Yazarlar PDMS alt tabakaların hazırlanmasında yaptığı yardım için Eric Vasco teşekkür etmek istiyorum, yararlı öneriler ve DRG izolasyon eğitimi için Michigan Üniversitesi&#39;nden Dr. Marina Mata&#39;nın laboratuarında Dr. Shiyong Wang ve Dr. Mark Tuszynski ve Dr . UC San Diego W. Marie Campana SC izolasyonu için yararlı öneriler ve protokol için. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0941055 ve CBET 1510895), Ulusal Sağlık Enstitüsü (R21CA176854, R01GM089866 ve R01EB014986) tarafından kısmen desteklenmiştir.

hücrelerin izolasyonu için tüm prosedürler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Önceden gerilmiş Anisotropik Yüzeyin hazırlanması 1. <ol><li> taban ve sertleştirme maddesinin 1 çözeltisi ve bir doku kültürü kabı (12 cm çapında) içine dökün: 10 karıştırın. 4900 mg tabanı ve toplam çapraz bağlama karışımı için sertleştirici 490 mg kullanın. </li><li> Hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için 20 dakika süreyle vakum altında jel karışımı tutun. </li><li> 60 ° C de bir gece sertleştirme fırında jel karışımı yerleştirin. </li><li> PDMS membran tedavileri sonrasında, 165 mTor 3 dakika ve O 2 65 sccm akışı için bir plazma temizleme / aşındırma sistemi kullanılarak oksijen plazma ile yüzey davranın. </li><li> haberdar olmak hangi tarafı oksijen tedavi ise, çanak dikdörtgen membranın (5 × 3.5 cm) bir parça kesin emin oksijen tedavi tarafı karşı karşıya makyaj ve germe çerçeve üzerine sabitleyin. Bir çerçeveye yerleştirin<html> sahne germe ve eşit 10% uzama ulaşıncaya kadar sahnede düğmeyi çevirerek streç (ya da diğer bazı önceden belirlenmiş streç; uzama doğrudan germe aşamasından okunabilir) uzun eksen 9. çerçeve vidaları sıkarak streç sabitleyin. </li><li> aşamasından çerçeveyi çıkarın. membran yüzeyi kuru ve tozsuz olduğundan emin olun, sonra zara sıkıca bağlamak için odasının yapışkan tarafını sağlayan zar üzerine bir silikon odasına yerleştirin. Not: Silikon odası PDMS zarı üzerinde hücre orta tutmak için bir kuyu sağlar. Cihaz tasarımı Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> 10 dakika boyunca UV ile yüzey sterilize edin. </li><li> Ekle 1 ml poli-L-lizin plazma işlemi 6 saat içinde oda içinde PDMS yüzeyine (PLL) (fosfat tamponlu salin içinde% 0.01) ve 37 ° C de 2 saat inkübe DRG nöronlarını tohumlanmasından önce. Bu hücre eki artırır. </li></ol>DRG le &quot;&gt; 2. İzolasyon <ol><li> DRG nöronlar için standart büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> izolasyon öncesinde, izolasyon ekipmanları ve filtre reaktifleri otoklav. 6 oyuklu plakanın bir kuyuya yalıtım tamponu 5 ml, ve buz üzerinde plaka koyun. 9 mi% 0.05 tripsin-EDTA (1 mg / ml), kolajenazın (500 U / ml), 1 ml ekleyerek ayrışma ortamı 10 ml hazırlamak buz üzerinde 0.22 um&#39;lik bir filtreden ve yer ile çözümler filtre. </li><li> izolasyonu için 7 gün &#39;Sprague-Dawley sıçanları - on 5 oniki kullanın. % 75 izopropanol ile yavrular Sprey ve boyunları vurularak kurban. </li><li> arka omurilik örten cilt kesip ve omurga etrafında herhangi bir aşırı doku kaldırmak. cerrahi spot ışıklandırma cerrahi büyüteç altında bir kesim makas ile her iki tarafta omurga boyunca, sonra boynundan ilk kesi yapmak ve. Yavruların vücuttan omurga ayırın ve aşırı kas çıkarın. Ardından, lon boyunca kesmek için makas kullanınomurga ve kullanımı cımbız g ekseni tam omurga açıp steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG&#39;ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipet spinal cord.Remove uç elde etmek için. </li><li> cımbız ince çifti kullanılarak, kemik cebinden ganglion kaldırmak ve yaklaşık 10 toplamak - Her iki taraftan 16 DRG. sinir kökleri Trim ve buz gibi soğuk izolasyon tampon ganglionlar aktarın. </li><li> steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG&#39;ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipetten ucu çıkarın. Kimyasal ayırmadan sonra, santrifüj 900 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de gangliyon. </li><li> dokular tüpün dibine çöker ve yavaşça üstüne izolasyon tampon kaldırmak ve tüp içine ayrışma ortamı 10 ml ekleyelim. </li><li> 10 dakika - tüp her 5 çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C su banyosu içinde ayrışma ortamı içinde parçalara dokuların inkübe edin. </li><li> SonraKimyasal ayrışma santrifüj 900 xg&#39;de gangliyon ve 5 dakika için 4 ° C. </li><li> Süpernatantı ve 10 ml standart büyüme ortamı ve vorteks pelet yeniden askıya. </li><li> bir kez daha bölüm 2.9 de belirtildiği gibi ayrışmış hücreleri Santrifüj. </li><li> Süpernatantı standart büyüme ortamı ve vorteks 12 ml pelet yeniden askıya. </li></ol> Önceden gergin Yüzeyde DRG 3. Kültür <ol><li> , Hücrelerin ekim odasından PLL çözümleri kaldırmak ve steril su ve kuru hava ile PDMS yüzeyin durulanması önce. </li><li> 2 dakika enkaz tüpün dibine yerleşmek için izin - hücrelerin yeniden askıya sonra, 1 için süspansiyon seti sağlar. Her streç odasına hücre süspansiyonu, 1.5 ml ilave edilir ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 ul (veya 15 ul) floro-2-deoksi-uridin ve üridin (FDU-U) stok soluti karışımı ekleyin, in vitro 1 gün (DIV) de, glial hücreleri ortadan kaldırmak için(Malzeme Tablo bakınız) de her birine. 7 saat sonra, taze, standart büyüme ortamı ile orta yerine ve% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde, önceden gerilmiş bir kültür Cihazı. </li><li> Hücre kültürü döneminde (2-3 hafta), taze ortam ile yarım harcanan orta değiştirerek her iki günde bir ortamı değiştirmek. Not: 2 hafta boyunca gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde kültürlendikten sonra arıtılmış, SC&#39;ler bölmeye ilave edilir ve bir hafta (aşama 4.7) kültürlendi. </li></ol> Önceden gergin Yüzey üzerinde DRG Nöronlar ile Schwann Hücreleri (SC&#39;ler) 4. Co-kültür <ol><li> Dr Campana&#39;nın grubuna daha önce 15 tarafından açıklandığı gibi SC&#39;ler izole eder. <ol><li> Kısaca, bir 1 gün eski yavru SC&#39;ler izole eder. Toplayın ve mekanik siyatik sinirleri kimyasal (Tripsin-EDTA ve kollajenaz A) hem de (18 gauge iğne / 10 ml şırınga) 15 ayırmak. </li><li> poli-D-lisin (PDL) co ayrışmış hücreleri Tohum% 5 CO2 37 ° C&#39;de ATED T25 şişesi ve kültür. 5. günde, anti-Thy 1.1 antikoru ve tavşan komplemanı kullanılarak antikor seçimi ile hücrelerin saflaştırılması ve geçişi ile 2 saflaştırılmış hücreleri alt-kültürü - Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal inek serumu ihtiva eden 4. kültür ortamı (FBS) ,% 1 Penisilin / Streptomisin (Penn / Strep), 21 ug / ml büyükbaş hayvan hipofız bezi (BPB) ayıklamak ve 4 uM Forskolin. </li></ol></li><li> SC&#39;ler kültür ortamının çıkarın ve şişeye 5 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. 3 dakika - 2% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> bu şişeden kaldırın, ardından da, kültür ortamının 5 ml ilave edilir ve şişe hücreler ile karıştırmak için 10X objektif kullanılarak optik mikroskop altında Hücrelerden. </li><li> 200 xg, 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücre süspansiyonu ilave edilir ve 5 dakika boyunca 20 ° C. </li><li> Süpernatantı ve 7 ml standart DRG büyüme med peletia. </li><li> Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine hücre süspansiyonu 10 ul alır tripan mavisi 10 ul ile kanştınn, ve daha sonra bir 10X objektif kullanılarak optik mikroskopta hemasitometre kullanılarak hücre sayısı. DRG büyüme ortamı ekleyerek ml başına 5.000 hücreleri hücre süspansiyonu seyreltilir. </li><li> gerilmiş bölme DRG kültüründen 0.5 ml ortamda çıkarın ve DRG kültüre SC süspansiyon 0.5 ml ilave ediniz. </li><li> Kültür, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO 2. değiştirme 1 hafta hücreler ortam DRG taze standart büyüme ortamı yarı harcanan ortamının değiştirilmesiyle her iki günde. 1 hafta ko-kültür sonrası işlem immünohistokimyasal 10, hücrelerin. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , 525-546 (2015).</li><li>Faweett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Nerve+Regeneration.">Peripheral Nerve Regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li><li>Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+adult+rat+corticospinal+tract+by+transplants+of+olfactory+ensheathing+cells.">Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.</a> Science. 277, 2000-2002 (1997).</li><li>Geller, H. M., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+bridge:+Engineering+spinal+cord+repair.">Building a bridge: Engineering spinal cord repair.</a> Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).</li><li>Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+is+accompanied+by+chronic+progressive+demyelination.">Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination.</a> J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).</li><li>Chua, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+neurites+sense+the+depth+of+the+underlying+topography+during+neuronal+differentiation+and+contact+guidance.">Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance.</a> Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).</li><li>Dowell-Mesfin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographically+modified+surfaces+affect+orientation+and+growth+of+hippocampal+neurons.">Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons.</a> J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).</li><li>Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+small+on+large:+Potential+utility+in+computations+of+fluid-solid+interactions+in+arteries.">Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries.</a> Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Static+Pre-stretch+Induced+Surface+Anisotropy+on+Orientation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+pre-stretch+induced+surface+anisotropy+on+axon+regeneration.">The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li><li>Berns, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+neurite+outgrowth+and+directed+cell+migration+in+self-assembled+monodomain+gels.">Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels.</a> Biomaterials. 35, 185-195 (2014).</li><li>Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron/astrocyte+co-culture+on+polyelectrolyte+multilayer+films:+A+template+for+studying+astrocyte-mediated+oxidative+stress+in+neurons.">Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons.</a> Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neurite+growth+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+and+increased+colocalization+with+Schwann+cells+on+aligned+poly(methyl+methacrylate)+electrospun+nanofibers.">Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers.</a> Brain Research. 1565, 18-27 (2014).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+(LRP1)+Regulates+Rac1+and+RhoA+Reciprocally+to+Control+Schwann+Cell+Adhesion+and+Migration.">Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).</li><li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces.">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li><li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding.">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li><li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organosilicon Materials. , (2013).</li><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+poly(dimethylsiloxane)+surface+modification+to+control+cell+adhesion.">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration.">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li><li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth.">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li><li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li></ol>

The authors do not have any conflict of interest to disclose.

önceden gerilmiş bir yüzeye akson hizalama teşvik etmek için, iki kritik adımlar vardır: 1) PDMS zarı ve homojen kalınlıkta düz olmalıdır; ve 2) glia hücreleri DRG uzaklaştırılmalıdır. PDMS ve çapraz bağlayıcı karıştırma ve bir fırında kür sonra, çapraz PDMS jel düz bir tezgah üstünde tutulur ve herhangi bir eğilmesini önlemek için dikkatle ele alınmalıdır. Plazma tedaviden sonra (hücre bağlanması için gerekli olan) sert yüzeye adsorbe zamanla azaltır çünkü PDMS dokunun oksijen plazma işleme PLL kaplama ile 6 saat içinde uygulanmalıdır. plazma işleme membranın bir tarafına uygulandığı için bakım plazma muamele edilen yüzey için hücreler için yukarı bakacak şekilde olmalıdır, yani, çerçeve üzerine yerleştirilir doğru yan sağlamak için çanak kapalı PDMS soyma sonra alınmalıdır eklemek. DRG omurga yanında hizaya kemik cepleri içinde yer almaktadır. vertebra rengi beyaz olduğundanGenç yavrular, omur gelen DRG&#39;ler ayırt etmek zordur. Bu durumda, spot ışığı yakın omurga yerleştirmek önemlidir. Kemik beyaz ve opak kalır ışığında, DRG şeffaf açın. PH nöral hücrelerin canlılığını etkilediğinden, buz üzerinde ve fizyolojik pH&#39;da diseksiyon tamponu tutmak önemlidir. İzole dokular çok viskoz ve bir santrifüj tüpüne aktarırken pipet sopa eğilimindedir. Böylece daha büyük bir açılış transferini kolaylaştırır oluşturmak için pipet çok uç kesim. Bazı protokoller olarak, ayrıştırma tamponu ilave edilmeden önce izole edilmiş dokular ile istenen bir daha santrifüj adımı vardır. Bu adımın yerine, protokol, aksi takdirde hücrelerin canlılığını ve yoğunluğunu etkileyecektir ekstra santrifüj adım azaltır birkaç dakika için diseksiyon tampon yerleşmek dokuları gerektirir. Hücre yoğunluğu da bağlıdıryavruların sayısı kurban ve böylece yavruların tutarlı sayı her zaman muhafaza etmek önemlidir. DRG nöronlarının, böylece mitotik durdurucu, FDU-U, gliyal hücrelerinin büyümesini bastırmak için 1 DIV kültür ortamına ilave edilir birlikte izole edilmiş glial hücreler de vardır. Bazı protokoller arabinofuranosylcytidine (AraC) ve FDU-U bir kombinasyonu tercih ancak bu genel olarak, nöronlardan erken bir büyüme süresi içinde, glial hücreleri inhibe etmek için kullanılır. Kültür izole hücre yoğunluğuna bağlı olarak, farklı protokoller değişir için FDU-U molar konsantrasyonu ilave edildi. Biz tüm DRG kültürü sırasında, (glial hücreler varsa) gerektiği gibi mitotik inhibitörü, (adım 3.3 belirtilen konsantrasyonda), birden çok kez eklenebilir bulundu. Genellikle Darbelere DRG nöronlarının eki beri herhangi bir zamanda büyük miktarda (en fazla 15 ul) eklemek için tavsiye edilmez. Plazma işleme Surfac artırıraksonlar eki başlatmak için e hidrofiliklik ve PLL kaplama bir ücret yüzey sağlar. Literatürde referanslara göre, plazma tedavisi kaynaklı hidrofiliklik kuru şartlarda 16-17 altında, zamanla azaltacaktır. Ancak PDMS sıvı koşullar altında su ile yavaş reaksiyonuna maruz ve yavaş yavaş hidrofilik 18&#39;e hidrofobik olan değişecektir. Plazma tedavisi zamanla zayıflar, bu nedenle olsa bile, bu bizim sonuçlarını etkilememelidir. uygun koşullarda yerleştirilir eğer PLL kaplama, tedarikçiden ürün bilgilerine göre, yıllar içinde stabildir. Hücreler PLL kaplama üzerine takmak sonra, genellikle ayırmak olmaz. Ayrıca, PLL kaplama ilk eki ile yardımcı olur ve hücreler daha onlara yardım Ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri salgılayan büyüdükçe yüzeye 19 demirlemiş kalması. Gelecek tasarım geliştirmeleri PD içine peptitler Imbedding içerebilirPlazma tedavi ve PLL kaplama adımlarını ortadan kaldıracak çapraz bağlanma sırasında MS ağı. protokol, burada başarılı akson hizalama, büyüme ve miyelinasyonun ikna etmek için yüzey anizotropi oluşturulan bir mühendislik yaklaşımı tanımlamıştır. yaklaşım deneysel iki şekilde genişletilebilir. İlk olarak, anizotropik yüzey kültürleri sinir dokuları oluşturmak için uygulanabilir, in vitro sinir yolları daha sonra in vivo olarak transplante edilebilir. İkinci olarak, yüzey anizotropi kavramı konak SC&#39;ler yaralanma site ve miyelinasyon gelen rejenere akson uyum geliştirmek için in vivo kullanılabilecek transplante iskelelerinin tasarım içine dahil edilebilir. Birden fazla ve karmaşık cihazlar 20-22 yanı sıra büyüme faktörlerinin eklenmesini gerektiren diğer yöntemlere göre, bizim platformu nispeten basit ve kolay uygulanabilir ve her iki akson ali geliştirmek için sadece önceden streç dayanırbüyüme faktörü eklenmesine gerek kalmadan gnment ve miyelinasyon. Ayrıca biz kolayca diğer hücre tiplerine uygulanabilecek hem MSC ve DRG nöronlarının deneysel tasarım ön streç bu kavramı test ettik. Geçerli tasarım cihazı 3-dimenstional hücre kültürlerinin test sağlamak için yükseltilmiş olabilir ancak gelecekte, 2 boyutlu yüzeyler üzerinde akson büyümesini araştırmak için kullanıldı. Sinir onarımı ve transplantasyon Gelecek uygulamalar kontrollü salımlı ilaç özellikleri ile birlikte çapraz peptidler içeren biyobozunur doğal veya sentetik malzemelerden yapılmış transplante iskeleleri içine önceden streç dahil olabilir.

Sinir yaralanmalarının ise, yakın ve uzak sinir kütükleri çoğu zaman lezyon yerinde 1-2 sinir liflerinin direkt yeniden düzenlenmesi engellenir. Normalde, akson yolları bağlantı karmaşık ağlar oluşturan aksonların çok düzenli ve uyumlu demetleri, oluşmaktadır. Ancak, sinir rejenerasyonu kötü organize akson hizalama 3-4 dolayı kaotik bir süreçtir. Bu nedenle, lezyon yerinin köprü aksonlar rejenere yeterli bir sayı üretmek için, iyi organize aksonal hizalanma yaratmak için de gereklidir. Ayrıca, demiyelinizasyon yaralanma yerinde myelinating hücrelerin ölümüne bağlı sinir yaralanmaları eşlik eder. Demiyelinizasyon kuvvetle aksonlar hayatta iletken kapasitesini bozar yana, demiyelinizasyon hedefleme veya yeniden miyelin oluşumunu teşvik tedaviler sinir hasarı 5 sonra fonksiyonel iyileşme için önemlidir. Dolayısıyla, bu protokolün amacı, bu iki konuyu ele alan bir mühendislik yaklaşımı göstermektirSinir rejenerasyon. Bir malzemenin fiziksel ve mekanik özellikleri, farklı eksenler boyunca ölçüldüğünde, bir fark olarak tanımlanan yüzey anizotropi, hücre hizalama, büyüme ve taşıma 6-7 etkilemek için uygulanmaktadır. topografya ek olarak, anizotropi indükleme için diğer yöntemler bulunmaktadır. Daha önce, poli-dimetil-siloksan (PDMS) membranın mekanik statik ön streç neden olduğu yüzey anizotropi incelenmiştir. &quot;Büyük uygulanan küçük deformasyon süper&quot; teorisi hücreleri gerilmiş yönde anlamda etkili bir sertliği dik yönde farklıdır tahmin ve etkin sertlikteki bu fark anizotropi 8 yüzey kaynaklanmaktadır. Önceden gerilmiş PDMS zar üzerinde kültürlenmiş mezenkimal kök hücreler (MSC&#39;ler) aktif yüzeyi çekerek ve bunun sonucu olarak anizotropiye duyu önceden gerilmiş yönde 9 hizalamak edebiliyoruz. Benzer şekilde, anizotropik yüzey armekanik ön-gerilmiş yüzeyinden ising sırt kök gangliyonu hizalamasını yanı sıra büyüme ve miyelinasyonun (DRG) 10 aksonlar etkiler. Burada akson rejenerasyonu 10 artırmak için statik bir önceden gerilmiş PDMS substrat yüzey anizotropi uyarılması için bir protokol sağlar. Akson hizalama, istenilen desenleri ile topolojik özellikleri ortaya çıkarmak için, hizalanmış lifleri ve kanallar 6,11-12 ile temas rehberlik sağlamak için rapor, akson hizalama 11,13 kolaylaştırmak için ortaya konmuştur. Ancak, bu tür lifleri, kanallar ve desen olarak topolojik özellikler aracılığıyla akson hizalama uyarılması için teknikler bildirdi uzatmak ve akson kalınlığını artırmak için koyamadık. Tersine, mekanik kademeli bir esneme 14 büyüklüğü arttı daha uzun ve daha kalın akson streç yönünde akson hizalama yol germe. Bununla birlikte, in vivo koşullarında, bir çalışan motorlu cihazı içeren değildirmümkün. Bunun aksine, statik önceden gerilmiş neden anizotropi daha az karmaşık ve daha kolay bir şekilde in vivo uygulamalar için gelecekteki iskele tasarımlar içine dahil edilebilir. Bu protokol, statik önceden gerilmiş hücre kültür sistemi topolojik özellikler olmadan yüzey anizotropi indüklemek için kullanılır. Membran çerçevesi üzerine sabitlenir ve önceden tespit edilmiş bir germe büyüklüğü germe aşaması uygulanır, bunun üzerine önceden gerilmiş kültür sistemi, PDMS zar, bir gerilebilir çerçeve ve bir germe aşamasında oluşmaktadır. 21 güne kadar önceden gerilmiş yüzünde kültür taze izole DRG nöronları akson hizalama ve kalınlık için izlenir. Daha sonra, Schwann hücreleri (SCS) miyelinasyon izlenir hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlendi. Ön streç kaynaklı yüzey anizotropi birleşmeyle biz MSC ve DRG nöronlarının sırasıyla 9-10, hücre hizalama farklılaşma ve akson hizalama büyümeyi artırmak başardık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane &#65288;PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium 1X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax-I 100X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax-I</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>11020-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor-7S</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13290-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-2 deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPE</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone chamber</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>FlexiPERM ConA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaning/etching system</td>
			<td>March Instruments</td>
			<td>PX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy 1.1 antibody</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>M7898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Complement</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 &#956;l of NGF-- 7S (50 ug/ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDU and Uridine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>then divide in 1 ml aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an approach to enhance alignment and myelination of dorsal root ganglion neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Önceden gerilmiş hücre kültür sistemi DRG akson hizalama 10 terfi. DRG nöronları için 12 gün önceden gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerine kültürlenmiştir. Aksonlar hizalarını göstermek için β-III-tubulin boyandı. 2 Kültür 12 gün sonra önceden gerilmiş gerek gerilmemiş PDMS yüzeylerde akson yönünü karşılaştırır Şekil. rastgele uyum gösterdi ve gerilmemiş PDMS substrat üzerinde birbirine bağlı bir ağ kurdu ise DRG aksonlar, gergin doğrultusuna paralel olarak hizalanmış. akson hizalama indükleyici ilave olarak, ön-germe ile indüklenen anizotropi akson fasikülasyon geliştirilmiş. Bağlı aksonal ağdan farklı gerilmiş yüzey oluşturduğu aksonal demetleri üzerinde hizalanmış aksonlar, gerilmemiş yüzeyde gözlemledik. önceden gerilmiş yüzey üzerinde bu fasikül demetleri sinir doku tr benziyordudavranırsa vivo. Şekil 3 kültürün 21 gün sonra önceden gerilmiş ve gerilmemiş yüzeylerde DRG nöronların aksonları gösterir. Şekil 3 de gösterildiği gibi, bir araya toplanmış, önceden gerilmiş alt-tabaka üzerindeki aksonlardan fasikül yolları için benzer bulunmuştur demetleri oluşturmak üzere. Bu ön-gerilmiş bir yüzey sinir dokusunun rejenerasyonu sağlamak önemlidir ön germe yönünde geniş akson büyümesini teşvik etmek mümkün olduğuna işaret ediyor. miyelinasyonun değerlendirmek için, SCs hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlenmiştir. 2 hafta boyunca gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde DRG nöronlarını kültürlendikten sonra arıtılmış, SC&#39;ler bölmeye ilave edilmiş ve bir hafta için kültüre. Şekil 4&#39;te, eş-kültür aksonlar β-III-tubulin (yeşil) ile boyandı ve SC&#39;ler P0 (kırmızı) ile boyanır. P0 olgun AVM bir belirtecidir ve aynı zamanda miyelin kılıf bir bileşenidir,yanı sıra miyelinasyonun bir göstergesi olarak kabul. gerilmiş yüzeyinde aksonlar takılarak SC&#39;ler düşündüren, ama yeşil ve kırmızı leke rastgele dağıtılır gerilmemiş yüzeyinde önceden gerilmiş bir yüzeye, yeşil ve kırmızı önemli bir birlikte yeri vardır. önceden gerilmiş yüzeyler akson hizalama, fasiküler benzeri sistem oluşumunu ve rejenere aksonlar SC&#39;ler tutunmasını, miyelinasyon için tüm kritik geliştirilmiş. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54085/54085fig1.jpg" /> Şekil 1:. Ön streç Prosedür için şematik (a) PDMS membran bir parça kayabilir olan çerçevenin iki şerit üzerine kırpılır. Cihazın çerçeve yaklaşık 7 &quot;x 5&quot; dir; parantez yaklaşık 5 olan &quot;x 1; parantez üzerinde kelepçeler ile ilgili 3&quot; x 0,25 &quot;ve fincan yaklaşık 1.5&quot; çapında geniş üstü açık, 1 &quot;açık alt ve yaklaşık 0.25 &amp; #34; uzun boylu. (B), germe sahneye çerçevesini yerleştirin% 10 uzama uygulamak için silindiri çevirin, sonra vidaları sıkarak şeritlerin konumlarını düzeltin. (C) germe aşamasından çerçeveyi çıkarın ve membran üzerine bir silikon odasını takın. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54085/54085fig2.jpg" /> Önceden gerilmiş gerek gerilmemiş Yüzeyde Axon Hizalama 12 gün (B) gerilmemiş yüzeyine serpildi DRG hücreleri ile karşılaştırıldığında, 12 gün için, (a) sabit, önceden gerilmiş bir yüzey üzerine ekildi DRG nöronlarının, Floresan fotoğraflar Şekil 2,.. aksonlar gerilmemiş kontrol yüzeyinde rastgele hizalanmış ise aksonlar, önceden gerili yönde hizalanır. aksons anti-fare β-III tubulin primer antikor ile boyanmış, ve 10X objektif kullanılarak konfokal mikroskop ile görüntülendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54085/54085fig3.jpg" /> Şekil 3: Akson Kalınlığı Büyüme vs Gerilmiş uzatılmamış PDMS Yüzey (a) gergin ve (b) gerilmemiş yüzeyler 21 gün sonra DRG akson Faz kontrastlı görüntüler.. gerilmemiş yüzeyde aksonlar inter-connected aksonal ağı oluşturmuştur ise gergin yüzeyde aksonlar, kalın demetler kurdu. Görüntüler 10X objektif kullanılarak ters çevrilmiş faz kontrast mikroskobu kullanılarak alınmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig3large.jpg" target="_blank">Al görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın Arger sürümü. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54085/54085fig4.jpg" /> Şekil 4:., Gerilmemiş PDMS Yüzeyler genel Gerilmiş hizalanmış DRG Aksonlar sahip SC&#39;ler birlikte kültür 2 hafta içinde gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde kültürlendikten sonra arıtılmış, SC&#39;ler bölmeye ilave edilmiş ve bir hafta için kültüre. Gerilmiş yüzeyinde akson (a) β-III-tubulin (yeşil) boyama; (B) β-III-tubulin Yerleşimi (yeşil) gergin yüzeyde, P0 (kırmızı) boyama; Gerilmemiş yüzeyinde akson (c) β-III-tubulin (yeşil) boyama; Β-III-tubulin (yeşil), (d) paylaşımlı gerilmemiş yüzeyi üzerinde, P0 (kırmızı) boyama. önceden gerilmiş yüzeyde, kırmızı ve yeşil lekeler colocalize, düşündüren AVM&#39;ler bağlı ve büyük olasılıkla aksonlar myelinating vardır. gerilmemiş üzerindeYüzey, kırmızı ve yeşil lekeler rasgele aksonlar bağlı değildir SC&#39;ler öne dağıtılır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

an-approach-to-enhance-alignment-myelination-dorsal-root-ganglion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K Görüntüleme.  Michigan State University. This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Video: An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Nörobilim

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Lomber Dorsal kök gangliyon erişim ve domuz yerleştirmeye laminotomy

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...