto Petri. </li><li> Mantenere lato luminale rivolto verso l&#39;alto e l&#39;estremità prossimale con la pinza con una mano e con l&#39;altra mano tenere uno stuzzicadenti. </li><li> Avvolgere il bordo della estremità prossimale intorno al stuzzicadenti con le pinze e un po &#39;pizzicare il bordo avvolto contro il stuzzicadenti per tenerlo in posizione. </li><li> Delicatamente e lentamente iniziare a rotazione lo stuzzicadenti con le dita per rotolare i due punti intorno lo stuzzicadenti in modo da formare un rotolo svizzero. </li><li> Una volta che l&#39;intera lunghezza del colon è stato arrotolato, usare un paio di pinze a scivolare con attenzione il colon Swiss roll off lo stuzzicadenti e in un tessuto di elaborazione / cassette -embedding. Inserire la cassetta in 10% formalina tamponata notte a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Procedere con Swiss rotolare il piccolo intestino: <ol><li> Manipolazione un segmento alla volta, tenere il tratto piano aperto con lato luminale e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo del piatto Petri. </li><li> Procedere con rotolamento Swiss come descritto per il colon. </li></ol></li><li> Procedere con l&#39;elaborazione di tessuti fissati in formalina per paraffina. Procedere come segue: NOTA: utilizzare un processore automatizzato (vedi Materiali e attrezzature per i dettagli). <ol><li> Mentre il tessuto è nella cassetta, lavare tessuti con PBS fino fissativo viene completamente rimosso. </li><li> Disidratare tessuto con etanolo nella seguente sequenza: 50% di etanolo per 10 min, 70% di etanolo per 10 min, 80% di etanolo per 10 min, 95% di etanolo per 10 minuti, 100% di etanolo per 10 min, 100% di etanolo per 10 min e 100% di etanolo per 10 min. </li><li> Scambio etanolo con xilene nella seguente sequenza: 2: 1 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 1: 1 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 1: 2 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 100% xilene per 10 - 15 min, 100% xilene per 10 - 15 minuti, e il 100% xilene per il 10 - 15 min. ATTENZIONE: xilene è un pericolo per la salute, così il posto di lavoro dovrebbe essere dotato di un sistema di aspirazione locale con una corretta cappuccio e l&#39;attrezzatura di protezione deve essere indossato dal personale. </li><li> xilene Exchange con paraffina. Effettuare le seguenti operazioni in un forno sotto vuoto impostato al 54 - 58 ° C: 2: 1 xilene: paraffina per 30 min, 1: 1 xilene: paraffina per 30 min, 1: 2 xilene: paraffina per 30 minuti, 100% paraffina 1 - 2 ore, e il 100% di paraffina per 1 - 2 ore o durante la notte. Nota: Non lasciate che la paraffina superi i 60 ° C per lunghi periodi di tempo perché questo si degradano i polimeri di paraffina e rendono difficile e fragile. </li><li> Incorporare nel nuovo paraffina e orientare tessuto fresco come dedesiderato prima la paraffina indurisce. Per i rulli svizzeri, seguendo paraffinization tessuti, è importante riposizionare ogni rotolo sul suo lato durante incorporamento paraffina. Ciò garantisce che durante il taglio, saranno prodotte sezioni della intera lunghezza di ogni rullo. </li></ol></li><li> Per la colorazione, taglio a 5 micron sezioni spesse con microtomo. Raccogliere sezioni su vetrini carichi e (bake) asciugare in un forno a 65 ° C durante la notte; lasciare raffreddare a temperatura ambiente e successivamente utilizzato per la colorazione. Nota: Il tempo di cottura può essere ridotto a 1 - 2 ore a seconda di come appena tagliata le diapositive sono. Se meno di un mese da sezionamento, allora è consigliabile cuocere durante la notte. Se è stato più di un mese, poi 1 - 2 ore di cottura è sufficiente per risparmiare tempo. Se a corto di tempo, il sostegno durante la notte può sempre essere utilizzato. </li></ol> 3. analisi istologica e immunofluorescenza colorazione Eseguire l&#39;analisi istologica e immunofluorescence colorazione come precedentemente descritto 23,24, con modifiche. Per la proteina fluorescente verde (EGFP) immunofluorescenza: <ol><li> Cuocere le diapositive di una C forno a 65 ° per 1 ora per inattivare endogena fosfatasi alcalina e successivamente Deparaffinare in xilene. </li><li> Incubare le sezioni in un bagno di perossido di idrogeno al 3% in metanolo di bloccare perossidasi endogene di tessuto; poi reidratare mediante incubazione in una serie decrescente vasca alcool (100%, 95%, 70%) seguita da antigene recupero in soluzione tampone citrato (10 mM citrato di sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C per 10 min utilizzando una camera decloaking. </li><li> Disegnare un cerchio attorno sezioni di tessuto usando pennarello che fornisce barriera idrofobica e incubare sezioni con tampone di bloccaggio (albumina sierica bovina 2,5% BSA [] in TBS-Tween) per 30 minuti a 37 ° C e poi con anticorpo primario contro EGFP (diluizione 1 : 500) a 4 ° C per una notte in una camera umidificata agitatore.</li><li> Lavare sezioni e incubare con anticorpo secondario fluorescente-tag alla concentrazione appropriata per 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavare i vetrini dopo secondarie di trattamento di anticorpi e macchia nuclei con Hoechst e montare con mezzi di montaggio. <ol><li> Per Klf5 / EGFP / Ki-67 co-colorazione, i vetrini di processo come descritto ai punti 3.1 - 3.3 ed eseguire Klf5 colorazione incubando con anticorpo Klf5 (diluizione 1: 150) durante la notte. </li><li> Applicare coniglio rilevamento polimero AP alle diapositive come da protocollo. </li><li> Rivela Klf4 colorazione utilizzando cromogeno colorazione immunoistochimica secondo il protocollo del produttore. </li><li> Eseguire eluizione degli anticorpi utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Incubare i vetrini a 50 ° C in Glycine-SDS (pH 2,0) la soluzione sotto agitazione per 1 ora. </li><li> Lavare i vetrini accuratamente con acqua distillata e incubare con tampone di bloccaggio (2,5% BSA in TBS-Tween) per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere Ki-67 (diluizione 1: 500) e EGFP (diluizione 1:500) anticorpi simultaneamente e incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Eseguire il rilevamento fluorescente con anticorpi secondari appropriati prima colorazione con Hoechst (dati non mostrati) e montare con mezzo di montaggio. </li></ol></li><li> Osservare la morfologia istologica dei tessuti sulla colorazione sezioni 5 micron con ematossilina e eosina (H &amp; E) 26. Per le immagini a fluorescenza, utilizzare le lunghezze d&#39;onda di emissione di 535, 646, e 700 di visualizzare EGFP, Klf5, e Ki-67 colorazione, rispettivamente. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

La tecnica di laminazione svizzero è un metodo efficace per la preparazione di tessuto intestinale per la valutazione istologica e morfologica su larga scala. In contrasto con la tecnica precedentemente descritta Swiss-rotolamento, che è stato originariamente sviluppato per la preparazione delle sezioni congelate 18,19, la procedura qui presentata consente rapida preparazione tessuto intestinale e la fissazione per fissazione in formalina e paraffina (FFPE). Rispetto ai tessuti congelati, tessuto FFPE ha du...

L&#39;epitelio intestinale di mammifero comprende un singolo strato di cellule colonnari. Nel piccolo intestino, le cellule proliferative sono limitati alle cripte mentre le cellule differenziate occupano la regione villi. Tuttavia, perché non ci sono villi nell&#39;intestino crasso, le cellule proliferative sono localizzati nel fondo delle cripte e cellule differenziate occupano la regione superiore delle cripte. L&#39;epitelio intestinale subisce rifornimento rapido (circa 3 - 5 giorni) che è guidato dalla divisione continua delle cellule proliferative all&#39;interno delle cripte. Le cellule proliferative delle cripte non sono una popolazione omogenea e sono ulteriormente suddivisi in cellule staminali e cellule 1 di transito di amplificazione (TA). Le cellule staminali risiedono sul fondo della cripta, entro i primi 4 - 5 cellule dal fondo 2. L&#39;attuale modello supporta l&#39;esistenza di due tipi di cellule staminali: le cellule staminali cripta base a colonna (CBC) e le cellule staminali quiescenti di riserva. Il CBC sle cellule TEM sono attivamente proliferando e sono contrassegnati da G-proteine ​​repeat-contenenti ricchi di leucina recettore accoppiato 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. D&#39;altra parte, le cellule staminali quiescenti di riserva sono etichettati in base al sito B specifici delle cellule Moloney murine leukemia virus integrazione 1 (BMI1) 6, la telomerasi del mouse trascrittasi inversa (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, doublecortin-like e CAM chinasi -Come 1 (Dclk1) 9, e leucina Rich ripetizioni e Immunoglobulina-Come domini 1 (Lrig1) 10. Le cellule staminali proliferano attivamente danno origine a cellule TA poi subire un&#39;ulteriore differenziazione in cellule assorbenti (enterociti) e cellule secretorie (enteroendocrine, calice, cellule Paneth, e Tuft). divisione cellulare continua nella zona proliferativa traduce in movimento verso l&#39;alto delle cellule epiteliali lungo l&#39;asse cripta-villo fino a raggiungere sommità dei villi, dove subiscono apoptosi e sonosloughed dalla superficie dell&#39;epitelio. I diversi tipi di cellule epiteliali intestinali sono contrassegnati mediante l&#39;espressione di proteine ​​distinte (ad esempio, cellule caliciformi intestinali può essere riconosciuto dalla colorazione con anticorpi contro le cellule MUC2 e Paneth con anticorpi contro il lisozima). Studiamo il ruolo dei fattori Krüppel-like (KLFs) nella omeostasi e patobiologia dell&#39;epitelio intestinale 11-13. I risultati qui presentati sostenere la fattibilità di una tecnica Swiss-rolling modificate sono basate su precedenti studi sul ruolo del fattore Krüppel-like 5 (KLF5) nella manutenzione delle attivamente proliferanti cellule staminali epiteliali intestinali 14. KLF5 è un fattore di trascrizione zinc-finger che è altamente espresso nel gambo intestinale attiva e le cellule TA 12. Studi precedenti hanno dimostrato che KLF5 è co-espresso con Ki-67, un marker proliferativa nota nelle cripte intestinali. La gastrointestinale TR<html> atto non è un tessuto strutturalmente o funzionalmente omogeneo. L&#39;intestino tenue è suddiviso in duodeno, digiuno, ileo e e crasso in cieco e del colon, con quest&#39;ultimo suddiviso in prossimale, centrale, e le porzioni distali. Ognuna di queste sezioni ha caratteristiche istologiche uniche e svolge ruoli distinti 15. Come tali, gli effetti di insulti e il grado della risposta dell&#39;epitelio intestinale possono dipendere regione di tessuto studiato 16. Inoltre, vari ceppi di topi dimostrano la diversità della risposta a livello istologico base al tipo di insulto usato negli studi 16. Così, si addice preparazione dei tessuti è necessario consentire istologica appropriata e analisi molecolare dei tessuti intestinali. Come tale, il Swiss extra analisi tecnica sovvenzioni della lunghezza completa dell&#39;epitelio intestinale in una sola volta e quindi accerta conclusioni ben informati basate su informazioni complete. e_content &quot;&gt; La tecnica Swiss-rotolo è stato menzionato da Magnus 17, e descritto in dettaglio da Moolenbeck e Ruitenberg and Park et al. come metodo per la preparazione di tessuti e l&#39;esecuzione di analisi istologica del roditore dell&#39;intestino 18,19 rispettivamente. Il protocollo delineato in questa pubblicazione presenta una versione migliorata del metodo originale che permette per la preparazione dei tessuti tempestive e affidabili per scopi diagnostici. questa tecnica modificata permette di collezioni e la preparazione del epitelio intestinale per le tecniche universalmente utilizzati, come immunoistochimica, immunofluorescenza, così efficienti come ibridazione in situ (fluorescente e cromogenico 20). Inoltre, il tessuto modificato provino metodo di preparazione utilizza reagenti facilmente disponibili e relativamente poco costoso, mentre offrono un metodo di fissaggio del tessuto rapida e permette il recupero di proteine, DNA e RNA per valutazione supplementare. Tratto insieme, thitecnica s è eccellente per la valutazione completa delle caratteristiche istopatologiche, patologiche e molecolari del epitelio intestinale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Stainless Steel Dissecting Kits</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25640-002</td>
			<td style="width:403px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Decloaking Chamber</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Syringe 10ml</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td>
			<td style="width:179px;">Simport</td>
			<td>M515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Manual Slide Staining Set</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish Green</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish White</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Oven</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td>6243</td>
			<td>for baking slides at 65 degree</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Methanol</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>281000ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Xylene</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Hydrogen peroxide 25% solution in water</td>
			<td style="width:179px;">ACROS</td>
			<td>202465000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10% bufered formalin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Bovine serum fraction V, heat shock</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Tween 20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gavage needle</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20068-624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Klf5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-22797</td>
			<td>Dilution 1: 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Chicken anti EGFP antibody</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB16901</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">CRM325B</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">M3R533L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Warp red chromogen kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">WR806 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lgr5-EGFP/CreERT2 mice&#160;</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>008875&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Automated processor</td>
			<td style="width:179px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

La tecnica di laminazione svizzero in combinazione con colorazione immunoistochimica permette di un&#39;analisi completa del tessuto intestinale piccola o grande. L&#39;esempio di colorazione H &amp; E di un crasso di un C57BL / 6 del mouse (figura 1) è un esempio di fattibilità e l&#39;efficacia di questa tecnica. Come mostrato in figura 1, l&#39;immagine è in grado di catturare tutte le porzioni del colon: prossimale, medio e distale. Così, permett...

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Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l&#39;imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l&#39;identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.

Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

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Research

JoVE Journal

Biology

67.9K Views.  Stony Brook University School of Medicine.  accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse. 

Video: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Ricerca

Biologia

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Rilevazione immunofluorescenza di due analoghi della timidina (CldU e IDU) in tessuto primario

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

Le analisi per i dati di traiettoria pedonale Lo spazio-tempo di attività di studio

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...