Este trabajo fue financiado por el Departamento de Genética, Desarrollo y Biología Celular y la Universidad Estatal de Iowa y por el NIH subvención EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner proporcionó comentarios sobre el manuscrito.

Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Iowa y la Universidad de Maryland. 1. Diseño TALEN <ol><li> De entrada deseada secuencia diana a un sitio web de diseño TALEN. (Por ejemplo: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Entrada elegido longitudes de matriz espaciador / repetición. <ol><li> Copiar la secuencia genómica en la casilla &quot;Secuencia&quot;. </li><li> Dentro de la pestaña &quot;Usuario Proporciona espaciador / RVD Longitudes&quot; seleccionar la longitud del espaciador y la longitud de la matriz. Nota: Las longitudes del espaciador de 15 pares de bases y repetir longitudes de matriz de 15-17 trabajo bien y hacer el montaje menos complejo. </li></ol></li><li> Seleccionar un par TALEN. pares TALEN diseñado alrededor de un sitio de enzima de restricción único permiten para el genotipado por digestión de enzima de restricciónun producto de PCR. </li><li> Cebadores Diseño para amplificar la región genómica que rodea el sitio de destino TALEN el uso de un sitio web, como Primer3 30-32. Cuando genotipo con una enzima de restricción, cebadores de diseño para amplificar una región que contiene el sitio de enzima de restricción sólo una vez. Se recomienda que esta región se amplifica y se secuenció antes de la construcción para identificar cualquier TALEN polimorfismos presentes en el A. mexicanus población laboratorio para ser utilizado para la microinyección. </li></ol> 2. Asamblea TALEN (Modificado de Protocolo TALEN Kit) 33,34 Para detalles adicionales y solución de problemas, consulte el protocolo 34. <ol><li> Preparar y secuenciar los plásmidos necesarios del kit TALEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Configurar el # 1 para las reacciones reacciones A y B. Incluir repetir variable diresidues (1-10) RVDS y la pFUS_A vector de destinación en la Reacción A. Incluir RVDS 11- (N-1) y THvector e destino pFUS_B (N-1) en la Reacción B, donde N es el número total de RVDS en la TALEN. <ol><li> Añadir a cada reacción: 1 l de cada plásmido que contiene cada RVD (100 ng / l), el vector de destino (100 ng / l), 1 l Bsa I enzima de restricción, 1 l albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 l de ligasa, 2 l de tampón de ligasa 10X y x l de agua para un volumen total de 20 l. Por ejemplo, véase la Tabla 1. Nota: La mitad de reacciones también se pueden utilizar. </li><li> Coloque reacciones en un termociclador y ejecute el ciclo: 10 veces (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Se incuban las reacciones con nucleasa. Para cada reacción de añadir 1 l de ATP 25 mM y 1 l de nucleasa. Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Transformar reacciones. <ol><li> Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes. Nota: Hecho en casa c competenteells se pueden utilizar. Sin embargo, las células con baja competencia puede dar lugar a la falta de colonias. <ol><li> Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante cinco min. Se incuban las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar los tubos en hielo durante 2 min. Añadir 125 l de caldo de Super óptima con la represión catabólica (SOC). Agitar los tubos a 37 ° C durante 1 hora. </li></ol></li><li> Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con espectinomicina (50 g / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Crecer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escoja 2-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores pCR8_F1 y pCR8_R1 (Tabla 2). <ol><li> Hacer una mezcla maestra de los reactivos. Por ejemplo, véase la Tabla 3. </li><li> Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con espectinomicina(50 mg / ml). Colocar 15 l de la mezcla maestra en el tubo con la colonia. </li><li> Ejecute el siguiente programa de PCR (Tabla 4) </li><li> Compruebe el PCR (ejecutar todo el volumen) en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán una banda en el tamaño esperado, así como una mancha y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33. </li><li> Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación. </li></ol></li><li> Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Secuencia de verificación de secuencia TALEN con pCR8_F1 y pCR8_R1. Siga los procedimientos descritos anteriormente 35. </li><li> El uso de los clones correctos verificadas por secuenciación, configurar la reacción # 2 (kit TALEN), que situará a los RVDS de los vectores A y B y el final de RVD en el vector de destino. <ol><li> Preparar la mezcla de reacción 2 (Tabla 5). Nota: Jareacciones LF pueden ser utilizados. </li><li> Colocar las reacciones en un termociclador y ejecute el siguiente programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transformar reacciones. <ol><li> Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes. <ol><li> Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante 5 min. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar los tubos en hielo. Añadir 125 l de SOC. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37 ° C durante 1 hr. </li></ol></li><li> Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con ampicilina (100 mg / ml), X-gal e IPTG. Crecer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escoja 1-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores TAL_F1 y TAL_R2 (Tabla 2). <ol><li> Hacer una solución de la polimerasa de Mastermix, agua y cebadores tal como sese describe en la Tabla 3. Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con ampicilina (100 mg / ml). Colocar 15 l de la solución en el tubo con la colonia. </li><li> Ejecutar el programa de PCR (Tabla 6). </li><li> Compruebe la PCR en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán un emborronamiento y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33. </li><li> Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación. </li></ol></li><li> Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Secuencia de verificación de secuencia TALEN con TAL_F1 y TAL_R2 siguiendo los métodos descritos anteriormente 35. </li></ol> 3. La transcripción de ARNm Talens <ol><li> Digerir 4 g de plantilla de secuencia verificada con 2 l Sac I durante 2 horas a 37 ° C. </li&gt; <li> Ejecutar 2 l de plásmido digerido con Sac en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los plásmidos que se digieren correctamente se mostrará una sola banda. </li><li> Se purifica el plásmido digerido con Sac restante siguiendo el protocolo de kit de purificación de PCR. Lavar dos veces con la solución de lavado antes de la elución. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Siga el protocolo estándar para la producción de T3 mRNA. <ol><li> Configurar medias reacciones utilizando 0,5 g de plantilla linealizado (preparado anteriormente). Incubar a 37 ° C durante 2 hr. </li><li> Añadir 0,5 l de DNasa (incluido en el kit) y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Se purifica el mRNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Ejecutar un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis para comprobar el mRNA. <ol><li> Limpiar el aparato de gel con un producto para eliminar la contaminación de ARNasa y preparar un gel de 1,2%. </li><li> Mezcla 1 mRNA l + 4 y# 181; l de agua + 5 l de tinte de carga glioxilo libre de nucleasa. Incubar las muestras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar los tubos brevemente y colocar en hielo antes de ejecutar el gel. </li></ol></li><li> Comprobar la concentración utilizando un método de cuantificación de las concentraciones de ácidos nucleicos y almacenar el RNA en alícuotas a -80 ° C. Elija un tamaño de alícuota de tal manera que el ARN no está congelado / descongelado más de una vez. Nota: Las concentraciones de 500-1000 ng / nl se obtienen típicamente. ARN con una concentración más baja se puede utilizar como el tiempo que se mantiene la integridad del ARN (tal como se evaluó por una banda en lugar de una mancha en el gel). </li></ol> 4. Inyectar Astyanax mexicanus Los embriones con TALEN ARNm <ol><li> Preparar Herramientas para inyección. <ol><li> Verter en las placas de inyección mediante el vertido de 1,2% de agarosa en agua de pescado (agua acondicionada con bicarbonato de sodio y sal de mar a pH 7,4 y la conductividad de 700 mS) en una placa de Petri. Colocar un molde (pieza de plástico con las proyecciones de hacer pozos para peceshuevos) en el interior del plato. Retire el molde cuando la agarosa se ha endurecido y se almacena a 4 ° C. Para más detalles sobre el molde ver 36. </li><li> Tire de agujas para inyección utilizando un extractor de aguja de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: longitud de la aguja apropiada es importante para inyecciones. Agujas que son demasiado largos serán demasiado flexible para inyecciones. El protocolo para agujas de tracción variará con el equipo utilizado para tirar de las agujas. Un ejemplo de una aguja apropiada se muestra en la Figura 1. Para nuestro equipo, que tire las agujas que son de 5-6 cm de longitud, y tienen un diámetro exterior en la punta de aproximadamente 0,011 mm cuando se rompen. Sin embargo, las agujas deben ser calibrados (paso 4.3.4) para determinar el ancho de la abertura. Un programa de ejemplo para tirar de las agujas se puede encontrar en la Tabla 7. </li><li> Preparar pipetas de vidrio para la transferencia de embriones rompiendo la pipeta de modo que la abertura sea suficientemente grande para un huevo pase a través. Flamear el extremo roto hastaya no es agudo. Nota: Es importante utilizar pipetas de vidrio y recipientes de vidrio cuando se trabaja con A. huevos mexicanus y embriones, ya que son pegajosos y se adhieren al plástico. </li></ol></li><li> Recoge 1 de células Etapa huevos. <ol><li> Raza A. mexicanus siguiendo protocolos estándar 37. Nota: Por ejemplo, si los peces se mantienen en un 14 ciclo de luz: oscuridad 10 y usando el tiempo Zeitgerber (ZT) con Zt0 como luces encendidas y ZT14 como las luces apagadas, nuestra peces desovan superficie entre ZT15 y ZT19. la época de reproducción exacta debe determinarse para cada laboratorio individual. </li><li> Inducir el desove de los peces sobrealimentación durante 3-4 días antes del apareamiento y la colocación de los peces en agua dulce. Elevar la temperatura de 2 ° C. Nota: Nuestro temperatura inicial del agua es de aproximadamente 74 ° C. </li><li> Recoger los huevos de peces de la superficie en la oscuridad, comprobando cada 15 min para obtener huevos en la etapa de 1 célula. Cientos de huevos se pueden obtener de un único par de peces superficie. </li><li> Recogerhuevos en recipientes de vidrio para evitar que se pegue a las superficies de plástico y de tipo para aislar embriones en la etapa de 1 célula antes de la inyección mediante la observación de los huevos bajo el microscopio y la recogida de los huevos que son una sola célula. Mantenga los huevos en agua dulce del sistema (agua del tanque en el que se alojan los peces adultos, que ha sido tratado para el pH y la conductividad). </li></ol></li><li> Inyectar TALEN mRNA. <ol><li> Inyectar diferentes cantidades de mRNA total (cantidades iguales de cada TALEN en el par) para determinar la concentración óptima para la inyección como la toxicidad y la eficacia varían por TALEN par. Para empezar, la inyección de concentraciones de ARNm totales que son 400-800 pg. Diluir y combinar mRNA a concentraciones deseadas para la inyección de 1,5 nl. </li><li> Cargar diluyó ARNm en la parte posterior de la aguja y colocar la aguja a un micro-inyector. </li><li> Romper la aguja con unas pinzas. </li><li> Calibrar la aguja. Por ejemplo, expulse 10 veces y recoger el consiguiente descenso de un capilar micro. Por 10 x 100 1.0 desechable81; l, 32 mm micro capilar, la caída debe llenar el micro capilar de 0,5 mm para la inyección de 1,5 nl / 1. Ajustar el tiempo de inyección y la presión según sea necesario. </li><li> Insertar la aguja en la celda única e inyectar el ARNm. Inyectar el mRNA directamente en la célula, no en la yema. </li><li> Recoger los embriones inyectados en recipientes de vidrio. Mantener embriones a 23-25 ​​° C. Retire los embriones muertos (que se convierten en embriones nublado y de forma irregular) regularmente durante los primeros días después de la inyección. Un número récord de embriones muertos y deformes de control (no inyectada) y las placas inyectadas. Nota: El aumento de la concentración de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad / muerte de los embriones. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser equilibrado para determinar la mejor concentración de ARNm para inyectar. </li></ol></li></ol> 5. El fenotipo de los pescados Fundador y evaluar la eficiencia TALEN <ol><li> Sacrificar embriones de animales según el protocolo institucional. Nota: Se practicar la eutanasiaembriones se refrigera rápidamente en hielo. </li><li> Recoger los embriones en 0,8 l de PCR tiras de tubos utilizando una pipeta de transferencia. Nota: El genotipado puede realizarse en embriones o piscinas de embriones individuales. </li><li> Extraer el ADN. <ol><li> Coloque los embriones en 100 l de hidróxido de sodio 50 mM (NaOH) y se incuba a 95 ° C durante 30 min, después se enfría a 4 ° C. </li><li> Añadir 1/10 volumen (10 l) de 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Realizar una PCR en la región utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.3 (véase las Tablas 8 y 9 para los protocolos de muestra). Para los embriones individuales 1 l de ADN es suficiente para la reacción de PCR. </li><li> Se digiere el producto de PCR resultante con la enzima de restricción apropiada y correr un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. <ol><li> Por ejemplo, para la genotipificación del locus albinismo oculocutáneo 2 (OCA2) en embriones inyectados digerir el producto de PCR usando la enzima de restricción Bsr I mediante la adición de 0.5 L de Bsr I directamente a 12,5 l de la reacción de PCR completado, incubando a 65 ° C durante 2 horas. Ejecutar el no digerido y el producto digerido en un gel. Bandas resistentes de enzimas de restricción (es decir, bandas que no digieren) indican que las mutaciones inducidas por TALEN están presentes (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opcional) Calcular la tasa de mutación porcentaje determinando el porcentaje de producto sin cortar mediante el análisis de imágenes de los geles en Fiji 38 utilizando la herramienta de análisis de gel para calcular el valor de intensidad de cada banda como se ha descrito previamente 29. </li><li> Determinar la secuencia de los alelos mutantes por clonación TA la banda mutante resistente se purificó en gel de enzima de restricción y secuenciación de clones. <ol><li> Gel purificar la enzima de restricción banda mutante resistente siguiendo las instrucciones del fabricante. TA clonar la banda siguiendo las instrucciones del fabricante. Recoger colonias y crecer en 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C en un zarandeoincubadora. </li><li> culturas Miniprep siguientes instrucciones del fabricante. Enviar el ADN para la secuenciación. </li><li> El uso de un programa como el mono, alinear las secuencias mutantes de la secuencia de tipo salvaje. <ol><li> Copiar y pegar las dos secuencias en archivos APE. Elija la herramienta &quot;alinear dos secuencias&quot; en el menú &quot;Herramientas&quot;. </li><li> Especificar las dos secuencias de ADN utilizando los menús desplegables. Nota: puede ser necesario utilizar dependiendo de la dirección de la PCR entró en el vector de clonación el complemento inverso de la secuencia clonada. Si las secuencias no se alinean, repita los pasos marcando la casilla &quot;Rev-Com&quot; en el cuadro &quot;ADN Align&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Evaluar los peces fundador de fenotipos en la etapa adecuada y mediante métodos apropiados para el fenotipo esperado 29 (Por ejemplo, la Figura 3). Los métodos de fenotipificación se basarán en el fenotipo esperado para el gen diana por el investigador usando el protocol. </li></ol> 6. Pantalla de transmisión de la línea germinal Nota: A. mexicanus alcanzar la madurez sexual a los 4-8 meses. <ol><li> Cruzar los peces sexualmente maduros fundador de peces de tipo salvaje. </li><li> Embriones de pantalla o peces adultos usando métodos en los pasos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peces adultos, un trozo de la cola se puede enganchar tras la anestesia. <ol><li> Anestesiar pescado sumergiendo pescado en una solución de tricaína (éster etílico del ácido 3-aminobenzoico) para reducir la tensión durante el recorte de la aleta. Tras corte de una aleta, permiten que los peces se recuperen en agua dulce. Los peces se recuperan con rapidez; observar hasta que se recuperen (normalmente son la natación). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Grandes avances se han hecho en los últimos años hacia la comprensión de la base genética de la evolución de los rasgos. Aunque se han identificado los genes candidatos que subyacen a la evolución de una serie de rasgos, se ha mantenido un reto para poner a prueba estos genes in vivo debido a la falta de maleabilidad genética de las especies evolutivamente más interesantes. Aquí mostramos un método para la edición del genoma de A. mexicanus, una especie usada para estudiar la evolución de los animales de la cueva. La cartografía genética estudia 1,21,23 y el gen candidato se aproxima a 19,40 han identificado una serie de genes candidatos para la evolución de los rasgos en forma de cueva A. mexicanus. La reciente publicación del genoma cavefish 41 proporciona una poderosa herramienta adicional para la identificación de genes candidatos para la evolución de los rasgos de la cueva. Prueba de la función de muchos de estos genes candidatos requiere de técnicas para reducir la expresión de genes. La única opción actual para el estudioing expresión génica reducida en A. mexicanus es por el uso de morfolinos. Sin embargo, gen desmontables morfolino es transitoria, limitada a unos pocos días después de la fecundación, y no es útil para el estudio de los rasgos en los animales adultos, como las diferencias de comportamiento entre la cueva de adultos y peces de superficie como la instrucción 17, 19 hiperfagia y la atracción de vibración 42 comportamiento. Generación de pérdida de alelos función de los genes, como los que se pueden hacer usando Talens, será crítico para el ensayo de la función de los genes candidatos para estos rasgos. Se han desarrollado métodos para facilitar el montaje de pares TALEN 33 y el protocolo de detalles de este método está disponible 34. Este protocolo se ha optimizado para el uso de pez cebra por Bedell et al., 7, utilizando un vector destino final diferente, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Este vector permite la transcripción de mRNA TALEN para la inyección en embriones de pez cebra unicelulares.Hemos utilizado este método de montaje modificada, se explica en detalle aquí, para ensamblar y transcribir Talens para la inyección en A. mexicanus. Hemos encontrado que cuando se inyecta en la superficie unicelular A. embriones mexicanus, tal como se describe en este protocolo, se podrían mutar A. genes mexicanus 29. Para futuras investigaciones sobre genes candidatos que no se describen en este protocolo, las secuencias se pueden encontrar en el genoma cavefish 41 y utilizarse para identificar sitios diana TALEN. Crítico para inyecciones exitosas es ARNm TALEN alta calidad. Por lo tanto, la comprobación de la calidad del ARN mediante la ejecución de una pequeña cantidad de ARN en un gel antes de la inyección es importante (Paso 3.6). Otras precauciones para mantener la integridad del ARN, tales como la congelación alícuotas para evitar el deshielo de congelación (paso 3.7), y el mantenimiento de condiciones estériles mediante el uso de tubos de agua limpia y libre de RNasa y consejos durante las inyecciones (paso 4), se deben tomar. Un paso crítico adicional para la cría de peces es inyectadala limpieza de embriones muertos después de la inyección, como embriones muertos pueden afectar rápidamente la calidad del agua. De este modo, se elimina embriones muertos la mañana después de las inyecciones, y periódicamente durante los próximos pocos días después de las inyecciones para mantener los embriones vivos sanos (Paso 4.3.6). TALEN mutagénesis en Astyanax mexicanus puede ser altamente eficiente; Sin embargo, la eficiencia varía en función del par TALEN inyecta 29. El aumento de las concentraciones de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad y la muerte de los embriones inyectados. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser probado y equilibrado para determinar la concentración óptima de mRNA para inyectar. Para los pares de TALEN altamente eficientes, fenotipos pueden ser evaluados en el pescado fundador inyectado. Por ejemplo, la inyección de Talens OCA2 focalización resultó en parches albinos en el pescado superficie 29 (Figura 3). Para otros rasgos o genes, sin embargo, la evaluación de los fenotipos en los peces fundador puede ser un reto debidoque sutilmente del fenotipo o baja eficiencia de la pareja TALEN inyectado. Por lo tanto, para muchas aplicaciones será deseable para generar mutaciones de línea germinal en un gen de interés para el análisis de la función de un gen candidato en un animal no mosaico. La obtención de la transmisión de la línea germinal de mutaciones inducidas por TALEN en A. mexicanus es posible 29 (Figura 4). Por lo tanto, esta técnica se puede aplicar para evaluar otros genes candidatos. Existen unas pocas limitaciones para realizar manipulaciones genéticas en Astyanax mexicanus en este momento. Superficie y raza cavefish en la oscuridad, tarde en la noche. En un laboratorio en el que no es posible revertir el ciclo de oscuridad luz, los investigadores deben llegar tarde por la noche para llevar a cabo inyecciones, ya que es fundamental para inyectar inmediatamente después del desove. Además, es importante recoger embriones de peces de superficie en la oscuridad, como la luz afecta el desove. Otras técnicas, en particular el sistema / Cas CRISPR (revisado en 43), existiendo para la edición del genoma y que probablemente será aplicable a A. mexicanus. De hecho, existen protocolos para el conjunto de guía de ARN que son rápida y fácil 44 y el protocolo reportados aquí pueden ser modificados para inyección CRISPR / Cas. Además, se están desarrollando nuevos rápidamente aplicaciones para editar genoma, y muchas de ellas pueden resultar útiles para A. investigadores mexicanus. Por ejemplo, en las mutaciones precisas de pez cebra se han hecho en un gen de interés por coinjecting Talens con una sola oligo hebra que contiene una mutación 7. Esta técnica podría ser útil para evaluar el papel de los alelos de la cueva en la generación de fenotipos de las cavernas, tales como el papel de una mutación sin sentido en ciertos alelos cueva de MC4R en diferencias en el metabolismo observadas entre cavefish y la superficie de los peces 19. Talens también se han utilizado para generar alelos de genes a través de recombinación homóloga que expresan marcadores fluorescentes in patrones similares a los loci endógenos 45. Estos métodos se podrían utilizar en A. mexicanus para evaluar subconjuntos de células o la expresión de genes candidatos. El sistema / Cas CRISPR se ha utilizado en el pez cebra para obtener los tejidos específicos de eliminación de genes 46. Estas técnicas, aplicadas a A. mexicanus, podría ser útil para evaluar la base genética de los procesos tales como la pérdida del ojo en cavefish. La lente tiene un papel crítico en el proceso de pérdida de ojo en cavefish 47 y el sistema / Cas CRISPR específico de tejido puede ser usado para evaluar el papel de los genes candidatos para la pérdida de ojo específicamente en la lente frente a otros tejidos del ojo. Estas y otras técnicas de edición de genoma pueden ser utilizados en A. mexicanus en futuros estudios para responder a las preguntas críticas acerca de la evolución de los rasgos de la cueva.

La comprensión de la base genética de la evolución rasgo es un objetivo de investigación crítica de los biólogos evolutivos. Se ha logrado un progreso considerable en la identificación de loci que subyacen a la evolución de los rasgos y la localización de genes candidatos dentro de estos loci (por ejemplo 1-3). Sin embargo, las pruebas funcionalmente el papel de estos genes se ha mantenido desafiante como muchos organismos utilizados para el estudio de la evolución de los rasgos no son actualmente manejable de forma genética. El advenimiento de las tecnologías de edición genoma ha aumentado considerablemente manipulabilidad genética de una amplia gama de organismos. Nucleasas de transcripción activador de efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPRs) se han utilizado para generar mutaciones específicas en los genes en un número de organismos (por ejemplo 4-11). Estas herramientas, aplicado en un sistema evolutivamente relevante, tienen el potencial de revolucionar la forma en que los biólogos evolutivos estudiar la base genética de la evolución. Astyanax mexicanus es una especie de pez que existe en dos formas: a. (Peces de superficie) que habitan en el río forma superficial y múltiples formas cavernícolas (cavefish) A. cavefish mexicanus evolucionó de ancestros de peces de superficie (revisado en 12). Las poblaciones de cavefish han desarrollado una serie de características, incluyendo la pérdida de los ojos, disminución o pérdida de la pigmentación, el número de papilas gustativas y neuromastos craneales, y los cambios de aumento en el comportamiento, tales como la pérdida de la conducta escolar, aumento de la agresividad, los cambios en la alimentación de la postura y la hiperfagia 13 -19. Cavefish y pescado superficie son interfértiles, y los experimentos de mapeo genético se han realizado para identificar loci y genes candidatos para los rasgos de la cueva 1,20-26. Algunos genes candidatos han sido probados para un papel funcional en la contribución a los rasgos de la cueva en el cultivo celular 1,19, en organismos modelo de otras especies de 21 o 27 por la sobreexpresión o una caída transitoria ucantar morfolinos 28 en A. mexicanus. Sin embargo, cada uno de estos métodos tiene limitaciones. La capacidad de generar alelos mutantes de estos genes en A. mexicanus es crítica para la comprensión de su función en la evolución de cavefish. Por lo tanto, A. mexicanus es un organismo candidato ideal para la aplicación de las tecnologías de edición genoma. Aquí describimos un método para la edición del genoma de A. mexicanus usando Talens. Este método se puede utilizar para evaluar mosaico inyectado peces fundador para fenotipos y para el aislamiento de líneas de pescado con mutaciones estables en los genes de interés 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection station</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle puller</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td>
			<td style="width:71px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">Kit #1000000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Teknova TET-15 in 50% EtOH</td>
			<td style="width:71px;">Teknova (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-843-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2957-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Super Ampicillin (1000x solution)</td>
			<td style="width:71px;">DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6060-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERR0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1620-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">BsaI</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-812-203</td>
			<td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">provided with restriction enzymes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10x T4 ligase buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-C1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">GoTaq Green Master mix</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PRM7123</td>
			<td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Quick ligation kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-811-728</td>
			<td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C4040-06</td>
			<td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Esp 3I</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERER0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td>
			<td style="width:71px;">Epicentre (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">NC9046399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27106</td>
			<td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td>
			<td style="width:71px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-3119-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sac I</td>
			<td style="width:71px;">Promega (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-R6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1348M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Ambion (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eliminase</td>
			<td style="width:71px;">Decon (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">04-355-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microcaps</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN par inyecciones dan como resultado la unión de los RVDS a los nucleótidos de ADN específicas y por lo tanto la dimerización de los dominios de FokI, dando lugar a roturas de doble cadena 39 que pueden ser reparados a través de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ menudo introduce errores que resultan en inserciones o deleciones (indeles). Indeles pueden ser identificados mediante la amplificación de la región que rodea el sitio de destino TALEN y digerir el amplicón resultante con una enzima de restricción que corta dentro de la región espaciadora TALEN. Los alelos sin un indel se digerir, mientras que los alelos que contiene indeles que cambian la secuencia diana con enzimas de restricción no digerirá, produciendo una banda resistente a los enzimas de restricción (Figura 2). Inyecciones TALEN probable pueden dar lugar a mutaciones de genes bialélicos en A. mexicanus 29. Por lo tanto, algunos fenotipos pueden ser evaluados en el pescado fundador. por<html> ejemplo, se evaluó la pigmentación en peces tapa inyectada en Talens OCA2 la orientación, el gen de la hipótesis de ser responsable de albinismo en múltiples poblaciones albinas de cavefish 1,28. Encontramos parches albinos en los peces inyectados-TALEN OCA2 no está presente en el pescado sin inyectar 29 (Figura 3). Para muchos experimentos, es deseable disponer de líneas mutantes de peces para evaluar fenotipos. Fundador de pescado con alelos mutantes de transmisión puede ser identificado por genotipo de la progenie de los cruces de peces fundador a los peces de tipo salvaje (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig1.jpg" /> Figura 1. Aguja para la inyección de mRNA. Fotografía de una micropipeta antes de ser rota utiliza para inyectar TALEN ARNm en embriones unicelulares._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig2.jpg" /> Figura 2. eficiencia TALEN para OCA2. 306 productos pb de PCR de exón 9 de OCA2 en Astyanax mexicanus se examinaron para la pérdida del sitio de enzima de restricción cuando se inyectaron diferentes cantidades de mRNA 29 TALEN. El amplicón de un embrión de control se digirió mientras que una parte del amplicón era resistente a la digestión de restricción en las piscinas de 10 TALEN inyecta embriones. Restricción de digestión con enzimas de bandas resistentes a partir de embriones inyectados con mRNA TALEN dirigido OCA2 han demostrado que contienen indeles 29. Tenga en cuenta que el aumento de las concentraciones de ARNm inyectado se obtiene mayor eficiencia TALEN (ADN sin digerir más). Carriles con &quot;-&quot; son digeridas, carriles con &quot;+&quot; son DigesTed con enzimas de restricción. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig3.jpg" /> Figura 3. Fenotipificación peces fundador de los cambios en la pigmentación. (A) Superficie de control no inyectado A. mexicanus. (B) Parche que carecen de melanóforos en un pez superficie fundador inyectados con 400 pg TALEN ARNm de orientación OCA2 (flecha). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig4.jpg" /> Figura 4. transmisión de la línea germinal de mutatio TALEN inducidans. 306 bp productos PCR de exón 9 del OCA2 en A. mexicanus se examinaron para la pérdida del sitio de enzima de restricción en piscinas de 10 F 1 pescado de un pez fundador inyectado. El amplicón de un embrión de control se digirió mientras que una parte del amplicón era resistente a la digestión de restricción en las piscinas de 10 F 1 embriones. Enzima de restricción digerir bandas resistentes de F OCA2 han sido mostrados 1 s para contener indeles 29. Carriles con &quot;-&quot; están sin digerir, carriles con &quot;+&quot; son digeridos con la enzima de restricción. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reacción A </td><td></td><td></td><td> Reactien B </td><td></td></tr><tr><td> cantidad </td><td> reactivo </td><td></td><td> cantidad </td><td> reactivo </td></tr><tr><td> 4 l </td><td> agua </td><td></td><td> 10 l </td><td> agua </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pFUS_A </td><td></td><td> 1 l </td><td> pFUS_B4 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> BsaI </td><td></td><td> 1 l </td><td> BsaI </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> BSA </td><td></td><td> 1 l </td><td> BSA </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> ligasa </td><td></td><td> 1 l </td><td> ligasa </td></tr><tr><td> 2 l </td><td colspan="2"> tampón de ligasa 10X </td><td> 1 l </td><td> tampón de ligasa 10X </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNH1 </td><td></td><td> 1 l </td><td> pNG1 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNH2 </td><td></td><td> 1 l </td><td> PhD2 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNG3 </td><td></td><td> 1 l </td><td> pNH3 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pHD4 </td><td></td><td> 1 l </td><td> pNI4 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> PhD5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> PHD6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNG7 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pHD8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNG9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pHD10 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Ejemplo de montaje de reacción A y B para unaTALEN contiene RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> nombre de imprimación </td><td> secuencia (5&#39;-3 &#39;) </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los cebadores de PCR para PCR de colonias, de 34. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reactivo </td><td> cantidad </td></tr><tr><td> Mastermix Taq, 2x </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> pCR8_F1 imprimación,10 uM </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> cebador pCR8_R1, 10 uM </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 42 l </td></tr><tr><td colspan="2"> * Ajuste de mezcla maestra si se utiliza un taq diferente </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Maestro mezcla de 100 l (15 l / reacción) por PCR de colonias 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso </td><td> la temperatura (° C) </td><td> tiempo (seg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 105 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Vaya al paso 2 durante 30 ciclos </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Programa de PCR para PCR de colonias 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> cantidad </td><td> reactivo </td><td> concentración </td></tr><tr><td> 12 l </td><td> agua </td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> A vector </td><td> 100 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> vector B </td><td> 100 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> vector destino pT3Ts-GT </td><td> 50 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> RVD final (PLR-RVD) </td><td> 100 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> Esp3I </td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> ligasa </td><td></td></tr><tr><td> 2 l </td><td colspan="2"> tampón de ligasa 10X </td></tr></tbody></table> Tabla 5. Protocolo para las reacciones de segundo montaje. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso </td><td> la temperatura (° C) </td><td> tiempo (seg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 180 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Vaya al paso 2 durante 30 ciclos </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Programa de PCRpara la PCR de colonias 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> calor </td><td> 290 </td></tr><tr><td> Halar </td><td> 150 </td></tr><tr><td> velocidad </td><td> 100 </td></tr><tr><td> hora </td><td> 150 </td></tr><tr><td colspan="2"> Estos parámetros son para un Flaming / Castaño Micropipeta Tirador Modelo P-97 utilizando un filamento de artesa </td></tr></tbody></table> Tabla 7. Ejemplo de programa de la aguja tirando. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reactivo </td><td> cantidad </td></tr><tr><td> Mastermix Taq, 2x </td><td> 12,5 l </td></tr><tr><td> gen cebador directo específico, 10 micras </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> gen cebador inverso específico, 10 micras </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 9.5 l </td></tr><tr><td> ADN </td><td> 1 l </td></tr><tr><td colspan="2"> * Ajuste de mezcla maestra si se utiliza un taq diferente </td></tr></tbody></table> Tabla 8. protocolo de muestra para la PCR específica de genes. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso </td><td> la temperatura (° C) </td><td> tiempo (seg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 56 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Ve a SASO 2 durante 35 ciclos </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Ajustar la temperatura de recocido y tiempo de extensión de cebadores específicos y el tamaño del producto de PCR </td></tr></tbody></table> Tabla 9. programa de PCR de la muestra para la PCR específica de genes.

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K vistas.  Iowa State University.  mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish. 

Video: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a method for inducing and recording the progress of a DTH reaction in the rat ear. This is followed by a demonstration of the preparation of rat ear tissue for two-photon imaging of the CCR7- effector / memory T cell response.
An adoptive DTH is induced by the intraperitoneal injection of GFP-labeled Ova-specific CCR7- effector / memory T cell line (Beeton, C J. Visualized Experiments, Issue 8). Cells are then allowed to equilibrate in the rat for 48 hours before challenge by injecting one ear with saline (control ear) and the other with a 1:1 mix of Ova and Ova conjugated to Texas-Red (Ova-TR) to allow visualization of resident antigen-presenting cells.
We describe a method of tissue preparation useful for imaging the motility of cells within the deep dermal layer during an immune response, in conjunction with visualization of collagen fibers by second harmonic generation. Ear tissue is cut into 5 x 5 mm squares (slightly larger is better) and mounted onto plastic cover slips using Vetbond&trade;, which are then secured using silicone grease in an imaging chamber and superfused by oxygen-bubbled tissue culture medium at 37&deg;C.

Here we demonstrate a method for inducing and recording the progress of a delayed type-hypersensitivity (DTH) reaction in the rat ear. This is followed by a demonstration of the preparation of rat ear tissue for two-photon imaging of the effector / memory T cell response.

Imágenes de las células efectoras T de memoria en el oído después de la inducción de DTH adoptivos

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

Investigación

Biología

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Gamete Collection y Fertilización In Vitro de Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...