Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) (Hibe MOP-119503) ve Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. NSERC ayrıca YD yaz studentships desteklenen ve AA YD 4 yıllık dostluk ödülü British Columbia Üniversitesi (UBC) tarafından desteklenen, AA lisans öğrencisi yüksek lisans ödülü (CGS-M) ile CIHR tarafından desteklenmektedir. Biz Şekil 2&#39;de görüntüler oluşturmak için kullanılan mikroskop ile yardım için Calvin Roskelley teşekkür ederiz. Biz de UBC Hayvan ve Sitometrisi Tesisleri destek kabul.

Fareler British Columbia Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre etik hayvan araştırmaları için Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi uyarınca ötenazi edildi. 1. Fare Femur ve Tibia bir Tek Hücre Kemik iliği Süspansiyon Kazanılması <ol><li> biyolojik güvenlik kabini (BSC)% 70 etanol ile, daha sonra temiz / sprey BSC yüzeyi kabine havayı temizlemek ve hava akış stabilizasyonu için izin prosedürü başlatmak için önce 15 dakika çalıştırınız. protokol bütünlüğü için mümkün olduğunca steril her şeyi tutmak. steril olmayan koşullarda kemikleri kesmeyin. </li><li> % 70 etanol içinde ıslatarak diseksiyon araçları hazırlanması,% 5 fetal dana serumu (HBSS-FCS), steril bir Petri kutularına (100 mm x 15 mm), 1 Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (diseksiyon makas forseps 2 çift 1 çift) BSC ml şırıngalar, 26½ gauge iğne konik toplama tüpleri (15 ml veya 50 mi), ve kağıt havlu. </li><li> kullanarak fare EuthanizeKurumun hayvan araştırma etik kurulu tarafından onaylandı protokolleri. BSC getirmek bir ya da iki kağıt havlu üstüne yerleştirin ve% 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> Kapağın 2 ml - BSC, kısım, tabana HBSS-FCS ve 10 mL 1 steril bir Petri kabı aseptik açın. </li><li> yukarı bakacak şekilde arka ile karnına fare yerleştirin ve non-dominant elin parmakları ile göğüs bölümleri çevresindeki deri kaldırın. cilt kaldırıldığı bir kesi yapmak için makas kullanın. </li><li> mide de kesi buluştuğu iki bitene kadar çekerek devam mide arkasından fare çevresindeki deri dışında çekin dikkatle kesilmiş iki ucunda, her el ile bir ucuna üzerinde tutmak ve. </li><li> yukarı bakacak şekilde mide fareyi Flip ve tek elle aşağı bacak doğru cilt alt yarısını çekme bacaklar maruz kadar deriyi geri çekerek tutun. </li><li> Fare up ayak tutun ve ayak bileği ekleminin üzerinde Aşil tendon kesilmiş vekasları bağlantı ligament makas ile tibia alt ucunda ayak. Bu bacak kemiklerinden ayak gevşetir. </li><li> yürüyerek bacak tutarken, alt bacak uyluk kaslarını koparmaya femur alt ucunda tüm diz eklem çevresindeki makasla kasları ve bağları kesti. nazikçe fibular ve femoral yüzeylerden gevşetti kasları çekmek için forseps kullanabilir. ağır kanamaya önlemek için femoral arter koparmaya dikkat edin. </li><li> Bir yandan ayak üzerinde tutan, kalça ekleminin femur üst ucunda bastırın açık makas, bacak döndürmek ve ücretsiz nihai kesim yapmak için makas kullanırken kalça ekleminden femur ayırmak için nazikçe çekin vücuttan bacak. </li><li> Bu noktadan itibaren, sadece steril forseps ile doku tutun. bir ucunda bacak üzerinde tutmak ve diğer ayak çekin. NOT: bağlantı ligament adımda kesilir gibi bu kadar kuvvet gerektirmeyecektir1.9. Alternatif olarak, sadece kemik kaynaşmıştır ayak bileği üzerinde tibia kesti. </li><li> bir forseps seti ve birbirleri ile tibia ve fibula proksimal ucu femur distal sonuna kadar bacak tutun, dikkatle femur ve patella onları ayırmak için diz ekleminin ters yönde tibia ve fibula bükün. </li><li> hala alt bacak kemikleri bağlı kalan ligament ve kasların aşağı çekmek için forseps kullanabilir. kemik iliği hücreleri için temizlenip için çok küçük olarak burada, forseps ile bağ dokuları ile birlikte fibula çıkarın. ters Petri kabı kapağı temizlenmiş tibia yerleştirin. </li><li> bir forseps seti ve birbirleri ile patella ile femur alt ucunu tutun kaldırılması için eklemin ters yönde Patellayı ve çevre dokulara bükün. Sonra femur gelen bağ dokuları kalan kapalı temiz; forseps ile onları uzağa çekerek ve ters Petri kabı kapağı üzerine yerleştirin. patellayı atın. </li><li> 1.7 tekrarlayın- Diğer bacak ile 1.13 gerekirse. Gerekirse ulaşım için 1 ml steril HBSS-FCS içeren 1.6 ml mikrosantrifüj tüplerine kemikleri aktarın. </li><li> 1 ile ters Petri kabı kapağı kemikleri yerleştirin - HBSS-FCS 2 ml hala tibia ve femur bağlı herhangi bir kalıntı doku temizlemek için forseps kullanabilir, daha sonra HBSS- 10 ml içeren Petri kabı tabanına kemikleri aktarmak FCS. Alternatif olarak, kemikleri temizlemek ve% 70 etanol batırılmış doku kullanılarak ekli kas doku kaldırmak. </li><li> makasla ikiye kemiklerin her kesin. kemikler çanak kalmak sağlamak için keserken Kısmen steril kapaklı Petri kabı kalkan. Seçenek olarak ise, bir sonraki aşamada yıkama izin vermek için her bir kemik ucu kesin. </li><li> 1 ml şırınga üzerine 26½ G iğne takın ve Petri kabı, 1 ml HBSS-FCS hazırlar. Bir kemik parçasının ucuna iğne ucu yerleştirin ve kemik iliği hücreleri (kemiklerin içindeki yumuşak kırmızı doku) dışarı floş. kafasının içine iğne takınkemik ve açık ucun, tüm kırmızı renkli ilik kaldırılıncaya kadar. renk beyaz olarak kemikleri gözlemleyin. </li><li> tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere şırınga ile bir kaç kez kemik iliği görünür bir kümeleri geçirin. </li><li> kızarmış kemikleri atın. iyi hücre süspansiyonu karıştırın ve toplama tüpüne transfer etmek için 10 ml pipet kullanın. çanak artık hücreleri toplamak için HBSS-FCS 5 ml ile bir kez Petri kabı durulayın. buz üzerinde hücreleri yerleştirin. Not: 2 saklandığında kemik iliği hücre süspansiyonu hala canlı olması - 4 ° C&#39;de 3 saat süredir. </li></ol> Kemik İliği Hücrelerinin 2. Kaplama ve Kültürleme (BMCs) <ol><li> Aşağıdaki reaktifler ve sarf malzemeleri hazırlayın. <ol><li> 2 mM Tris pH 7.2 nihai bir çözelti içinde% 0.84 amonyum klorür yaparak kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu, daha sonra bir 0.2 mikron filtre içinden süzme ile sterilize edin. </li><li> % 10 FCS, 20 mM HEPES, 1 x esansiyel olmayan amino asit, 55 ve # ekleyerek BMC ortamı hazırlamak181; RPMI ortamı 1640 M 2-merkaptoetanol, 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 mM sodyum piruvat ve 2 mM L-glutamin. </li><li> Ticari olarak temin edilebilir biraraya getiren GM-CSF elde edilir veya GM-CSF geninin 20 ile transfekte AG8.653 miyeloma hücreleri süpernatant içeren GM-CSF kullanımı. ELISA ile yüzer GM-CSF konsantrasyonu belirlemek BMC ortamına 20 ng / ml eşdeğer ekleyin. </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de kemik iliği hücreleri aşağı doğru döndürün. pelet nedeniyle RBCs için, kırmızıdır. BSC, emme vakum dokunarak pelet gevşetin ve RBC parçalama tamponu 10 ml bağlanmış bir steril cam Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire. Girdap hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında RBC liziz tamponunda inkübe edilmesi. </li><li> HBSS-FCS sonra 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de hücreleri dönmeye ve süpernatant aspire 10 ml ekleyin. beyaz renk olarak hücre pelet gözlemleyin. BMC ortamı istenen hacmi içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> resu Sayısı% 0.4 tripan mavisi ile ölü hücreleri boyandıktan sonra bir hemositometre kullanılarak spended hücreleri. NOT: Bir bacak (tek tibia ve femur) kemik iliği kullanılırsa, BMC ortam 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücre süspansiyonu 10 ul alır ve mavi% 0.4 tripan 70 ul ile seyreltilmiş, iyice karıştırın ve 10 ul transfer hemositometre haznesine 1/8 hücre dilüsyonu. Dört çeyrek daireye canlı hücreleri saymak: dört kadran sayımı ortalama seyreltme faktörü x 10 4 = ml başına hücre sayısını x. RBC Parçalama işleminden sonra 4 x 10 7 hücre - Bir femur ve bir bacak bir tibia genellikle yaklaşık 2 verecektir. </li><li> Kültür sonunda deneyler için gerekli olan toplam hücre sayısına göre alt deneyler için gerekli olan kemik iliği kültürleri 10 mi yemekler kestirilebilir. NOT: Her yemeğin 2 x 10 6 kemik iliği ilk tohumlama hücreleri ve verimleri 5 gerektirir - 7. günde 10 x 10 6 hücre. <ol><li> Ali5 dakika boyunca 314 x g hızında aşağı spin, yeni bir tüp içine kaplama hücrelerin toplam sayısı quot süpernatan aspire ve BMC medya 4 x 10 6 hücre / ml&#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li><li> BMC ortamı 9.5 ml GM-CSF (rekombinant ya da süpernatan içeren GM-CSF ile ilgili), 200 ng içeren yeni bir steril 100 mm x 15 mm Petri kabı hazırlanır. 10 ml, 2 x 10 5 hücre / ml nihai konsantrasyon için Petri kabı merkezine 4 x 10 6 hücre / mL, kemik iliği hücrelerinin 500 ul ekle. NOT: steril Petri kabı değil bir doku kültürü çanak kullanmak önemlidir. Hücreleri eklerken Ayrıca, hücreler merkezde konsantre kalmasını sağlamak ve tohumlama sonrası ve ortam değişiklikleri sırasında yemekleri rahatsızlığı en aza indirmek. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. Bu kültürde gün 0&#39;dır. </li><li> 3. günde, hücreler her bir tabak için, GM-CSF, 200 ng içeren taze BMC, 10 mL ortam ilave edin. rahatsızlık o en aza indirmek için özensüspansiyon içinde konsantre hücre f. Hücre kültürünün toplam hacmi artık 20 ml&#39;dir. </li><li> 100X büyütmede ışık mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Çok sayıda yapışmaz hücreler (yuvarlak) ve birkaç yapışık hücrelere (düz) dikkat edin. Bir çiçeğin üç ya da dört benzer yaprakları gruplarda hücre proliferasyon gösteren görülebilir. </li><li> 6. günde bir buçuk medya değişikliğini gerçekleştirmek. Dikkatle 5 dakika, aspirat için 314 xg aşağı spin, steril 50 ml konik tüp içine medya 10 ml kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> GM-CSF, yavaşça girdap ve 20 ml toplam hacim için orijinal hücre kültür çanağı ekle 20 ng / ml ihtiva eden taze ortam, BMC, 10 ml hücre pelletini. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. NOT: Günlük 7 kültür% 70 olması ya da yapışık yassı hücreler ve yuvarlak yapışmayan hücrelerin yoğun bulutlar confluency daha fazla olmalıdır. </li></ol> 3. Toplama ve Akış Sitometri için BMDC ve BMDMs hazırlama <ol> &lt;li&gt; 4 ° C&#39;de tüm tamponları tutun. </li><li> hücreler, 50 ml&#39;lik konik bir toplama tüpüne kültür süpernatanının ilk transfer 10 mi hasat için günde 10 gün 7 hücreleri hasat, daha sonra yaklaşık 30 derece dikey çanak eğilme ve kalan 10 ml pipetleme bulaşık yıkama çanak üst kültürü. Bu yıkama 5 kez, üçte bir oranında çanak dönen her zaman tekrarlayın. </li><li> Aynı toplama tüpüne hücrelerin kalan 10 ml aktarın ve plaka ve yapışık hücreleri atın. NOT: yıkar yapışmayan ve gevşek yapışmış olan hücrelerin kaldıracaktır; Düz yapışmayan hücreler yıkama dayanıklıdır. Tipik olarak, 5 ila - 10 x 10 6 yapışmayan hücreler gün 7 ve 2 de bir plaka beklenen -, 10. günde 5 x 10 6 hücre Lutz ve ark, ancak. 10. günde bildirilmiştir 10 x 10 6 hücre yapışan hücreler, normal olarak alınmamıştır. Bununla birlikte, bu hücreler, gerekirse yapışmayan hücreler ile karşılaştırıldığında gerekenaşağıdaki gibi, çıkarılabilir. 1 x PBS, yapışmayan hücreler çıkarıldı sonra çanak pH 7.4 içinde 0.7 mM EDTA 5 ml, ayrı bir tüp içinde yapışmayan hücreler giderilmiş ve toplamak için yukarı ve aşağı 5 dakika, pipet için 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de toplanan hücreleri aşağı spin ve süpernatant aspire. 4 ° C&#39;de 5 ml steril BMC medyada süspanse, vorteks hafifçe karıştırın ve tripan mavi ve hemasitometre kullanarak saymak. NOT: 5 verecektir Her yemeğin - Bir gün 7 kültüründen 10 x 10 6 yapışmayan hücreler. Şu andan itibaren, 4 ° C&#39;de tüm adımları uygulayın. </li><li> Akış sitometrik analizi, 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp içine 2 x 10 5 hücre her bir örnek için transferi için, her bir 4 ° C (1 x fosfat tamponlu tuzlu su, 2 mM EDTA ve% 2 sığır serum albümini) FACS tampon 300 ul örnek. </li><li> 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin ve süpernatant aspire. bir görünür beyaz, opak pelet gözlemlemekTüpün alt. </li><li> Etiketlenmemiş Fc reseptörü Ab 100 ul içinde süspanse hücreleri (miyelom hücre çizgisi üreten 2.4G2 kullan 1/10 süpernatant) Fc reseptörü bloke etmek ve 4 ° C de 20 dakika inkübe etmek. Daha sonra 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de hücreleri aşağı spin, her bir örnek, yavaşça girdap için FACS tampon 300 ul ekleyin ve süpernatant aspire. </li><li> 0.2 ug / ml&#39;de CD11c-PeCy7 100 ul içinde süspanse hücreleri, 0.25 mg / ml&#39;de Gr1 Pasifik Mavi, 0.05 ug / ml&#39;de MHC II-APC, ve FL-HA yaklaşık / mL 2 ug makrofajlar ve DCS tespit etmek. NOT: FL-HA floresein ve horoz tarak hiyalüronik asit sodyum tuzu kullanılarak evde hazırlanan önceden 21 nitelendirdi. </li><li> Hücre yüzeyine bağlanmaya imkan vermek için, 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Her bir örnek FACS tampon 300 ul ekleyin, yavaşça girdap, sonra 4 ° C&#39;de 5 dakika 314 xg&#39;de hücreleri aşağı spin ve süpernatant aspire NOT:. Bio EğerFloresan-streptavidin ile 9 - tinylated antikorlar 3.8&#39;de kullanılan, 3.8 tekrarlayın. </li><li> karıştırın ve 5 dakika boyunca 314 xg&#39;de hücreleri aşağı spin FACS tampon başka 300 ul, yavaşça girdap hücreleri yıkayın. Süpernatant aspire ve 0.1 içeren FACS tamponda 200 ul hücrelerin tekrar süspansiyon - cansız hücreleri etiketlemek için propidyum iyodür veya DAPI ml&#39;si başına 0.2 ug. Hücreler artık akım sitometri analizi 22 için hazır. Sonuçları gör ve popülasyonların ayrıntılar için Şekil 3 ve hücreler nasıl kapı edildi: NOT. </li></ol>

<ol>
	<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+(CSF)+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities:+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation.">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).</li><li>Lari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+lineage+phenotypes+and+osteoclastogenesis--complexity+in+the+control+by+GM-CSF+and.">Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and.</a> Bone. 40 (2), 323-336 (2007).</li><li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures.">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li><li>Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand-generated+murine+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cells+differ+in+their+capacity+to+prime+naive+CD8+T+cells+and+to+generate+memory+cells+in+vivo.">Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo.</a> J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage.">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).</li><li>Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+culture+method+starting+with+early+growth+factors+permits+enhanced+production+of+functional+dendritic+cells+from+murine+splenocytes.">A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes.</a> J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).</li><li>Brasel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+synergizes+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+granulocyte+colony-stimulating+factor+to+mobilize+hematopoietic+progenitor+cells+into+the+peripheral+blood+of+mice.">Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice.</a> Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).</li><li>Segura, E., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+dendritic+cells+in+mice+and+humans.">Inflammatory dendritic cells in mice and humans.</a> Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immune+receptor+Dectin-1+upon+formation+of+a+'phagocytic+synapse.">Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse.</a> Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).</li><li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+of+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation.</a> Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).</li><li>Vander Lugt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+programming+of+dendritic+cells+for+enhanced+MHC+class+II+antigen+presentation.">Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation.</a> Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+regulates+alveolar+macrophage+differentiation+and+innate+immunity+in+the+lung+through+PU.1.">GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1.</a> Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+Macrophage-CSF+Dependent+Macrophage+Responses+by+In+Vitro+Models.">Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models.</a> J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Poon, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+Binding+Identifies+a+Functionally+Distinct+Alveolar+Macrophage-like+Population+in+Bone+Marrow-Derived+Dendritic+Cell+Cultures.">Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures.</a> J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).</li><li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c(+)MHCII(+)+Macrophages+and+Dendritic+Cells.">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li><li>Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+solicit+their+own+help+from+T+cells.">cells solicit their own help from T cells.</a> J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).</li><li>de Belder, A. N., Wik, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+fluorescein-labelled+hyaluronate.">Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate.</a> Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).</li><li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping.">Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+ligand+activation+of+murine+bone+marrow-derived+dendritic+cells.">Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells.</a> Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).</li><li>Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells:+'Exhausted'+or+Alert+and+Waiting.">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li><li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions.">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li><li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid.">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li><li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique.">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

Bu yazıda, Lutz ve ark., 6 uyarlanmış olan bir tek bir fare kemik iliği kültürü GM-CSF türetilmiş makrofajlar ve DCS üretilmesi için bir yöntem sağlar. Bu kültürde olgunlaşmamış DC&#39;lere ve makrofajlar olarak ayrılır bağlayıcı MHC II ifadesi ve FL-HA, daha önce zor olmuştur (Şekil 3C). Bu arada helft ve ark., 19 başka rapor ile, daha önce sadece DC&#39;ler olduğu düşünülen GM-CSF kaynaklı BMDC kültürlerin içinde heterojeniteyi göstermektedir. Helft ve ark., 19 de henüz belirgin bir makrofaj nüfus bulundu BMDCs oluşturmak için oldukça farklı kültür koşullarını kullanılır. GM-CSF kaynaklı makrofajlar makrofajların benzeyen ve FLT3 ligandı takviye BMDC kültürleri klasik ve plazmositoid DC&#39;lerin 3,4 üretmek ise GM-CSF kaynaklı DH&#39;ler, inflamatuar DC&#39;ler benzerler. Farklı DC ve makrofaj popülasyonları da in vivo un gözlenmektedirhomeostatik ve enflamatuar durumların der ve DC ve makrofaj 10 tanımlar ne gibi alanında pek çok tartışma var. Monosit türetilmiş enflamatuar DCler gelir ve bu da, bu BMC ilgili olduğunda bu durum özellikle geçerlidir. Belirli bir nüfus karakterize etmek için birden fazla fenotipik işaretleyiciler fonksiyonel veriler, ve büyük olasılıkla gen ekspresyon verileri kullanmak oldukça önemlidir. In vitro olarak DC ve makrofaj popülasyonu alt bölünmüş daha işlevsel ve fenotipik işaretleyiciler olarak keşfedilen fazla olabilir da mümkündür. Bu yöntemde, belirteçler CD11c Gr1, MHC II ve FL-HA BMC kültür Yapışmayan fraksiyon olgunlaşmamış ve olgunlaşmış dendritik hücrelerin makrofajlar ayırt etmek için kullanılır. Bu olgun DH&#39;ler bir makrofaj popülasyonu ayırt etmede CD11c kullanılan helft ve ark., 19, CD11b, CD115, CD135, MerTK ve MHC II farklıdır. MerTK ekspresyon seviyeleri distinguis olabilirmakrofajlar ile H (P1) ve DCS (P3) olgun ama olgun olmayan DH&#39;ler (P2) (Şekil 3B). Böylece FL-HA ve MHC II olgunlaşmamış ve olgun DC nüfus hem makrofajlar ayırt etmek kullanışlı göstergeleridir. Bu makrofajlar Bu BMC kültüründe DCS işlevsel farklıdır ve başka bir yerde, 18 daha ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Kısaca, LPS uyarıldıktan sonra BMC makrofajlar olgun DCler farklı sitokinler üretmek ve naif T hücrelerini aktive 18 yok. TNF-α LPS stimülasyonu üretmek henüz naif T hücrelerini aktive 18 edemiyoruz sonra bu makrofajlar de yakından hem bağlama FL-HA hem fenotipik ve fonksiyonel, makrofajların benzeyen ve CD11c, MerTK, CD200R, CD206 ve F4 / 80 ifade ve. Ancak, aynı zamanda farklılıklar vardır: BMC makrofajlar CD11b + ve bu hücrelerin düşündüren, ex-vivo alveoler makrofajlar kıyasla Siglec F düzeyi düşük olan benzer fakat tanımladı değilAlveoler makrofajlar cal. Bu protokolün başarı sağlamak için birkaç önemli adımlar vardır. Itibaren kemik iliği açığa gelen kısırlık korumak için çok önemlidir. ve BSC dışına taşırken, eldivenli elleri ve% 70 etanol ile nesneleri sprey. o sterilize etmek için% 70 etanol araçları durulama yararlı olmasına rağmen araçlar, hava-kurutun ve etanol onlarla temas kemikleri veya hücreleri getirmeden önce buharlaştı sağlamak, böylece, etanol, kemik iliği hücrelerine toksiktir. Buna ek olarak, kemik iliği hasat sırasında steril olmayan ekipman veya elleri ile fare doku ve hücrelerinin temas kaçının. penisilin ve streptomisin ilave ortam sağlanan, ancak, hücrelerin dikkatsiz kullanım maya veya mantar kirlenmeye yol açabilir. fagositik aktivite ile bağışıklık hücreleri bu kültürde üretilen bu yana ek olarak, küçük kirlilik sadece mikroskobik hücre kültürü gözlemleyerek tespit edilemeyebilir, böylece önemli t tespit etmektiro kontaminasyon imzalar. Örneğin, hücre sayısı azaltılabilir ve akış sitometrisi ile analiz edildiğinde CD40 ve CD86 gibi hücre aktivasyon markerlerinin ifadesi arttırılabilir. Medya rengi de kirlenme nedeniyle pH değişikliği yansıtan sarı dönüşebilir. kirlenme meydana geldiğinde, BMC kültür kullanılamaz. Deneysel tutarlılığı korumak için, vorteks ile kemik iliğinden tek bir hücre süspansiyonu üretmek ve BMC kültürleri kurmak için doğru bir hücre sayısını elde etmek için önemlidir. kemikten herhangi bağ dokusu tek bir hücre süspansiyonu biter Ayrıca, eğer, bunu kaldırmak için steril bir 70 mikron filtre ile filtre. 10 x 10 6 hücre - 7. günde yapışmayan fraksiyonunun bir plaka için normal hücre verimi 5 arasındadır. Hücre sayıları genellikle protokol de çalıştığını iyi bir göstergesidir. Lutz 10 x 10 6 hücre raporları ise, günde 10 6 10 x 5 hücre - Bu prosedür ile biz genellikle 2 ila edinin. Biz th RBC lizis gerçekleştirmekLutz ve ark protokolü ise E başlangıç ​​kemik iliği hücreleri. değil ve bu yüzden bu adım isteğe olabilir etmez. CD11c hücrelerinin yanısıra numaralarına makrofaj ve DH&#39;lerin oranlarda yüzdesi olarak varyasyonlar değişik kökenli ya da FCS gruplar ortaya ve böylece tutarlı deney sonuçları BMC kültürlerinde FCS yeni toplu test etmek için çok önemlidir. GM-CSF ml 40 ng / ml, 5 ng / arasında değişiyordu, bu önemli ölçüde hücre verimi etkilemedi. Hücre yoğunluğu da kültür olgunlaşmasını etkileyebilir. Örneğin, Helft ve diğ. Yüksek MHC II ifadesi 19, hücrelerin daha büyük bir yüzde üretilen 4 mi ortam içinde 1 x 10 7 hücre tohumlanır. Hücreler hasat zaman noktası, aynı zamanda yapışmayan fraksiyonunda popülasyonlarının yüzdesini etkileyebilir. Hücreler genellikle günler 7 arasında toplanan - 25-27 Ekim, ancak bazı çalışmalar günde 6 19,23,24 de BMCs toplamak. daha fazla hücre kültür BMCs gerekli iseAynı yoğunlukta 40 ml daha büyük, 150 mm x 15 mm Petri tabaklarda. Bu durumda, bir yarım hacmi ortam değiştirme yapılır iki gün 3 ve gün 6 (yani, çıkarılan ortam, hücreleri, aşağı döndürülmüştür ve 20 ng / ml rgm-CSF ile takviye edilmiş 20 ml taze ortam ile değiştirilir 20 mi). FL-HA BMC kültür olgunlaşmamış ve olgun DC&#39;lerden makrofajlar ayırt etmek, birlikte MHCII ile, önemli bir ayıraç günün 7&#39;de çanak başına 6 x 10 7 hücre - Bu plakalar genellikle 3 üretir. Yapıldığı Böylece bir kez, bu tür alveoler makrofajlar 18 veya BW5147 T hücreleri gibi yapısal HA bağlandığı bilinen hücreler üzerinde kullanılmak üzere FL-HA titre ve HA-engelleme CD44 antikoru kullanarak kendi özgünlüğünü teyit (KM-81, piyasada mevcut), etiketlenmemiş HA veya CD44 eksikliği olan bir hücre. CD11c - kültürde Gr1 + hücreleri olmayan HA bağlayıcı hücreler için bir iç kontrol ve bir floresan eksi bir kontrol (FMO) ya da CD44 eksikliği olan BMC kültürleri olarak işlev görebilir son derece hassas Batan önerilmektedirFL-HA bağlama kapının örn. Deneyler heterojen kültürü kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak Gr1, MHC II ve HA bağlama DC veya floresan aktive hücre sınıflandırma ve CD11c sentezlenmesi göre antikor kaplı manyetik boncuklar 18 kullanarak, makrofaj popülasyonu için zenginleştirmek için tavsiye edilir. Olası deneyler akış sitometrisi ile aktivasyonun ve sitokin üretimi, T hücresi aktivasyon deneyleri veya ek karakterizasyonu ölçmek için LPS gibi Toll-benzeri reseptör agonistleri ile uyarılması. Örneğin, uyarım 8 veya 24 saat sonra, akış sitometrisi 18 de tarif edildiği gibi, sitokinler ve / veya CD40 ve CD86 gibi ko-stimülatör moleküllerinin yüzey etiketlemesi için hücre içi boyama ölçmek için kullanılabilir. Hücre içi sitokin etiketleme prosedürleri salgılanmasını engeller ve sitokin hücre içinde birikmesine olanak verir Brefeldin A, hücrelerin ön hazırlık gerektirmez. uzunlu içeren T hücresi aktivasyon deneyleri içinbir antijen Ding gibi bir antijen oluşturucu hücrenin OVA peptidi olarak saflaştırılmış makrofajlar olgunlaşmamış ise T hücrelerini aktive edecek 18 DCler olgun olmaz bağlama MHCII ve HA göre. Tek başına sıralama işlemi önemli tüm deneylerde negatif kontroller için yapım ölçüde dendritik hücreleri aktive olabileceğini belirtmek gerekir. Herhangi bir in vitro yöntem ile olduğu gibi, avantaj ve dezavantajları in vivo veya ex vivo hücrelerinde ile karşılaştırıldığında vardır. Dezavantajı nitro türevi hücrelerde tam olarak taklit eden in vivo hücre ancak işlevsel ve biyokimyasal analiz imkan vermek için yeterli sayıda üretilebilir avantajı, çoğu zaman ex-vivo hücreleri ile değil, mümkün bir şey yok olmasıdır. makrofaj ve DC kimlik Bu yöntem gelecekteki araştırma önceden underappreciated hetero bir kültürden daha homojen hücre popülasyonlarının elde etmek için izin verirlışmaların. Bu, GM-CSF kültüründen saflaştınldı makrofajlar yakın akciğer 18 alınmış alveol makrofajlarının, benzer olarak, in vitro analizi için, alveolar makrofaj benzeri uygun bir kaynak sağlar. Örneğin, bu HA bağlayıcı makrofajlar alveol makrofaj işlevini değiştirmek ilaçlar için ekrana ve Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. GM-CSF ve M-CSF, kemik iliğinden türetilmiş makrofaj nakli farelerde 28,29 pulmoner proteinozisli hafifletebilir son keşif göz önüne alındığında, GM-CSF kültürlerinden makrofajlar tanımlamak için bu yöntem bu önerilen tedavi etkinliğinin artmasına yardımcı olabilir.

Çeşitli in vitro kültür yöntemleri, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve bir veya büyüme faktörlerinin bir kombinasyonu kullanılarak, kemik iliğinden türetilmiş, DCS (BMDCs) oluşturmak üzere tarif edilmiştir. BMDMs makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) veya GM-CSF 1,2 kullanarak kemik iliği hücrelerinin kültürlenmesi ile elde edilebilir. BMDCs, kemik iliği kültür FLT3 ligandı eklenmesi (B220 +, sırasıyla CD11c / yüksek MHC II, yüksek ve CD11c LO) kültür 3,4 9 gün sonra yapışmayan klasik ve plazmasitoid DC yol açar. Bunun aksine, yapışmayan hücreleri tek başına GM-CSF 5,6 ile kültür içinde 7 ila 10 gün sonra üretilen GM-CSF ve IL-4 ile 7 ya da GM-CSF ve FLT3 ligandı 8,9 BMDCs daha yakından enflamatuar DCler benzeyen oluşturmak (CD11c yüksek, MHC II yüksek CD11b +) 10. Bu in vitro kültür makrofajlar oluşturmak için kullanılan birlikte veyaHer kültürün saf popülasyonları yol verirse DC&#39;ler, belli değildir. Örneğin GM-CSF kültürlerde yapışan hücreler de homojen ve herhangi bir gözlenen değişkenliği olan varsayıma sahip makrofajlar 5, DCler 6,11-13 olarak kullanılan aynı kültürden yapışmayan hücreler, olduğu tarif edilmektedir, ancak nedeniyle gelişme 14,15 farklı aşamalarına. Ayrıca, araştırmalar in vivo 16,17 alveoler makrofaj gelişimi için önemli bir büyüme faktörü olarak GM-CSF bulduk ve alveolar makrofajlar gibi 16,17,18 oluşturmak için in vitro olarak kullanılabilir. yapışma dışında, GM-CSF ile tedavi, kemik iliği kültürleri makrofajlar ve DCS üretilmesi için işlemler, GM-CSF, kemik iliği kültürleri içinde mevcut olabilir heterojen öne çok benzerdir. Bu gerçekten iki kağıtları BMDC kültürlerin yapışmaz fraksiyonunda BMDMs varlığını rapor olarak durum gibi görünüyor. bir yazıda, bunlar identifiEd en yakın makrofajların andıran ve T hücrelerini 19 aktif hale getirmek için daha düşük bir yeteneğine sahip bir gen sentezleme imza ifade CD11c +, CD11b +, MHC II orta, MerTK + ve CD115 + gibi bir hücre popülasyonu. MHC II ve FL-HA kullanılan ikinci kağıt bir alveoler makrofaj benzeri nüfusu tanımlamak için (CD11c +, MHC II orta / düşük, FL-HA yüksek) olgunlaşmamış farklı oldu (CD11c +, MHC II orta, FL-HA düşük) ve olgun DC&#39;ler (CD11c +, MHC II yüksek), hem fenotipik ve fonksiyonel 18. Bu kağıtlar hem makrofaj ve BMDC kültürlerden gelen verileri yorumlanırken alınması gerektiğini bakım belirten DC popülasyonları ikisini de içeren, GM-CSF BMDC kültürleri heterojen olduğunu göstermektedir. Bu protokol kemik iliği, GM-CSF kültür kemik iliği hücreleri izole ve alveol makrofaj benzeri nasıl belirleneceği açıklanırbağlayıcı ve MHC II ifadesi FL-HA kullanılarak flow sitometri ile kemik iliği kültürü olgunlaşmamış ve olgun DCler nüfus. . Bu prosedür, Lutz et al 6 kurulan prosedüre göre ve 5 üretebilir - bir 10 mi kültür 7. günde 10 x 10 6 yıkanarak yapışmayan hücreler. Kültür gün ile 7 10 kullanışlı ve 7 gün Bu büyüme ve büyük miktarlarda in vitro alveoler makrofajlar gibi izole etmek için basit bir yöntem sağlar, makrofajlar, olgun olmayan ve olgun DClerin, yanı sıra, bazı soylarının heterojen bir popülasyonu verir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>LSR-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMI4000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST-40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 1/2 Gauge Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357070</td>
			<td>*Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round bottomed tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>*Various&#160;</td>
			<td>*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Richert</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 100 x 15 mm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td>*Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH0208-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-1KG</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175-095&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH0268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9258-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-03-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooster Comb Sodium Hyaluronate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5388-1G</td>
			<td>*Used to make fluoresceinated hyaluronan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>5271-10&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50876-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5290-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clone: 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11c PeCy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0114-82</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Gr-1 efluor450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MHCII APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5321-82</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Anti-MerTK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>BAF591</td>
			<td>Goat polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4317-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and identification of gm-csf derived alveolar-like macrophages and dendritic cells from mouse bone marrow

, Makrofajlar ve dendritik hücreler (DC&#39;ler) patojenlere karşı savunmada temel bir rol oynar doku ve lemfoid organlarda bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, bu nedenle, in vitro modeller geliştirilmiştir, detaylı bir şekilde ele alınması için yeterli sayıda izole edilmesi zordur., Kemik iliği türevli makrofajlar ve dendritik hücrelerin in vitro kültürler immünolojik çalışmalar için köklü ve değerli yöntemlerdir. Burada, kültür ve sitokin granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) kullanılarak primer, fare kemik iliği hücrelerinin tek bir kültür DH&#39;lerin ve makrofajlar hem belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol ilk olarak Lutz ve arkadaşları tarafından geliştirilen kurulan prosedüre dayanmaktadır. Kemik iliği kaynaklı DC&#39;ler için 1999 yılında. kültür heterojen ve MHC II ve floresanlı hyaluronan (FL-HA) ergin ve DC&#39;lerden makrofajlar ayırt etmek için kullanılır. Bu, GM-CSF türetilmiş makrofajlar proyakından fenotip ve işlevsel olarak alveoler makrofajları andıran, in vitro türetilmiş makrofaj uygun bir kaynak vide.

Bu yöntemin en önemli adımları özetleyen bir akış şemasıdır, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Kültür farklı zamanlarda, kemik iliği kültür yoğunluğu ve şekil Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. Gün 1&#39; de hücreler küçük ve seyrek ama 3 gün cinsindendir orada daha fazla hücre, bazı büyük olan ve birkaç uymak başladı. 6. günde tarafından kesin bir yapışkan ve yapışkan parça (Şekil 2A) bulunmaktadır. Kültür 7. günde hasat edilebilir - gün 10 Şekil 2B mevcut CD11c + hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi 10 hasat öncesi gün 7 kültür olarak ayrılmış yapışkan olmayan yapışık hücre fraksiyonları gösterir. yapışık fraksiyon yapışmayan kısmını kaldırmak ışık yıkamadan sonra sol hücrelerden oluşur. Yapışmayan fraksiyon büyük dijital büyütülmüş im daha açık bir şekilde görülebilir bir dendritik morfolojik yapıdaki hücreleri için zenginleştirilmişŞekil 2B ilavelerde yaşları. Yapışmayan fraksiyon (gün 7 ve gün 10) çıkarıldıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, hücreler, sitometrisi temel hücre yüzey belirteçleri karşı floresan antikorlar ile işaretlendikten sonra akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 3 yapışmayan bir sitometrisi lekeleri Örnek akışını gösterir gün 7 ve 10. günde kültür fraksiyonu. CD11c + ve üzerinde makrofajlar ve DC&#39;lerin hem tanımlanması, kapısı Gr1 - hücrelerin boyutu ve canlı hücreleri (Şekil 3A ve B) ilk perdeleme sonra. Gün 7 kültürlerinde, CD11c + Gr1 - Nüfus yapışmayan hücre fraksiyonundan toplam canlı hücre tipik olarak 60 ila 70%, ve bu 10 gün (Şekil 3B) üzerinde% 90 ya da daha fazla arttırılır. CD11c + Gr1 - 7. günde ve 10. günde nüfusun MHCII ve FL-HA Bindi kullanılarak üç alt-grup halinde ayrılabilirng: MHC II orta / düşük FL-HA yüksek makrofajlar (P1) bağlayıcı, MHC II orta FL-HA olgunlaşmamış DCler içeren düşük (P2) hücreleri bağlayan ve MHC II yüksek FL-HA bağlayıcı düşük olgun DH&#39;ler (P3) (Şekil 3C ve 18 referans ). 7. günde gözlenen FL-HA düşük MHC II düşük nüfus (P0) P1-P3 hücre 18 için progenitörlerin içeren gösterilmiştir. Bu popülasyon kültürünün başka olgunlaşma oluştu ima 10. günde belirgin değildir. Bu, aynı zamanda, bir makrofaj işaretleyici olarak kabul 10. Şekil 3B MerTK gösteren kültür CD11c hücrelerin daha büyük bir yüzdesi olarak günde P2 ve P3 DC popülasyonları biraz daha büyük bir çoğunluğu tarafından desteklenen yüksek hem makrofaj ifade edilir ve olgunlaşmamış DC popülasyonları (P1 ve P2), fakat olgun DH&#39;ler (P3 hücreleri) daha düşük bir dereceye kadar ifade edilir. Özellikle, yapışık fraksiyonun analizi P0, P1 varlığını ortaya çıkarır veP2 popülasyonları, ancak P3 olgun DC popülasyon (veriler gösterilmemiştir). Böylece makrofajlar yapışkan ve yapışkan fraksiyonlar bulunur, ama sadece olgun DH&#39;ler yapışmayan fraksiyonunda yer almaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54194/54194fig1.jpg" /> . Şekil 1: - bunlar başka deneyler, saflaştırılmış ya da FACS analizinde kullanılan kullanılmak üzere hasat edilir, 10 gün Yöntem temel adımlarını gösteren bir akış şemasını Birincil hücreler, kemik iliğinden hasat edilen kaplanmış ve 7 kültür içinde muhafaza edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54194/54194fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54194/54194fig2.jpg" /> Şekil 2: Kemik İliği Hücreleri Türetilmiş GM-CSF mikroskopik incelenmesi. A) </strong&gt; Fotoğraflar Hücre sayısı, morfoloji değişiklikleri ve tat yapışık ve yapışmayan kısımların çıkışında bir artış gösteren bir gün 1, 3 ve 6 kemik iliği kültürü. B) Sol panel gün 7 kemik iliği kültürü ve tipik hücre yoğunluğu göstermektedir. orta panel Day Yapışmayan fraksiyon ve sağ panel hasattan sonra 7 yapışmayan hücreler gösterir 7. Insets dijital dendritik morfolojiye sahip bu fraksiyonun hücre görüntü büyütülmüş günde hasat yapışmayan bölümünü göstermektedir. Beyaz ölçek çubuğu 50 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54194/54194fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54194/54194fig3.jpg" /> Şekil 3: Gün 7 ve gün 10 de, GM-CSF Kültür Örnek fenotipik yapışmayankültürden hücreler CD11c, Gr1, MHC II, FL-HA ve MerTK gün 7 veya 10. günde ve hücreler ilk önce. B hücrelerini canlı boyutuna kapı edildi akışı sitometri. A) kendi fenotip için analiz) bir gösterir etiketlenmiştir nüfus makrofaj ve dendritik hücreler içeren - CD11c ve GR1 (nötrofil / monosit işaretleyici) ile Geçitli hücrelerin arsa ve CD11c&#39;nin + GR1 tanımlar. Bu nüfus, C) Yolluk olgun olmayan DH&#39;lere (P2 alveoler makrofajlar gibi (P1) ayrılmasını göstermektedir bağlama MHCII ve FL-HA, akış sitometrisi grafiğini göstermektedir) ile Poon de tarif edildiği gibi), DCler (P3 olgun ve ark., 18. D) 7. günde ve 10. günde, (makrofajlar) P1 arasında P2 (olgunlaşmamış DC) ve P3 popülasyonları (DC&#39;ler olgun) MerTK ifade karşılaştıran histogramlar <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54194/54194fig3large.jpg" target="_blank">bu figu büyük halini görmek için tıklayınız</a>yeniden.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K Görüntüleme.  University of British Columbia. Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages. 

Video: Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease severity in patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis (PAP)1-3. As abrogation of GM-CSF bioactivity in the lung is the likely cause for autoimmune PAP4,5, it is promising to measure the neutralizing capacity of GM-CSF autoantibodies for evaluating the disease severity in each patient with PAP.
Until now, neutralizing capacity of GM-CSF autoantibodies has been assessed by evaluating the growth inhibition of human bone marrow cells or TF-1 cells stimulated with GM-CSF6-8. In the bioassay system, however, it is often problematic to obtain reliable data as well as to compare the data from different laboratories, due to the technical difficulties in maintaining the cells in a constant condition.
OBJECTIVE: To mimic GM-CSF binding to GM-CSF receptor on the cell surface using cell-free receptor-binding-assay.
METHODS: Transgenic silkworm technology was applied for obtaining a large amount for recombinant soluble GM-CSF receptor alpha (sGMR&alpha;) with high purity9-13. The recombinant sGMR&alpha; was contained in the hydrophilic sericin layers of silk threads without being fused to the silk proteins, and thus, we can easily extract from the cocoons in good purity with neutral aqueous solutions14,15. Fortunately, the oligosaccharide structures, which are critical for binding with GM-CSF, are more similar to the structures of human sGMR&alpha; than those produced by other insects or yeasts.
RESULTS: The cell-free assay system using sGMR&alpha; yielded the data with high plasticity and reliability. GM-CSF binding to sGMR&alpha; was dose-dependently inhibited by polyclonal GM-CSF autoantibody in a similar manner to the bioassay using TF-1 cells, indicating that our new cell-free assay system using sGMR&alpha; is more useful for the measurement of neutralizing activity of GM-CSF autoantibodies than the bioassay system using TF-1 cell or human bone marrow cells.
CONCLUSIONS: We established a cell-free assay quantifying the neutralizing capacity of GM-CSF autoantibody.

We designed a cell-free receptor binding assay in order to estimate the binding of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) to the receptors. It enables us to evaluate competitive inhibition of biotinylated GM-CSF binding to soluble GM-CSF receptor alpha by GM-CSF autoantibody with excellent reproducibility.

Rekombinant Çözünür GM-CSF Reseptör kullanarak GM-CSF Antikor Nötralizasyon Kapasitesi tahmin Hücre Testi Sistemi

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.