Bu çalışma Bilim, Teknoloji ve (KEK için) Araştırmaları Çekirdek Finansman Ajansı tarafından desteklenmiştir.

Open access fees for this article were provided by, Agilent Technologies.

Bu çalışma, monositler olgunlaşmamış MoDC&#39;ler, tolerojenik MoDC&#39;ler ve olgun MoDC&#39;ler arasından oluşturmak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol önemli adımlar aşağıdaki paragraflarda ayrıntılı olarak ele alınmaktadır. İnsan periferal kan ve bu protokol uygulanmalıdır insan kanı kullanım için genel önlemleri bir başlangıç ​​malzemesi olarak kullanılır dikkat etmek önemlidir. Insanlarda 24, kemik iliğinden DH&#39;leri elde etmek teknik olarak mümkün olmakla birlikte, periferal kanında bulunan hücrelerden in vitro DC farklılaşma nedeniyle kemik iliği ile karşılaştırıldığında periferal kan mevcudiyeti tercih edilir. Periferik kanda bulunan hücreler, hematopoietik CD34 + kök hücreleri ve monositler yaygın DH&#39;ler in vitro üretimi için kullanılır. Hematopoetik CD34 + hücreleri daha sonra Langerhans ayrılırlar CD1a + ve CD14 + alt elde etmek için, GM-CSF ve TNF-a ile birlikte kültürlenir kökhücreler ve dendritik hücreler gibi. Bunun aksine, monositlerin olgunlaşmamış MoDC&#39;ler oluşturmak için, GM-CSF ve IL-4 ile kültürlendi. Çeşitli protokoller periferik kandan monositler zenginleştirilmesi için kullanılır; örneğin, plastik tabaklar, ayırımı ve izolasyon kiti 25, 26 bağlılık, yapışma protokol avantajları hücreleri en az zarar ve nispeten Ancak saflık tehlikeye olabilir hücre maliyetli.; ve fazladan bir adım daha ileri deneyler için hücreleri ayırmak için gereklidir. Elutriasyon büyüklüğüne ve yoğunluğuna göre hücreleri ayıran bir tekniktir. ayırımı avantajları, hücre canlılığı ve monositler hali hazırda başka deneyler için kullanılabilir; Bununla birlikte bu teknik, bir elutriatörü kullanılabilirliği ve benzeri sedimentasyon parametreleri farklı hücre (T hücreleri ve monositler) ayırmak için yetersizlik ile sınırlıdır. Ticari olarak mevcut izolasyon kitleri ya olumlu seçmek için manyetik mikrobilyeleri kullanmak veyaolumsuz monositik nüfus seçin. İzole monositler (belirteçler ya da mikro-bağlı değildir) &quot;el değmemiş&quot; kalır gibi bazı protokoller negatif seçim kullanarak monosit izolasyon karşı önyargılı olan. Bu protokolde, CD14 boncuk PBMC&#39;lerden pozitif seçkin insan monositleri için kullanıldı. CD14 sitoplazmik alam ve CD14 antikorun bağlanma sinyal iletimini tetiklemez. Ayrıca, mikroboncuklarının farklılaşma sürecini aksatmayacak dolayısıyla kültürden sonra monositler ayırmak ve olacaktır. Buna ek olarak, CD14 En güçlü monositlerde ve zayıf nötrofil ve bazı miyeloid dendritik hücreler, diğer yöntemlerle 17 daha yüksek hücre saflıkta yalıtım sonuçları bu nedenle bu yöntem üzerinde ifade edilir. Kan monositler DC&#39;lere veya makrofajlar içine ayırt edilebilir ve monositlerin kaderi büyük ölçüde sitokin ortamına bağlıdır. Bu yazıda, MoDC&#39;ler (GM granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörü eklenerek oluşturulan-CSF) Ve insan periferik kan monositleri İnterlökin 4 (IL-4). GM-CSF, monosit hayatta kalma ve IL-4 makrofaj farklılaşması üzerinde bir inhibisyon aktivitesi uyguladığı için gereklidir; ve monositler GM-SCSF ve IL-4 kombinatoryal ilaveli bağımsız sitokin 27 göre olgunlaşmamış MoDC&#39;ler daha yüksek bir yüzde verim. Periferal kan monositleri, 28, 29, 30, tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) ve interlökin 13 (IL-13) eklenerek MoDC&#39;ler üreten diğer protokoller vardır. GM-CSF ve IL-4 birleşmesiyle immünojenik veya tolerojenik MoDC&#39;ler ayrışmıştır ve Th1, Th2 veya Th17 teşvik MoDC&#39;ler olarak polarize plastik olgun olmayan DH&#39;ler oluşturur kabul edilen bir protokole 1990&#39;larda optimize edildi ve. Olgunlaşmamış MoDC&#39;ler vitamin D3 ve deksametazon ilavesiyle tolerojenik MoDC&#39;ler ayrılır. Örneğin tolerojenik DC&#39;ler oluşturmak için birkaç protokoller aracılığıyla vardırnükleer faktör-kappa B (NF-kB) önlenmesi, β-katenin aktivasyonu, D3 vitamini, Deksametason ve rapamisin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Tek başına vitamin D3 ve deksametazon hem DH&#39;ler, tek tek ilaç kullanıldığında daha alloproliferation daha büyük bir bastırma vitamin D3 ve deksametazon sonucu kombinasyonu üzerinde tolerojenik etkisini sağlamak için rapor edilmiştir, ancak. Bu nedenle, bir tolerogenik DC&#39;lerin üretimi için, mevcut protokolü vitamin D3 ve deksametazon bir kombinasyonu için değiştirildi. Bu yöntem şu anda tedavi programı ile insan tolerojenik DC&#39;ler için bir model olarak kabul ediliyor. Yeniden D3 vitamini ve deksametazon kısa bir raf ömrüne sahip olduğunu not etmek de önemlidir. Bu protokol, lipopolisakkaritlerin (LPS) bir DH olgunlaşma teşvik edici olarak ilave edildi. Olgunlaşmamış MoDC&#39;ler pro-enflamatuar bir kokteyl ile olgunlaştırma indüklenebilir:(TNF-α), interlökin 1 p (IL-1β), interlökin 6 (IL-6) ve prostaglandin E2) veya pro-enflamatuar sitokinleri (TNF-α ve interferon y (IFN-Γ)). Pro-iltihabik bir kokteyl, yüksek ko-stimülatör ve gezici fonksiyonları olgun MoDC&#39;ler oluşturur fakat, IL-12, 38, nispeten düşük seviyelerde üretir. TNF-α ya da IFN-Γ başına sabit bir dendritik fenotipi 39 uyarabildiği değildir. LPS, Toll-benzeri reseptör 4 (TLR4) uyaran DH olgunlaşmasını indükleme, NF-kB ve mitojen ile aktive edilmiş protein kinazın (MAPK&#39;lar) aktivasyonunu aracılık eder. LPS ile indüklenen DH olgunlaşma DH olgunlaşma belirteçleri (CD83, CD86, HLA-DR), bir yukarı-regülasyonu gösterir ve aynı zamanda, IL-12p70 üretimi yol açtı. Buna ek olarak, bu adım daha ileri klinik kanser aşıları için olgun DC&#39;ler üretmek için TLR3 agonistleri ile LPS eşleştirmek için modifiye edilebilir. Bu yazıda, tolerojenik DCler LPS tedavisi üzerine olgunlaşma dirençli olduğu gösterilmiştir. Bu DC&#39;ler immünojenik değildir ve relea yok gibi yarı-olgunse pro-inflamatuar sitokinler 40. Bu protokolün sınırlamalar farklılaşma sürecinde yalan. süreç yüksek verimlilik analizleri içine adapte edilecek bir zorluk teşkil Gün 7 Gün 0 8 gün sürer. protokolde bir değişiklik farklılaşma sürecini kısaltmak henüz farklı devletler yaşayabilir DC&#39;lere yüksek sayıda elde etmek için gereklidir. İkincisi, DH&#39;ler bu protokol sitokinlerin ilave edilerek üretilen ve bu sitokinler uzun süre DC nüfus sürdürmek değil. Ayrıca, sitokinler konsantrasyonlarda in vivo çok daha yüksek kullanıldığı ve in vitro DC&#39;ler fizyolojik özdeş olmayan yolların yanlı gelişimine neden olabilir. DC öncüleri in vitro kültürler, örneğin in vivo 41 normal DC farklılaşması için çok önemli bir sitokin değildir GM-CSF, yanıt gösterilmiştir. Bununla birlikte, sitokin stimülasyonu geni için yararlı bir yöntem olabilirdeney için in vitro DC yüksek sayıda oranı. Gibi immünofloresan boyama gibi diğer analizlere bu protokol oluşturulan bu hücrelerin tabi akım sitometri yeteneği, allo reaksiyon çalışmaları ve metabolik çalışmalar bu yöntemin yararını artırır. Bunlar in vitro DC&#39;ler in vivo DC&#39;lere nadir numaraları ile yapmak daha önce zor DC geliştirme, olgunlaşma ve antijen sunum bilgisini geliştirmek için iyi bir model olarak hizmet vermektedir. Tolerans karşı immünolojik bağışıklık düzenleyen DCler yeteneği olanağına kanser ve otoimmün hastalıklar 42, 43, 44, 45 karşı terapötik çekici adaylar yapar. Bu protokol oluşturulan immünojenik DC&#39;ler bulaşıcı hastalıklara ve tümörlere karşı aşı etkinliğini arttırmak için kullanılabilir; tolerojenik DC&#39;ler istenmeyen T hücre yanıtları kontrol ve transplantasyon sonrası ret önlemek için kullanılabilir iken. karışıkdokunulmazlık ve hoşgörü arasındaki denge DC farklılaşma durumuna ilişkin son derece bağlıdır. DC farklılaşma çoklu sinyal yollar ve metabolik kader tarafından yönetilir koordineli bir hücresel bir programdır. DC Farklı farklılaşma durumları biyoenerjitik ve biyosentez ihtiyaçları farklıdır; dinlenme durumunda DCler ile karşılaştırıldığında, örneğin, aktive edilmiş DCler hayatta kalma ve taşıma için önemli bir daha enerjik metabolik uyarlamaları gerektirmektedir. O D3 vitamini, deksametason ve rapamisin tolerojenik DCler uyarabilme özellikleri için bilinen dikkat etmek önemlidir, DC metabolizmasını etkileme tarif edilmiştir. Bu yazıda, farklı farklılaşma devletler MoDC&#39;ler enerjik metabolizma dışı akı analizörleri kullanılarak karakterize edilmiştir ve tolerojenik MoDC&#39;ler yüksek metabolik plastisite ve LPS olgunlaşma bu plastisite azalma sergiledi. Katabolik metabolizmasını etkiler tolerojenik DC 46 işlevleriyle Anabolik metabolizması DC&#39;ler olgunlaşmasını destekler. DC&#39;lerBu protokol oluşturulan terapötik bağışıklık ve hoşgörüyü değiştirerek tuşunu basılı tutun DH&#39;lerin metabolik durumunu değiştirerek olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, DCS &#39;immun fonksiyonları çalışmak için çok önemli olgunlaşmamış, tolerojenik ve olgun MoDC&#39;ler nesil için bir protokol sundu.

Jolles 1 tarafından başvurulan ve profesyonel antijen sunan hücreler 2 olarak tanınan 1973 yılında Ralph Steinman ve Zanvil Cohn tarafından karakterize edilen DC ilk on dokuzuncu yüzyılın sonunda Paul Langerhans (Langerhans hücreleri) tarafından tanımlanmıştır. DH&#39;ler periferik kanda ve (Langerhans hücrelerinin olarak mevcut) kaplama olarak ve etkinleştirme burun, akciğer, mide ve bağırsaklar astarları dış ortama maruz kalan dokularda özellikle bol miktarda vücut pek çok dokusunda bulunan onları dışsal antijenler karşılaşmaya. Olgunlaşmamış DC&#39;ler T hücrelerini 3 uyarmak için endositik kapasitesine sahip, ancak nispeten düşük kapasiteye sahiptir. Olgunlaşmamış DC&#39;ler çeşitli örüntü tanıma reseptörleri (PRR) yakalayan patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPS) veya hasar ilişkili moleküler şekilleri (Damps) 4 ifade eder. Kendi kendine moleküller T hücresi unresponsivene neden olurlar aktive tehlike sinyalleri imünojenik DCler doğru olgunlaşmasını sürücüss ve apoptoz 5. Immünojenik DH&#39;ler MHC molekülleri ve yardımcı uyarıcı yüzey molekülleri ve tecrübesiz T hücreleri 6,7 kabiliyetleri upregülasyonu ile karakterize edilir. Olgunlaşmamış DC&#39;ler ayrıca D3 vitamini metaboliti 1a, 25 (O) 2 D3 ve bazı bağışıklık bastırıcı maddeler Interleukin-10 (IL-10) gibi, deksametazon ve 8-9 rapamisin karşılık olarak bir regülatör T oluşturan ya da tolerojenik durumuna doğru olgunlaşmış edilebilir. Tolerojenik DH&#39;ler yüzey reseptörleri ve ligandları ihtiva eden immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifleri (ITIMs) kendi ekspresyonu ile karakterize edilir. Tolerojenik DC&#39;lerde ILT aile üyeleri, ILT3 ve ILT4 içeren ITIMs sinyal iletim alloproliferation inhibe ve Foxp3 + Treg genişleme 10,11 sürücü. Tolerojenik DC&#39;lerin Bu benzersiz özellikleri in vivo olarak derin potens, nakledilen allojenik greft ve SUPPR dayanıklı tolerans yaratacak yani yetenek yolotoimmün hastalıkların gelişiminin ESS. Tolerojenik DH&#39;ler immün aktivasyon inhibisyonu işlev olgun polarize DClerin bir alt tipi, bu nedenle görülebilir. Plasmasitoid DC&#39;ler ve miyeloid DC&#39;lerin 12: Şu anda, insan periferik kan dendritik hücrelerin iki genel alt kümeleri vardır. Sirkülasyon DH&#39;ler insan kanında lökositlerin% 2&#39;den daha az nadir Oluşturulması ve bu da bağışıklık işlevlerini çalışma DH&#39;lerin uygun sayıda izole edilmesi için bir zorluk teşkil etmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, monosit farklılaşmış DCler dendritik hücre fonksiyonlarının araştırılmasında bir in vitro modeli olarak kullanılır. Bunlar in vitro DC&#39;ler in vivo DC&#39;lere karşılaştırıldığında benzer reseptörleri ve işlevlere sahiptir. In vivo DClerin ve in vitro oluşturulan monosit türevli DC&#39;lerin (MoDC&#39;ler) Ayrıntılı karşılaştırma diğer laboratuvarlar 13, 14, 15 ile incelenmiştir. Aynı zamanda, bu MoDC&#39;ler ve CD bildirilmektedir1c + DC&#39;ler antijen sunan ve T hücre fonksiyonunu 15 indükleyici eşdeğer idi. Bu yazıda, periferik kan monositlerinden olgunlaşmamış MoDC&#39;ler üreten ve daha sonra bağışıklık ve tolerojenik DC&#39;lere içine ayırt bir yöntem açıklanmaktadır. Bu monosit türevli dendritik hücreler (MoDC&#39;ler) yüzey belirteçleri, sitokin profili, immün düzenleyici ve metabolik Devletler ile karakterize edilir. Immünojenik ve tolerojenik dendritik hücreler allojenik T hücreleri veya düzenleyici T hücrelerinin, ya genişlemesi sonucu farklı sitokinler üretirler. Bu yazıda, sitokin profil multipleks teknolojisi kullanan sistemler ile yapılır. hücrelerin büyüme ortamına antikorun hareketsizleştirildiği renk kodlu boncuklar ile inkübe edildi ve kompakt bir analizör okunur. DH&#39;lerin metabolik durumları glikolitik yansıtan oksijen tüketim hızı, hücresel solunum bir göstergesi ve hücre dışı asitlenme hızı ölçmek dışı akı analizörleri kullanılarak analiz edilmektedirdendritik hücreler akı. Bu biyoenerjetiğin oranlarının ölçümü dendritik hücre gelişimi ve işlevi hayati olan hücresel metabolizma değişiklikleri izlemek için bir araç sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius stedim biotech</td>
			<td>17597</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs kit</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070103</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate 
			Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11140-040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15575</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l2755</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated HLADR&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD83&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556855</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD14&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-242</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated BDCA3&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated ILT3&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5139-73</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PerCP- conjugated Mab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400250</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PE- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			APC- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>BD LSR II&#160;</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytofix/cytoperm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/CY7-conjugated CD25</td>
			<td>BD pharmingen</td>
			<td>557753</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/CY7-conjugated CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300512</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300428</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliplex MAP Human 
			Cytokine/Chemokine 
			magnetic bead panel</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HCYTOMAG-60K</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Sheath Fluid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SHEATHFLUID</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXMAP 3D system with xPONENT software</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>FLEXMAP 3D</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9082</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay Medium (OCR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102352-000</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Base Medium (ECAR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000&#160;</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Cell Mito Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Glycolysis Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103020-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes

Antijen spesifik olmayan doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve antijene spesifik adaptif bağışıklık sistemi arasında karmaşık bir etkileşim immün yanıt ile sonuçlanır. Bağışıklık sistemi kendinden moleküllere tolerans korumak ve patojenlere karşı hızla tepki sabit bir dengedir. Dendritik hücreler (DC) uyarlayıcı bağışıklık sisteminin doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağlantı ve kendine ile kendi-olmayan arasındaki uyumlu tepki dengesi güçlü bir profesyonel antijen sunan hücrelerdir. matürasyon sinyallerine bağlı olarak, olgun olmayan dendritik hücreler, seçici olarak immünojenik veya tolerojenik DH&#39;lere ayırt etmek için uyarılabilir. Immünojenik dendritik hücreler klonal genişleme için antijene özel T hücrelerinin proliferasyon sinyallerinin sağlanması; tolerojenik dendritik hücreler, antijene spesifik T-hücresi silinmesi veya düzenleyici T hücrelerinin klonal büyümesi ile tolerans düzenler ise. Sahip olduğu bu özelliği, dendritik hücreler, yüksek kanser ve otoimmün dise gibi terapötik maddeler arananases. Dendritik hücreler, in vitro olarak spesifik antijenlerle yüklendi ve imünojenik ve tolerojenik hem belirli bir bağışıklık tepkisi oluşturmak için, insan vücudu içine enjekte edilebilir. Bu çalışma yüzeyi işaretleyici ifade, fonksiyon ve metabolik fenotipleri farklı monositler, olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücreler (MoDC&#39;ler), tolerojenik ve olgun MoDC&#39;ler gelen in vitro oluşturmak için bir araç sunuyor.

Monosit Arıtma ve Dendritik Hücre Farklılaşması Monositler CD14 + olgun olmayan dendritik hücreleri elde etmek için, GM-CSF ve IL-4 varlığında tam ortam içinde pozitif seçim manyetik ayırma (Şekil 1 b) ve kültürlenmiş (ardından, periferal kan (Şekil 1A) yoğunluk santrifüj ile PBMC&#39;lerden saflaştırılmıştır Şekil 2A). Vitamin D3 ve deksametazon sonrası, GM-CSF ve IL-4 ilavesi tolerojenik MoDC&#39;ler (Şekil 2B), immatür MoDC&#39;ler farklılaşması ile sonuçlanmıştır. LPS olgunlaşması (Şekil 2D) direnç doğrulamak için LPS ile stimüle edildi MoDC&#39;ler (Şekil 2C) ve tolerojenik MoDC&#39;ler olgun olgunlaşmamış MoDC&#39;ler olgunlaşmasını indüklediği ilave edildi. Bu çalışmada kullanılan kan numuneleri mi Sağlıklı vericilerden elde edilenrazı olmak. MoDC Karakterizasyon Akış Sitometrisi ile Marker Karakterizasyonu Yüzey DC yüzey markerlerinin analizi, olgun MoDC&#39;ler LPS ile muamele tolerojenik MoDC&#39;ler, tolerojenik MoDC&#39;ler ve olgunlaşmamış MoDC&#39;ler (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında matürasyon belirteçleri HLA-DR, CD83 ve CD86 arasında, en yüksek seviyelerini ifade olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, LPS uyarımı şu olgunlaşmamış MoDC&#39;ler karşılaştırıldığında tolerojenik MoDC&#39;ler olgunlaşma dirençli olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, bir tolerogenik MoDC&#39;ler LPS ile muamele edilmiş ve tolerojenik MoDC&#39;ler olgun ve olgun MoDC&#39;ler karşılaştırıldığında CD14, BDCA3 (CD141) ve immunoglobulin benzeri transkript (ILT) 3 artan ifadesi sergilemiştir. Burada üretilen tolerojenik MoDC&#39;ler önceki raporlarda 23 ile uyumludur. MoDC&#39;ler fonksiyonel karakterizasyonu olgunlaşması için uyarılan MoDC&#39;ler immünojenik olur ve CD4 + T-hücrelerinin çoğalmasını teşvik sitokinler bırakın. Bu eş-kültürlenen T-hücrelerinin çoğalmasının ölçülmesi ile, farklı MoDC alt tiplerinin immünojenikliğini değerlendirildi. CD4 + T hücreleri, düşük alloproliferation (Şekil 4A) ile gösterildiği gibi tolerojenik MoDC&#39;ler olgun MoDC&#39;ler karşılaştırıldığında zayıf imünojenik idi. Tolerojenik MoDC&#39;ler düşük IFN-y, CD4 + T-hücreleri (Şekil 4B) ile birlikte alloreaction ko-kültürlerde, düşük bir IL-12p40 ve yüksek IL-10 sitokin üretimi ile karakterize edilmektedir. Bundan başka, olgun MoDC&#39;ler arasında tolerojenik MoDC&#39;ler sayısının artırılması ko-kültürler neden allospesifik CD4 + T hücreleri, CD25, yüksek Foxp3 + regülatör T hücreleri (Şekil 4C) sıklığını artmıştır. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; Mitokondriyal Aktivite Analizi Kırmızı CMXRos MoDC&#39;ler mitokondriyal membran potansiyeli seviyelerini analiz etmek için mitokondriyal aktiviteyi yansıtmak için kullanılır. Tolerojenik MoDC&#39;ler Diğer MoDC farklılaşmış alt tipi (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir mitokondriyal etkinliğe sahip olduğu gözlenmiştir. Daha sonra, mitokondriyal oksijen tüketim hızı (OCR) bir Bioanalyzer kullanarak farklı MoDC alt tipleri için değerlendirilir. OCR ölçümleri de dahil olmak üzere, ancak bazal solunum, yedek solunum kapasitesi, proton kaçak sigara mitokondriyal solunum bunlarla sınırlı olmamak bilgi veren, metabolik profile yüksek çözünürlüklü anlayışlar sağlar. OCR ölçümü strese cevap hücreleri yeteneğinin tayin edilmesi için bir araç sağlar. Hücreler metabolik arkaya üç farklı bileşiklerin ilave edilmesi ile altüst. İlk enjeksiyon Ol olanATP sentezini inhibe, elektron taşıma zinciri (ETC) karmaşık V inhibe igomycin (ATP çoğaltıcı). Bu adım ATP sentezi için tüketilen oksijen yüzdesini ve iç mitokondrial membran boyunca proton sızıntısı üstesinden gelmek için tüketilen oksijen yüzdesini ayırır. ikinci enjeksiyon olmadan, mitokondriyal zarından yerine mitokondriyal membran potansiyeli çöküşü enerji ve oksijen hızlı tüketimine yol açar Kompleksi V. proton kanalından hidrojen iyonları taşıyan ATP sentezini bozar FCCP (ETC hızlandırıcı) &#39;dir ATP&#39;nin nesil. FCCP tedavisi hücrelerinin fazlalık solunum kapasitesinin hesaplanması için de kullanılabilir. stres koşulları altında yedek solunum kapasitesinin korunması, hücre hayatta kalması için kritik önem taşır. Bu kapasite ETC katılan enzimlerin substrat kullanılabilirliği ve fonksiyonel kapasite gibi çeşitli faktörlere göre belirlenir Üçüncü enjeksiyon Rotenone bir YAPIM bir kombinasyonudurex I inhibitörü ve antimisin, Kompleks III inhibitörü. Bu kombinasyon mitokondriyal solunum kapanır ve OCR engelli mitokondriyal fonksiyon (Şekil 5C) bir sonucu olarak azalma görülmektedir. Tolerojenik MoDC&#39;ler olgun MoDC&#39;ler (Şekil 5D) daha yüksek bazal OCR düzeyleri görüntülenir. Buna ek olarak, tolerojenik, LPS tolerojenik ve olgunlaşmamış MoDC&#39;ler olgun MoDC&#39;ler (Şekil 5E) ile karşılaştırıldığında yedek solunum kapasitesi artış gösterdi. MoDC&#39;ler metabolik Karakterizasyonu Laktik asit ve protonların glikoliz sırasında hücrelerden salınan aldığından, hücre dışı asidifikasyon (ECAR) (Şekil 6B) hızının gerçek zamanlı analizini gerçekleştirerek MoDC&#39;ler glikolitik aktivitesi analiz edilmiştir. glükoz bulunan, tüm MoDC&#39;ler glikolitik oranı ile bazal aşamaya nazaran artmışOlgunlaşmamış MoDC&#39;ler (Şekil 6D) daha yüksek glikolitik oranı sergileyen olgun MoDC&#39;ler. Tolerojenik ve olgunlaşmamış MoDC&#39;ler LPS ile muamele MoDC&#39;ler (Şekil 6B) ile karşılaştırıldığında (glikoz mevcudiyetinde oligomycin neden olduğu) daha yüksek bir maksimum glikolizi sergilemiştir. Tolerojenik ve olgunlaşmamış MoDC&#39;ler glikolitik kapasite olgun MoDC&#39;ler (Şekil 6E) daha yüksek bulunmuştur. Yüksek glikolitik oranda aksine, glikolitik rezerv olgun MoDC&#39;ler (Şekil 6F) en düşük oldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> Şekil 1:. Periferik kan monosit saflaştırma (A) kan 25 mi dikkatle santrifüj işleminden önce 50 mi tüp başına Ficoll 15 ml üzerine katmanlı. PBMC yoğunluk santrifüj sonrası plazma altındaki bir katmanın altında konsantre edilir. (B) PBMC conj olan mikro boncuklar ile inkübe edilir<html> insan CD14 antikorları (izotipi: fare IgG2a) monoklonal ugated. CD14 + monositler izole etmek için bir Ayırıcı manyetik alan içine yerleştirilen bir kolona yüklendi ve daha sonra <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> Şekil 2: MoDC&#39;ler Morfolojik Karakterizasyonu. (A), GM-CSF ve IL-4, 200 ng / ml olgun MoDC&#39;ler oluşturmak için Gün 0, 4 ve 6 üzerinde saflaştırılmıştır CD14 + monositleri eklenir; ve (B), 100 nM D3 vitamini ve 5 günde, 10 nM deksametason ile uyarılmaya ek bir adım tolerojenik MoDC&#39;ler oluşturur. Olgunlaşmamış MoDC&#39;ler ve tolerojenik MoDC&#39;ler (C) elde MoDC&#39;ler olgun ve (D) LPS tolerojenik MoDC&#39;ler için 6. günde 1 ug / ml LPS ile stimüle edilir.ttps: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> Şekil 3:. Akım Sitometrisi tolerojenik yüzey belirteçleri HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 ve LT3 salgılanma düzeyleri (yeşil), LPS tolerojenik (siyah), olgunlaşmamış (kırmızı) ile yüzey İşaretleyici karakterizasyonu olgun (mavi) MoDC&#39;ler. Izotip kontrolleri gri renkle gösterilir. her hücre tipi için ayrı histogram fluorofor yoğunluğu ve üst üste X ekseni günlük karşı Y ekseni hücre sayısı ile işaretlenmiştir. Tüm histogramlar dört bağımsız deneyi temsil etmektedir. 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Haziran 2015): Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI gelen modifiye edilmiştir. Çoğaltılabilir ve telif hakkı izni ile yayınlanamaz. Copyright 2015 Amerikan DerneğiBağışıklık, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> Şekil 4: MoDC&#39;ler fonksiyonel karakterizasyonu. (A), bir tolerogenik artan sayıları ile birlikte kültür ile uyarılan CD4 + T-hücrelerinin alloproliferation frekans ölçümü (TOS, yeşil), LPS ile tolerojenik (L-tol, siyah), olgunlaşmamış (IMM; kırmızı) ve olgun (MAT ; mavi) MoDC&#39;ler. dört bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir Dunnett çoklu karşılaştırma sonrası testi ile iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir olgun MoDC&#39;ler karşı tüm MoDC&#39;ler arasında + SEM İstatistiksel farklılıklar anlamına gelir. IFN-y (sol panel), IL-12p40 (orta panel) ve IL (B) Sitokin analizi 10 (sağ bölmesindeHer iki tolerojenik (yeşil), olgunlaşmamış (kırmızı) veya olgun (mavi) MoDC&#39;ler sayısındaki artış ile birlikte kültürlenmiş, CD4 + T-hücreleri arasında alloreactions süpernatanların l). Veriler altı bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; ± SEM (C), CD4 + T-hücresi alloproliferation ve tolerojenik MoDC&#39;ler sayısının artması varlığında, olgun MoDC&#39;ler sahip ortak-kültür tarafından uyarılan düzenleyici T hücrelerinin genişlemesini anlamına gelir. Sol Y ekseninde, CD4 + T-hücresi çoğalmasının sıklığı. Sağ Y ekseninde, CD25, yüksek Foxp3 + proliferatif CD4 + T-hücreleri üzerinde geçirilen hücreler sıklığı. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; ± SEM Dunnett çoklu karşılaştırma sonrası testi ile tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir tolerojenik MoDC&#39;ler yokluğu karşısında varlığı arasındaki istatistiksel farklılıkları anlamına gelir. (D) CD4 + T hücre alloproliferation (Sol) ve CD25highFoxP3 + hücrelerinin frekansı (Sağ) ko- tarafından uyarılan tolerojenik MoDC&#39;ler kültürOlgun MoDC&#39;ler artan sayıları varlığında gerçekleştirilebilir. Veriler iki, üç bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; olgun MoDC&#39;ler yokluğu Dunnett çoklu karşılaştırma sonrası testi ile iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir karşı ± SEM varlığı arasında istatistiksel farklılıklar anlamına gelir. 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Haziran 2015): Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI gelen modifiye edilmiştir. Çoğaltılabilir ve immünolojistler bir telif hakkı izni. Copyright 2015 The American Association ile yayınlanamaz, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> Şekil 5: MoDC&#39;ler mitokondrial faaliyeti analizi. (A) MoDC&#39;ler mitokondriyal membran potansiyeli seviyeleri (Kırmızı CMXRos) f ile elde edilmiştirDüşük sitometrik analizi. Dört bağımsız deneyin verileri toplandı. ± SEM (B), gerçek zamanlı bir mitokondriyal solunumun şematik gösterimi ortalama. bazal solunum gelen ve oligomycin ilave (kompleks V inhibisyonu), FCCP (maksimal solunum indüksiyon) ve rotenone / A karışımı antimycin (elektron taşıma zinciri [ETC] önleme) sonra başlayan OCR analizi. Mitokondriyal SRC (maksimum solunum çıkarılır maksimal bazal) OCR eğriden elde edilir. (C), bir tolerogenik mitokondri OCR (pmol / dakika) (yeşil TOL) içinde Örnek kinetik çalışma, LPS tolerojenik (L-tol, siyah) , olgunlaşmamış (İBB, kırmızı) ve olgun (MAT, mavi) oligomycin sıralı ilavesini (OLIG) MoDC&#39;ler ve bazal solunum, FCCP ve rotenone / A (Rot-AA) antimycin. (D) OCR miktar kullanarak MoDC&#39;ler ( E) MoDC&#39;ler solunum kapasitesini yedek. Veriler beş bağımsız deneyden toplandı. Ortalama ± SE10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Haziran 2015): M. Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI gelen modifiye edilmiştir. Çoğaltılabilir ve immünolojistler bir telif hakkı izni. Copyright 2015 The American Association ile yayınlanamaz, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> Şekil 6: MoDC&#39;ler metabolik Karakterizasyonu. (A) gerçek zamanlı glikoliz şematik gösterimi. ECAR analizi (maksimum hücre glikoliz ve kompleks V inhibisyonuna neden olan) oligomycin hücreler glükoz (glikoliz indüksiyonu) ilave edilir glukoz içermeyen ortam içinde inkübe edildiği taban ECAR arasında değişir, ve son olarak da 2-deoksi-D- glikoz(Glikoliz inhibisyon). Glikolitik oranı (bazal ECAR için çıkarılır glikoliz indüksiyon), glikolitik kapasitesi (bazal ECAR için çıkarılır maksimal glikoliz), ve glikolitik rezerv (maksimal glikoliz glikoliz indüksiyon için çıkarılır) ECAR eğrisi elde edilir. (B) Temsilcisi kinetik çalışma glikoliz bağımlı tolerojenik içinde ECAR (mph / dk) (yeşil TOL), LPS tolerojenik (siyah L-TOL), olgunlaşmamış (kırmızı İBB), ve olgun (MAT, mavi) glikoz (glukozit) sıralı ekleme kullanarak MoDC&#39;ler, oligomycin (OLIG), ve 2-DG. (C) Barlar bazal ECAR seviyeleri (D) glikolitik hızı (E) glikolitik kapasite ve (F) MoDC&#39;ler glikolitik rezerv göstermektedir. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; 6 SEM. İstatistiksel farklılıklar Tukey çoklu karşılaştırma son test tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. 10,4049 / jimmunol: Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI modifiye edilmiş.1303316 (1 Haziran 2015). Çoğaltılabilir ve immünolojistler bir telif hakkı izni. Copyright 2015 The American Association ile yayınlanamaz, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes at JoVE.com

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

generation-immature-mature-tolerogenic-dendritic-cells-with-differing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.9K Görüntüleme.  Agency for Science, Technology and Research. Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Video: Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...