Bu çalışma Genetik, Kalkınma ve Hücre Biyolojisi ve Iowa State Üniversitesi Bölümü tarafından ve NIH hibe EY024941 (WJ) .Dr tarafından finanse edildi. Jeffrey Essner el yazması üzerine yorum sağladı.

Bütün hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak ve Iowa Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Maryland Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. TALEN Tasarım <ol><li> Bir TALEN tasarım web sitesine giriş istenen hedef dizisi. (Örneğin <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Giriş boşluk / tekrar dizi uzunlukları seçildi. <ol><li> &quot;Dizi&quot; etiketli kutunun içine genomik dizisi kopyalayın. </li><li> &quot;Özel Spacer / RVD Uzunlukları sağlayın&quot; sekme içinde boşluk uzunluğu ve dizi uzunluğunu seçin. Not: 15 baz çiftlerinin Spacer uzunlukları ve iyi 15-17 iş dizi uzunlukları tekrarlamak ve montaj az karmaşık hale getirmektedir. </li></ol></li><li> Bir TALEN çiftini seçin. benzersiz sınırlama enzimi noktasının etrafında tasarlanmış TALEN çiftleri kısıtlama enzimi tarafından genotipleme sindirilmesi izinBir PCR ürünü,. </li><li> Tasarım primerler gibi Primer3 30-32 gibi web sitesini kullanarak TALEN hedef alanını çevreleyen genomik bölgeyi yükseltmek için. bir kısıtlama enzimiyle genotipleme olduğunda, astar tasarımı bir kere kısıtlayıcı enzim merkezi ihtiva eden bir bölümünün yükseltilmesi için. Bölgenin büyütülmüş ve A içinde mevcut olan herhangi polimorfizmlerini tespit etmek TALEN yapı önce dizilenmiştir önerilir mexicanustan laboratuar popülasyon mikro enjeksiyon için kullanılmak üzere. </li></ol> (TALEN Kit Protokolü Modifiye) 2. TALEN Meclisi 33,34 Ek ayrıntılar ve sorun giderme için protokol 34 bkz. <ol><li> Hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre TALEN kiti gerekli plazmidler sırası. </li><li> reaksiyonlar A ve B için 1 reaksiyonlar tekrar değişkenli diresidues (RVDs) 1-10 ve Reaksiyon A. hedef vektör pFUS_A RVDs dahil 11- dahil # (N-1) ve th kurmakN talen bölgesindeki RVDs sayısı e hedef vektör pFUS_B Reaksiyon B (n-1). <ol><li> Her reaksiyon ekleyin: Her RVD (100 ng / | il), hedef vektör (100 ng / | il), 1 ul Bsa I kısıtlayıcı enzim, 1 ul Sığır Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ihtiva eden her bir plazmid, 1 ul ), 1 ul ligazı, 20 ul toplam hacim su ul 10x ligaz tamponu ve x 2 ul. Örneğin, bakınız Tablo 1. Not: yarım reaksiyonları da kullanılabilir. </li><li> Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve döngüyü çalıştırın: 10x (37 ° C / 5 dk + 16 ° C / 10 dk) + 50 ° C / 5 dk + 80 ° C / 5 dk. </li></ol></li><li> nükleazı ile reaksiyonları inkübe edin. Her reaksiyon için 1 ul 25 mM ATP ve 1 ul nükleaz ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de reaksiyonlar inkübe edin. </li><li> Tepkiler Transform. <ol><li> Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü. Not: Ev yapımı yetkili carşın kullanılabilir. Bununla birlikte, düşük yetkinlik hücreler koloni eksikliği ile sonuçlanabilir. <ol><li> kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. Beş dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler yerleştirin. Katabolik baskı (SOC) ile Süper Optimal suyu 125 ul ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de tüpler çalkalayın. </li></ol></li><li> Plaka spektinomisin (50 ug / ml) LB plakaları üzerine dönüştürülmüş hücreler, 100 ul, X-gal ve izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG). 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün. </li></ol></li><li> Her reaksiyon için 2-3 Beyaz koloniler ve primerlerin pCR8_F1 ve pCR8_R1 (Tablo 2) kullanılarak koloni PCR ile kontrol edin. <ol><li> reaktiflerin bir ana karışımı olun. Örneğin, bakınız Tablo 3. </li><li> Bir koloni seçin ve bir PCR tüp dibine onu yayma ve daha sonra spektinomisin ile 2 ml LB içine koloninin kalıntılarını koymak(50 ug / ml). koloniye ile tüpe ana karışımı 15 ul yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki PCR programını çalıştırın (Tablo 4) </li><li> elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde PCR (tüm birimi çalıştırın) kontrol edin. Doğru klonlar, beklenen boyutta bir bant gibi bir yayma ve bantların bir merdiven olacaktır. Uygun smear örneği için 34,33 bkz. </li><li> bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep. </li><li> Sıra pCR8_F1 ve pCR8_R1 ile TALEN dizisini kontrol etmek için. Daha önce tarif edilen metotlar 35 izleyin. </li><li> dizisi ile doğrulandı doğru klonlar kullanarak, hedef vektörü içine A ve B vektörleri ve son RVD gelen RVDs yerleştirir reaksiyon 2. (TALEN kiti) kurmuştur. <ol><li> Reaksiyonun 2 (Tablo 5) karışımı hazırlayın. Not: HaEğer reaksiyonları kullanılabilir. </li><li> Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 37 ° C / 10 dk + 16 ° C / 15 dk + 37 ° C / 15 dk + 80 ° C / 5 dk. </li></ol></li><li> Tepkiler Transform. <ol><li> Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü. <ol><li> kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isıtma 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca hücrelerin şok. </li><li> buz üzerinde tüpler yerleştirin. SOC 125 ul ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de çalkalayıcı bir inkübatör içinde tüpler yerleştirin. </li></ol></li><li> Plaka ampisilin (100 ug / ml), X-gal ve IPTG ile LB levhaları üzerine dönüştürülmüş hücreler 100 ul. 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün </li></ol></li><li> Her reaksiyon için 1-3 Beyaz koloniler ve koloni PCR ile primerler TAL_F1 kullanarak TAL_R2 (Tablo 2) ile kontrol edin. <ol><li> polimeraz master, su ve primer olarak bir çözeltisini yapmakTablo 3&#39;te tarif edilmiştir. Bir koloni almak ve bir PCR tüpünün dibine smear ve ampisilin (100 ug / ml) ile 2 ml LB içinde koloninin kalıntılarını koydu. koloni tüpe çözeltisi 15 ul koyun. </li><li> PCR programı (Tablo 6) çalıştırın. </li><li> elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde PCR edin. Doğru klonlar bulaşmasını ve bantların bir merdiven olacak. Uygun smear örneği için 34,33 bkz. </li><li> bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep. </li><li> Dizi TAL_F1 ve TAL_R2 daha önce tarif edilen metotlar 35 aşağıdaki TALEN sekansını kontrol etmek için. </li></ol> Talens 3. mRNA transkripsiyonunu <ol><li> 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca 2 ul Sac I ile dizi-belirlenmiş şablon 4 ug Digest. </li&gt; <li> Elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde Sac I ile sindirilmiş plasmid 2 ul çalıştırın. Doğru sindirilir Plazmidler tek bant gösterecektir. </li><li> PCR saflaştırma kiti protokolü sonra, kalan Sac I ile sindirilmiş plasmid saflaştırılır. Elüsyon önce yıkama çözeltisi ile iki kez yıkanır. nükleaz içermeyen su 30 ul içinde yıkayın. </li><li> T3 mRNA üretimi için standart bir protokol izleyin. <ol><li> Lineerleştirilmiş şablonun 0.5 mikrogram ile yarım reaksiyonları kurmak (yukarıda hazırlanan). 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> DNase (kiti içinde bulunur), 0.5 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarını izleyerek mRNA arındırın. 30 ul nükleaz içermeyen su içine Zehir. </li><li> mRNA kontrol etmek için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel çalıştırın. <ol><li> RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırmak ve% 1.2 jel hazırlamak için bir ürün ile jel aparat temizleyin. </li><li> Karışım 1 ul mRNA + 4-# 181; l nükleaz içermeyen su + 5 ul glioksil yükleme boyası. 30 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edin. jel çalıştırmadan önce buz üzerinde santrifüj tüplerine kısaca ve yer. </li></ol></li><li> nükleik asit konsantrasyonlarının ölçülmesi için bir yöntem kullanarak yoğunlaştırma kontrol edin ve -80 ° C&#39;de parçalar halinde saklayın RNA. RNA / dondurulmuş birden fazla çözülmüş değildir, öyle ki, bir kısım boyutu seçin. Not: 500-1000 ng konsantrasyonlar / nl genellikle elde edilir. RNA bütünlüğü korunur (a bant yerine jel üzerinde yayma tarafından değerlendirilir) daha düşük bir konsantrasyonda RNA sürece kullanılabilir. </li></ol> TALEN mRNA ile 4. enjekte Astyanax mexicanustan Embriyolar <ol><li> Enjeksiyon için Araçlar hazırlayın. <ol><li> bir petri içine balık su (sodyum bikarbonat ve deniz tuzu pH 7.4 ve iletkenlik 700 mS ile şartlandırılmış su)% 1.2 agaroz dökerek enjeksiyon plakaları dökün. balık kuyu olmak için çıkıntılar olan bir kalıbın (plastik parça yerleştirinçanak içinde yumurta). 4 ° C&#39;de agaroz sertleşmiş kalıp ve mağaza çıkarın. Kalıpta ayrıntılar 36 için bkz. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon için iğne çekin. Not: Uygun iğne uzunluğu enjeksiyonlar için önemlidir. çok uzun olan iğneler enjeksiyonlar için çok esnek olacaktır. çekerek iğne protokol iğneler çekmek için kullanılan ekipman ile değişecektir. Uygun bir iğne bir örnek bizim ekipman için, uzunluğu 5-6 cm iğne çekin. Şekil 1&#39;de gösterildiği ve kırıldığı zaman yaklaşık 0.011 mm ucunda bir dış çapa sahip olduğu. Ancak, iğneler açılış genişliğini belirlemek için (adım 4.3.4) kalibre edilmelidir. Iğneler çekmek için bir örnek program Tablo 7&#39;de bulunabilir. </li><li> bir yumurta geçmesine açılış yeterince büyük ve böylece pipet kırarak embriyo transferi için cam pipetler hazırlayın. kırık ucu kadar Alevartık keskindir. Not: A. ile çalışırken cam pipetler ve cam kase kullanmak önemlidir mexicanustan yumurta ve embriyo onlar yapışkan ve plastik uyacaktır olarak. </li></ol></li><li> 1-hücreli Sahne Yumurta toplayın. <ol><li> Irk A. mexicanustan standart protokoller 37 Aşağıdaki. Not: Örneğin, balık 14 ışık tutulur eğer: 10 karanlık döngüsü ve ışıklar kapalı olarak ve ZT14 ışıkları olarak ZT0 ile Zeitgerber zaman (ZT) kullanılarak, ZT15 ve ZT19 tarihleri ​​arasında yüzey balık yumurtlamak. Tam yumurtlama zamanı her laboratuar için tespit edilmelidir. </li><li> çiftleşme öncesi 3-4 gün balık fazla besleme ve taze suya balık koyarak yumurtlama neden olur. Sıcaklık 2 ° F kaldırın. Not: Bizim ilk su sıcaklığı yaklaşık 74 ° F. </li><li> 1 hücre aşamada yumurta elde etmek için her 15 dakikada kontrol karanlıkta yüzey balık yumurta toplamak. yumurta yüz yüzeyi balık tek bir çift elde edilebilir. </li><li> Toplamakcam kase yumurta plastik yüzeylere yapışmasını önler ve sıralama mikroskop altında yumurta gözlemleyerek ve tek bir hücre olan yumurta toplama yoluyla enjeksiyondan önce 1 hücre aşamasında embriyoların izole etmek. (PH ve iletkenlik için işlem görmüş yetişkin balıklar yer aldığı bir hazne suyu,), taze sistem suda yumurta tutun. </li></ol></li><li> TALEN mRNA enjekte. <ol><li> toksisite ve etkinlik TALEN çift değişir gibi enjeksiyon için uygun konsantrasyonu belirlemek için toplam mRNA (çiftteki her talen eşit miktarlarda) farklı miktarlarda enjekte edilir. 400-800 pg olan toplam mRNA konsantrasyonlarını enjekte ederek başlayın. Seyreltilir ve 1.5 NL enjekte edilmesi için istenen konsantrasyonlara mRNA birleştirir. </li><li> Yük iğnenin arkasına mRNA seyreltilmiş ve bir mikro-enjektöre iğneyi takın. </li><li> forseps kullanarak iğne kırın. </li><li> iğne kalibre edin. Örneğin, 10 kez çıkarma ve bir mikro kapiller gerilemesi toplar. 10 x 100 atılabilir 1.081 l, 32 mm mikro kılcal, damla 1.5 nl / 1 enjeksiyon için 0.5 mm mikro kılcal doldurmalıdır. Gerektiğinde enjeksiyon zamanı ve basıncını ayarlayın. </li><li> tek hücre içine iğne takın ve mRNA enjekte edin. değil sarısı içine, hücre içine doğrudan mRNA enjekte edilir. </li><li> cam kase enjekte embriyolar toplayın. 23-25 ​​° C embriyolar tutun. ölü embriyolar düzenli enjeksiyonu takiben ilk birkaç gün için (bulutlu ve düzensiz şekilli hale embriyolar) çıkarın. kontrol (uninjected) ve enjekte edilen levhalardan ölü ve deforme embriyoların rekor numaraları. Not: Artan mRNA konsantrasyonu artmış toksisite ve embriyo deformite / ölüme yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi enjekte mRNA iyi konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir. </li></ol></li></ol> 5. Fenotip Kurucu Balık ve TALEN Verimliliği değerlendirin <ol><li> kurumsal hayvan protokole göre embriyolar Kurban. Not: euthanizeHızlı tarafından embriyolar buz üzerinde ürpertici. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak 0,8 ul PCR şerit tüpler içine embriyolar toplayın. Not: Genotiplendirme bireysel embriyolar veya embriyoların havuzları üzerinde gerçekleştirilebilir. </li><li> DNA ayıklayın. <ol><li> 100 ul 50 mM sodyum hidroksit (NaOH) içine yerleştirin embriyolar 4 ° C&#39;ye soğutun, 30 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 M Tris-HCI pH 8 1/10 hacmi (10 ul) eklenir. </li></ol></li><li> Adım 1.3 tasarlanan primerler (örnek protokoller için masalar 8 ve 9 bakınız) kullanarak bölgede bir PCR gerçekleştirin. Bireysel embriyolar için DNA 1 ul PCR reaksiyonu için yeterlidir. </li><li> uygun kısıtlama enzimi ile elde edilen PCR ürünü sindirimi ve elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde çalıştırıldı. <ol><li> Örneğin, enjekte edilen embriyolar okülokütanöz albinizm 2 (OCA2) odağı genotipleme için 0 ekleyerek kısıtlama enzimi Bsr kullanıyorum PCR ürünü sindirmek2 saat boyunca 65 ° C&#39;de inkübe tamamlanmış PCR reaksiyonunun 12.5 ul e BSR doğrudan I .5 ul. sindirilmemiş ve bir jel üzerinde sindirilmiş ürünü çalıştırın. Kısıtlama enzimi dayanıklı grupları (yani, sindirimi olmayan bantları) TALEN kaynaklı mutasyon mevcut olan (Şekil 2) olduğunu göstermektedir. </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı), daha önce tarif edildiği gibi 29 Her bir bandın şiddeti değerini hesaplamak için jel analizi alet Fiji 38 jel görüntüleri analiz ederek kesilmemiş ürünün yüzdesi belirlenerek yüzde mutasyon oranını hesaplar. </li><li> Ta jel ile saflaştırılmıştır sınırlama enzimi dirençli mutant bandını klonlamak ve klonlar, dizileme ile mutant alleli dizisini belirlemek. <ol><li> Jel kısıtlama üreticinin talimatlarına aşağıdaki dirençli mutant bant enzim arındırmak. TA üreticinin talimatlarına aşağıdaki bant klonlamak. koloniler ve çalkalama 37 ° C&#39;de 1.5 ml LB O / N büyümekinkübatör. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek Miniprep kültürleri. sıralaması için DNA gönder. </li><li> Böyle maymun gibi bir program kullanarak, vahşi tip dizisine mutant dizileri aynı hizaya getirin. <ol><li> Kopyala ve APE dosyaları içine de dizileri yapıştırın. &quot;Araçlar&quot; menüsünden &quot;Align İki Diziler&quot; aracını seçin. </li><li> Açılır menüleri kullanarak iki DNA dizilerini belirtin. Not: klonlanmış dizinin ters tamamlayıcı PCR klonlama vektörü içine çıktı yönüne bağlı olarak kullanılabilir gerekebilir. dizileri hizalamak yoksa, &quot;Align DNA&quot; kutusuna &quot;Rev-Com&quot; kutusunu işaretleyerek adımları tekrarlayın. </li></ol></li></ol></li><li> Uygun aşamada fenotipleri ve beklenen fenotip 29 için uygun yöntemler (Örneğin, Şekil 3) kullanarak kurucu balık değerlendirin. fenotipleme yöntemleri protoc kullanılarak araştırmacı tarafından hedeflenen gen için beklenen fenotipin dayanacaktırol. </li></ol> Germline İletimi için 6. Ekran Not: A. mexicanustan 4-8 ayda cinsel olgunluğa erişirler. <ol><li> vahşi tip balık cinsel olgunluğa kurucu balık çapraz. </li><li> Ekran embriyolar veya adımlar 5,1-5,7 yöntemleri kullanarak yetişkin balık (Şekil 4). Yetişkin balıklar için, kuyruk parçası anesthetization aşağıdaki kesilebilir. <ol><li> fin kırpma sırasında baskıyı azaltmak için tricaine (3-aminobenzoik asit etil ester) içindeki bir çözeltisi içinde balık daldırarak balık anestezisi. fin kırpma ardından, balık taze suya kurtarmak için izin verir. Balık hızla kurtarmak; onlar (normalde yüzme) iyileşene kadar gözleyin. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Büyük adımlar özelliklerin evrim genetik temelini anlamaya yönelik son yıllarda yapılmıştır. Özellikleri, bir dizi evrimi yatan aday gen belirlenmişse de, bunun nedeni en evrimsel ilginç türlerinin genetik tractability eksikliği, in vivo olarak, bu genlerin test etmek zor kalmıştır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem raporu mexicanustan, bir tür mağara hayvanların evrimi incelemek için kullandı. Genetik haritalama 1,21,23 çalışmaları ve aday gen A mağara şeklinde özelliklerin gelişimi için aday genlerin bir dizi belirledik 19,40 yaklaşımlar mexicanustan. Cavefish genomunun 41 son yayın mağara özelliklerin evrimi için aday genlerin belirlenmesi için ek güçlü bir araç sağlar. Bu aday genlerin çoğu fonksiyon testi gen ifadesini azaltmak için teknikler gerektirir. Çalışma için tek geçerli seçenekA. indirgenmiş gen ekspresyonunu ing mexicanustan morpholinos kullanımıdır. Ancak, morfolino gen demonte bir kaç gün sonra döllenme ile sınırlı, geçici ve böyle 17, hiperfaji 19 ve titreşim cazibe davranışı 42 okullaşma gibi yetişkin mağara ve yüzey balıkları arasındaki davranış farklılıkları gibi yetişkin hayvanlarda özellikleri incelemek için kullanışlı değildir. Bu Talens kullanılarak yapılabilir olduğu gibi genlerin işlevini allel kaybı üretilmesi, bu özelliklerin aday genlerin rolü test etmek için önemli olacaktır. Yöntem TALEN çifti 33 arasında kolay montaj ve bu yöntem için ayrıntılı bir protokol geliştirilmiştir 34 mevcuttur. Bu protokol, farklı bir nihai hedef vektörü kullanılarak, bedelli ve ark. 7 tarafından Zebra balığı kullanım için optimize edilmiş, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-gT). Bu vektör, tek hücreli zebra balığı embriyolara enjeksiyonu için TALEN mRNA&#39;nın transkripsiyonuna imkan verir.Biz montajı ve A. içine enjeksiyon için Talens uyarlamak için, burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır, bu değiştirilmiş montaj yöntemi kullandık mexicanustan. Biz bulduğu tek hücreli yüzey A. enjekte edildiğinde mexicanustan embriyolar, bu protokol kapsamında açıklandığı gibi, biz A. mutasyona olabilir mexicanustan genler 29. Bu protokol açıklanmayan aday genler üzerinde gelecekteki araştırmalar için, diziler cavefish genom 41 bulunan ve TALEN hedef siteleri belirlemek için kullanılabilir. Başarılı enjeksiyonlar için kritik kaliteli TALEN mRNA olduğunu. Bu nedenle, enjeksiyondan önce bir jel üzerinde RNA az miktarda çalıştırarak RNA kalitesinin kontrol önemlidir (adım 3.6) &#39;dir. Böyle donma thaws (3.7 Adım) önlemek için alikotları dondurma ve enjeksiyonlar (Adım 4) sırasında temiz su ve RNAse ücretsiz tüpler ve ipuçlarını kullanarak steril koşulları sürdürmek olarak muhafaza RNA bütünlüğü için diğer önlemler, önlemler alınmalıdır. yükselterek enjekte balık için ek bir kritik adımÖlü embriyolar hızla su kalitesini etkileyebilir olarak, enjeksiyonu takiben ölü embriyolar dışarı temizlik. Böylece, enjeksiyonları ertesi sabah ölü embriyolar kaldırmak ve periyodik önümüzdeki birkaç gün için sağlıklı canlı embriyolar (Adım 4.3.6) korumak için enjeksiyonları takiben. Astyanax mexicanus içinde TALEN mutagenez yüksek verimli olabilir; Ancak, verimlilik TALEN çifti bağlı olarak 29 enjekte değişir. Artan mRNA konsantrasyonları artmış toksisite ve deformite ve enjekte edilen embriyoların ölümüne yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi test edilmiş ve enjekte mRNA optimal konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir. yüksek verimli TALEN çiftleri için, fenotipleri enjekte kurucu balık değerlendirilebilir. Örneğin, TALENS hedefleme OKA2&#39;den enjeksiyon yüzeyi balık 29 albino yamalar (Şekil 3) ile sonuçlandı. diğer özellikler ya da genler için, ancak, kurucu balık fenotip değerlendirilmesi nedeniyle zor olabilirkurnazca fenotip veya enjekte TALEN çiftinin düşük verimlilik için. Bu nedenle, bir çok uygulama için bir non-mozaik hayvanda bir aday genin rolünün analiz için ilgi konusu bir gen tohum çizgisi mutasyon üretmek için arzu edilir. A. TALEN kaynaklı mutasyon elde tohum çizgisi iletim mexicanustan 29 (Şekil 4) mümkündür. Bu nedenle, bu teknik, diğer aday genleri değerlendirmek için uygulanabilir. Astyanax mexicanus genetik manipülasyonlar gerçekleştirmeden birkaç sınırlamalar şu anda mevcuttur. Yüzey ve gece geç karanlıkta cavefish cins. o yumurtlama hemen sonra enjekte kritik olduğu gibi hafif koyu döngüsü tersine çevirmek mümkün değildir laboratuvarda araştırmacılar, enjeksiyon gerçekleştirmek için gece geç saatlerde gelmelidir. Işık yumurtlama etkileyecek Buna ek olarak, karanlıkta yüzey balığı embriyolar toplamak için önemlidir. özelde diğer teknikler,(43 gözden) CRISPR / Cas sistemini lar, genom düzenleme için mevcut ve muhtemel A&#39;ya geçerli olacak mexicanustan. Gerçekten de, kılavuz RNA montaj için protokoller ve hızlı 44 kolay olduğu ana kadar ve protokol CRISPR / Cas enjeksiyon için değiştirilebilir Burada bildirilen. Ayrıca, genom düzenleme için yeni uygulamalar hızla geliştirilmektedir ve bunların birçoğu A için yararlı olabilir mexicanustan araştırmacılar. Örneğin, zebra balığı hassas mutasyon mutasyona 7 ihtiva eden bir tek şeritli oligo TALENS coinjecting ilgilenilen bir gen ile yapılmıştır. Bu teknik cavefish ve yüzey balıkları 19 arasında gözlenen metabolizma farklılıklar MC4R belli mağara allel bir missense mutasyon rolü mağara fenotipleri, üreten mağara alel rolünü değerlendirmek için yararlı olabilir. Talens, flüoresan işaretçileri, tarif homolog rekombinasyon yoluyla genlerin alelleri oluşturmak için kullanılmıştırendojen loci 45 benzer n desenleri. Bu yöntemler, A. kullanılabilecek mexicanustan hücreler ya da aday genlerin sentezlenmesi alt kümelerini değerlendirmek. CRISPR / Cas sistem doku spesifik gen nakavt 46 elde etmek için Zebra balığı kullanılmıştır. A. uygulanan Bu teknikler, mexicanustan gibi cavefish göz kaybı gibi işlemler genetik temeli değerlendirmek için yararlı olabilir. Lens cavefish 47 göz kaybı sürecinde kritik bir rol oynamaktadır ve dokuya özgü CRISPR / Cas sistemi özellikle gözün diğer dokularda karşı lens göz kaybı için aday genlerin rolü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu ve diğer genom düzenleme teknikleri A&#39;da kullanılabilir Gelecekteki çalışmalarda mexicanustan mağara özelliklerin evrim hakkında kritik sorulara cevap.

Sürekli evrim genetik temelini anlamak evrimci biyologların kritik bir araştırma hedeftir. Önemli ilerleme özelliklerin evrimini altında yatan lokusların belirlenmesi ve (örneğin 1-3) bu loci içinde aday genlerin saptayarak yapılmamıştır. Ancak, fonksiyonel bu genlerin rolü özelliklerin evrimini incelemek için kullanılan birçok organizmaları zorlu kaldı etmiştir test şu anda genetik uysal değildir. Genom düzenleme teknolojileri çıkması büyük ölçüde organizmaların geniş bir genetik uygulanabılirliği artmıştır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPRs) (Örnek 4-11 için) organizmadan genler hedefli mutasyon üretmek için kullanılmıştır. Bir evrimsel ilgili sisteme uygulanan bu araçları, evrimsel biyologlar evrimin genetik temeli çalışma yol devrim potansiyeline sahip. Astyanax mexicanustan iki şekilde bulunur balık türüdür. Bir nehir yaşayan yüzey formu (yüzey balık) ve çoklu mağaralarda yaşayan formları (cavefish) A. mexicanustan cavefish (12 gözden) yüzey balık atalarından evrimleştiği. Cavefish popülasyonu gibi okullaşma davranışının kaybı, artan saldırganlık, duruş ve hiperfajya 13 beslenme değişiklikleri gibi davranış damak tadınızı ve kafatası neuromasts ve değişikliklerin sayısında artış, azalma ya da pigmentasyon kaybı, gözlerde kaybı da dahil olmak üzere özellikleri bir dizi geliştiğini -19. Cavefish ve yüzey balıkları interfertile, ve genetik haritalama deneyleri mağara özellikleri 1,20-26 için lokus ve aday genleri tanımlamak için yapılmıştır. Bazı aday genler diğer türlerin 21 model organizmalarda veya aşırı ifadesinin 27 veya geçici demonte u tarafından, hücre kültürü 1,19 mağara özellikleri katkıda işlevsel rolü için test edilmiştirA. morpholinos 28 şarkı mexicanustan. Bununla birlikte, bu yöntemlerin her biri, bir sınırlama vardır. A. Bu genlerin mutant alelleri oluşturma yeteneği mexicanustan cavefish evriminde işlevini anlamak için kritik önem taşır. Bu nedenle, A. mexicanustan genom düzenleme teknolojileri uygulanması için ideal bir aday organizmadır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem özetlemektedir mexicanustan Talens kullanılmıştır. Bu yöntem, fenotip ve ilgi 29 genlerin kararlı mutasyonları ile balık hatları izole etmek için mozaik enjekte kurucu balık değerlendirmek için de kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection station</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle puller</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td>
			<td style="width:71px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">Kit #1000000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Teknova TET-15 in 50% EtOH</td>
			<td style="width:71px;">Teknova (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-843-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2957-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Super Ampicillin (1000x solution)</td>
			<td style="width:71px;">DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6060-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERR0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1620-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">BsaI</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-812-203</td>
			<td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">provided with restriction enzymes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10x T4 ligase buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-C1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">GoTaq Green Master mix</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PRM7123</td>
			<td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Quick ligation kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-811-728</td>
			<td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C4040-06</td>
			<td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Esp 3I</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERER0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td>
			<td style="width:71px;">Epicentre (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">NC9046399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27106</td>
			<td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td>
			<td style="width:71px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-3119-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sac I</td>
			<td style="width:71px;">Promega (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-R6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1348M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Ambion (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eliminase</td>
			<td style="width:71px;">Decon (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">04-355-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microcaps</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN çifti enjeksiyonlar (NHEJ) birleştiren homolog olmayan uç boyunca tamir edilebilir iki iplikçikli sonları 39 ile sonuçlanan, dolayısıyla Foki etki dimerizasyonunu spesifik DNA nükleotidini RVDs bağlanması ve sonuçlanır. NHEJ sık sık ekleme veya çıkarma (indeller) neden hataları tanıttı. Indeller TALEN hedef bölgesini çevreleyen bölgenin amplifiye edilmesi ve TALEN aralayıcı bölge içinde kesen bir sınırlama enzimi ile elde edilen amplikon sindirilmesi ile tespit edilebilir. Allelleri bir sınırlama enzim dayanıklı bant üreten, (Şekil 2) sindiremez olacak restriksiyon enzim hedef sırasını değiştirmek indellerin içeren sırasında bir Indel olmadan allel sindirir. TALEN enjeksiyonları olasılıkla A. bialelik gen mutasyonları neden olabilir mexicanustan 29. Bu nedenle, bazı fenotipleri kurucu balık değerlendirilebilir. İçin<html> örneğinde, Talens hedefleme OKA2&#39;den, cavefish 1,28 birden albino popülasyonlarında albinism sorumlu olduğu varsayımında gen enjekte yüzey balık pigmentasyon değerlendirildi. Biz uninjected balık 29 (Şekil 3) değil mevcut OCA2 TALEN enjekte balık albino yamalar bulundu. Birçok deney için, fenotipleri değerlendirmek için balık mutan çizgileri olması arzu edilir. Iletilen mutant allel ile Kurucu balık vahşi tip balık (Şekil 4) kurucu balık haçlar döl genotipleme tarafından tespit edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig1.jpg" /> MRNA enjekte etmek için Şekil 1. İğne. önce bir mikropipet Fotoğraf tek hücreli embriyo TALEN mRNA enjekte etmek için kullanılan kırık edilir._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig2.jpg" /> TALEN mRNA&#39;nın farklı miktarlarda 29 enjekte edildiğinde Astyanax mexicanus içinde OKA2&#39;den ekson 9&#39;dan OKA2&#39;den. 306 bp&#39;lik PCR ürünleri için Şekil 2. TALEN verimliliği sınırlama enzimi kaybı açısından incelendi. amplikon bir kısmı TALEN embriyoların enjekte 10 havuzlarında kısıtlama sindirmek dirençli iken bir kontrol embriyo amplikon sindirildi. Enzim TALEN mRNA enjekte edilmiş embriyoların dirençli bantları restriksiyon dijest OKA2 indeller 29 ihtiva ettiği gösterilmiştir hedef almıştır. mRNA&#39;nın artan konsantrasyonları artan TALEN verimliliği (daha fazlası sindirilmemiş DNA) sonuçları enjekte edin. &quot;-&quot; Ile yolları ile, şerit sindirilmemiş olan &quot;+&quot; Diges vardırted kısıtlama enzimi ile. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54113/54113fig3.jpg" /> Pigmentasyon değişiklikleri için Şekil 3. Fenotiplendirme kurucusu balık. (A) uninjected yüzey A. Kontrol mexicanustan. (B) Yama OCA2 (ok) hedefleyen 400 pg TALEN mRNA enjekte kurucu yüzey balık melanophores eksik. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54113/54113fig4.jpg" /> TALEN bağlı mutatio Şekil 4. tohum soyu naklindenA. OKA2&#39;den ekson 9&#39;dan ns. 306 bp&#39;lik PCR ürünleri mexicanustan enjekte kurucu balık 10 F 1 balık havuzları sınırlama enzimi kaybı açısından incelendi. Amplikon bir kısmı 10 F 1 embriyo havuzlarında kısıtlama sindirmek dirençli iken bir kontrol embriyo amplikon sindirildi. Kısıtlama enzimi 1 s indellerin 29 içerdiği gösterilmiştir OCA2 F dayanıklı bantları sindiremez. Ile şerit &quot;-&quot; &quot;+&quot; sınırlama enzimi ile sindirilir ile, şerit sindirilmemiş edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reaksiyon bir </td><td></td><td></td><td> ReactiB </td><td></td></tr><tr><td> miktar </td><td> reaktif </td><td></td><td> miktar </td><td> reaktif </td></tr><tr><td> 4 ul </td><td> Su </td><td></td><td> 10 ul </td><td> Su </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pFUS_A </td><td></td><td> 1 ul </td><td> pFUS_B4 </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> Bsal </td><td></td><td> 1 ul </td><td> Bsal </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> BSA </td><td></td><td> 1 ul </td><td> BSA </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> ligaz </td><td></td><td> 1 ul </td><td> ligaz </td></tr><tr><td> 2 ul </td><td colspan="2"> 10x ligaz tamponu </td><td> 1 ul </td><td> 10x ligaz tamponu </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pNH1 </td><td></td><td> 1 ul </td><td> pNG1 </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pNH2 </td><td></td><td> 1 ul </td><td> pHD2 </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pNG3 </td><td></td><td> 1 ul </td><td> pNH3 </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pHD4 </td><td></td><td> 1 ul </td><td> pNI4 </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pHD5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pHD6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pNG7 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pHD8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pNG9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> pHD10 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Bir Tablo 1. Örnek reaksiyon montaj A ve BTALEN içeren RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> primer ismi </td><td> dizisi (5&#39;-3 &#39;), </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr></tbody></table> 34 koloni PCR Tablo 2. PCR primerleri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> miktar </td></tr><tr><td> Taq mastermiks, 2x </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> pCR8_F1 astar,10 uM </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> pCR8_R1 primeri, 10 uM </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 42 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Farklı bir Taq kullanılması durumunda * master karışımı ayarlama </td></tr></tbody></table> Koloni için 100 ul (15 ul / reaksiyon) PCR 1 Tablo 3. Ana karışımı. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman (sn) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 105 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> 30 devir için 2. adıma gidin </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Koloni PCR 1 Tablo 4. PCR programı. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> miktar </td><td> reaktif </td><td> konsantrasyon </td></tr><tr><td> 12 ul </td><td> Su </td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> vektör A </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> B vektörü </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> Hedef vektör pT3Ts-gT </td><td> 50 ng / | il </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> Nihai RVD (PLR-RVD) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> Esp3I </td><td></td></tr><tr><td> 1 ul </td><td> ligaz </td><td></td></tr><tr><td> 2 ul </td><td colspan="2"> 10x ligaz tamponu </td></tr></tbody></table> Ikinci montaj reaksiyonları için Tablo 5. Protokolü. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman (sn) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 180 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> 30 devir için 2. adıma gidin </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tablo 6. PCR programıkoloni PCR 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sıcaklık </td><td> 290 </td></tr><tr><td> Çek </td><td> 150 </td></tr><tr><td> hız </td><td> 100 </td></tr><tr><td> zaman </td><td> 150 </td></tr><tr><td colspan="2"> Bu parametreler, bir çukur iplik kullanarak bir Flaming / Brown Mikropipet Çektirme Model P-97 içindir </td></tr></tbody></table> Program çekerek Tablo 7. Örnek iğne. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> miktar </td></tr><tr><td> Taq mastermiks, 2x </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> gen spesifik ileri primer, 10 uM </td><td> 1. μl </td></tr><tr><td> gene spesifik ters primer, 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 9.5 ul </td></tr><tr><td> DNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Farklı bir Taq kullanılması durumunda * master karışımı ayarlama </td></tr></tbody></table> Gen spesifik PCR için Tablo 8. Örnek protokolü. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman (sn) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 56 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> s git35 devir için tep 2 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Spesifik primerler ve PCR ürün boyutu için tavlama sıcaklığı ve uzatma süresini ayarlamak </td></tr></tbody></table> Gen spesifik PCR için Tablo 9. Örnek PCR programı.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs at JoVE.com

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.

genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K Görüntüleme.  Iowa State University.  Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir. 

Video: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a method for inducing and recording the progress of a DTH reaction in the rat ear. This is followed by a demonstration of the preparation of rat ear tissue for two-photon imaging of the CCR7- effector / memory T cell response.
An adoptive DTH is induced by the intraperitoneal injection of GFP-labeled Ova-specific CCR7- effector / memory T cell line (Beeton, C J. Visualized Experiments, Issue 8). Cells are then allowed to equilibrate in the rat for 48 hours before challenge by injecting one ear with saline (control ear) and the other with a 1:1 mix of Ova and Ova conjugated to Texas-Red (Ova-TR) to allow visualization of resident antigen-presenting cells.
We describe a method of tissue preparation useful for imaging the motility of cells within the deep dermal layer during an immune response, in conjunction with visualization of collagen fibers by second harmonic generation. Ear tissue is cut into 5 x 5 mm squares (slightly larger is better) and mounted onto plastic cover slips using Vetbond&trade;, which are then secured using silicone grease in an imaging chamber and superfused by oxygen-bubbled tissue culture medium at 37&deg;C.

Here we demonstrate a method for inducing and recording the progress of a delayed type-hypersensitivity (DTH) reaction in the rat ear. This is followed by a demonstration of the preparation of rat ear tissue for two-photon imaging of the effector / memory T cell response.

Kabul edilmiş DTH indüksiyonu sonra Kulak Görüntüleme Efektör Bellek T hücreleri

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

Biyoloji

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Gamete koleksiyonu ve Astyanax mexicanus In vitro fertilizasyon

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...