Bu çalışma Christopher ve Dana Reeve Vakfı, Tıbbi Araştırma Konseyi, Avrupa Araştırma Konseyi ECMneuro ve Cambridge NHMRC Biyomedikal Araştırma Merkezi tarafından finansal olarak desteklenmiştir. Biz çekimler sırasında kendi teknik yardım için Heleen Merel van &#39;t Spijker ve Justyna Barratt için en derin şükranlarımı istiyoruz. Biz AAV üretiminde yardımcı olmak için Doktor Elizabeth Moloney ve Profesör Joost Verhaagen (Nörobilim Hollanda Enstitüsü) teşekkür etmek istiyorum.

Tüm aşağıdaki hayvan prosedürleri Britanya Hayvanlar uyarınca (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 bu işlemler aşina değilse yürütülmüştür, ulusal / yerel yönetmeliklere kontrol etmek ve protokol başlamadan önce veteriner başvurunuz. 1. Hayvanların bir Uygun Gerinim Seçimi NOT: duyum ve pençe deafferentasyonu kaybına Bir dorsal kök ezilme yaralanması sonucu. Forepaw deafferentasyonu yaygın yan etkileri aşırı tımar, kendine zarar ve pençe autotomy içerebilir. <ol><li> prosedür için hayvanları alın. Not: Sıçanlarda, bu gibi Lister Hooded-ve Wistar daha fazla aktif suşları, örneğin Lewis ve Sprague-Dawley olarak daha uysal suşlar ile karşılaştırıldığında deaferentasyon sonra pençe Kendi kendini daha yüksek bir oranda olması. Mümkünse, en uysal gerginlik Lewis, her zaman ilk düşünülmelidir. özellikle etkin soyu genetik m deney için gerekli olması halindeodification veya belirli davranışsal değerlendirme gereksinimleri, veteriner tedavi beklenen olumsuz etkilere yönelik yerinde olmalıdır. </li></ol> 2. Enjeksiyon için virüs hazırlanması DİKKAT: Biyolojik ve laboratuar güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak tüm virüsleri ele alın. <ol><li> Seyreltik veya / ml tek virüs paketleme protokolleri 9 Aşağıdaki 2 x 10 ila 12 genom kopyası (GC) bir titresine virüsü konsantre edilir. Not: Burada, virüs% 5 sükroz ile Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS) içinde seyreltildi. titresi virüs promoteri tipine bağlı olarak optimize edilmiş olması boyutunu oluşturmak ve hücre tipi hedef olabilir. </li><li> İsteğe bağlı: Daha sonra enjeksiyon kolay görüntülenmesi için virüs çözeltisine 1% renkli boya (örneğin Hızlı Yeşil) ekleyin. çok nazikçe çözüm karıştırın. </li><li> (4 saat içinde) hemen kullanım için buz üzerinde çözüm tutun veya uzun bir -80 ° C dondurucu içindevadeli depolama. </li></ol> 3. Hayvan ameliyat öncesi hazırlık yapılması NOT: cerrahinin aşırı invaziv nedeniyle, aseptik teknikler her zaman kullanılmalıdır. <ol><li> Hazırlayın ve ameliyat başlamadan önce tüm cerrahi aletler ve spinal stereotaksik çerçeve sterilize. Örneğin, 134 ° C&#39;de bir otoklav içinde araçları sterilize edin. Her hayvan için sterilize araçları bir dizi yeni kullanın. </li><li> hayvan anestezisi. geri çekme refleksi için ya da göz kapağı refleksi için kornea dokunarak test etmek için pençe kısma doğru anesthetization teyit edin. <ol><li> örneğin izofluran olarak inhalasyon anestezisi kullanılarak yetişkin sıçan için 2.0 L% 4 izofluran kullanımı / indüksiyonu için oksijen dak. aşırı veya yetersiz doz önlemek için hayvanın solunum desenine göre izofluran konsantrasyonunun değiştirilmesi, 1.5 L / oksijen dakika içinde% 3 izofluran - ameliyat boyunca muhafaza edilmesi için, 2 kullanımı. </li></ol></li><li> üzerindeHayvan başlangıçta anestezi ce hayvanın ameliyat öncesi ağırlığı kaydedin. </li><li> Servikal DRG enjeksiyon için, skapula hemen distalinde için kulakları arasından boyun kürk traş. Bir antiseptik ürün ile traş bölgeyi dezenfekte edin. </li><li> Uygun bir analjeziğin dozu (örneğin, 5 mg / kg karprofen) ve antibiyotik (örneğin, 5 mg / kg enrofloksasin) ile birlikte, hayvan kanadında tuzlu su deri altından 2 mL enjekte edilir. </li><li> İşlem sırasında kornea kurumasını önlemek için her iki göze göz merhemi sürün. </li><li> hayvan altına yerleştirilmiş, 37 ° C&#39;de bir ısıtma yastığı ile bir omurga stereotaksik çerçeveye ameliyat geçin. </li></ol> 4. DRG enjekte ve Dorsal Kök Ezilme Yaralanması Sahne NOT: Bu son derece hassas bir ameliyat. Hayvan ameliyatı yaşamak ilerlemeden önce anatomi tanımak için ilk önce birkaç ölü hayvan üzerinde pratik tavsiye edilir. <ol><li> Locate cilt üzerinde belirgin C2 ve T2 spinöz işlemler. Bir no.10 bisturi bıçağı (deri açıldıktan sonra, beyaz bir lifli doku orta hat kas birinci katman üzerinde görünür olmalıdır C2 ve T2 sinirsel uzantılar arasında bir cilt insizyonu olun, kas birinci tabaka bir &quot; ) doku, &quot;jel benzeri. </li><li> Bir neşter bıçak kullanarak beyaz orta hat boyunca kas ilk katman üzerinde benzer boyutlu bir kesi olun. Orada yakınında bulunan inen aorttan büyük arter dalı olmadığı için, belirgin T2 sinirsel uzantı ötesine gitme. NOT: Ağır kanama itibaren bu adımı her yerde oluşabilir. Her zaman kanamayı durdurmak ve her zaman açıkça görüntülenmesini sağlamak için sterilize pamuk tomurcukları veya cerrahi emilebilen süngerler kullanarak kan kaldırın. prosedürün devam etmek, &quot;körlemesine&quot; sonradan hayvanda beklenmeyen advers etkilere yol açarak omurilik, DRG veya dorsal kök istenmeyen hasarlara yol açabilir. </li><li> geri çekmekİki retraktör, bir rostral yerleştirilir ve bir kaudal kullanılarak kas birinci tabaka; kas ikinci tabakası, çizgili bir görünümü olan, görünür olmalıdır. </li><li> (Iki uzunlamasına kas ince zar doku ile bağlantılı gözlemlenebilir) kas ikinci tabakanın orta hat bulun. iki uzunlamasına kas ayırmak için microscissors çifti kullanılarak zar doku inceleyin. Bu gereksiz kas hasarı ve kanama neden olabileceğinden, bir neşter bıçak mümkünse kullanmaktan kaçının. </li><li> omurga kaplayan ince kas üçüncü tabakasını açığa çıkarmak için uygun şekilde Ekartörleri ayarlayın. sinirsel uzantıların hafifçe kas üçüncü tabakası üzerine bir çift forseps ile dokunularak hissedilebilir. </li><li> microscissors kullanarak kas üçüncü katman üzerinde küçük bir kesi olun ve yavaşça açıkça omurga ortaya çıkarmak için bir Yandan şekilde küret veya neşter kullanılarak kemikten kas kazıyın. Gerekirse, Lami yapmak uzakta kas veya tendon bazı kestinectomy kolaylaştırır. </li><li> C8 DRG&#39;ler C4 üzerinde sol hemi-laminektomi gerçekleştirmek - - sol C5 göstermek için dikkatli bir şekilde bir tabakanın bir bölümünün ortadan kaldırılması ve pedikül ince rongeurs bir çift kullanarak T1 omurun. DRG vertebranın enine foramen yakınında yer almaktadır. NOT: C3 - C7 omurları önemli bir spinöz prosesi yok. C5 DRG C4 ve C5 omurlar arasında yer alan C8 DRG C7 ve T1 vertebralar arasında iken, C6-DRG, böylece C5 ve C6 vertebralar arasında, ve. bir C8 omur bir C8 DRG varlığında ve bir C8 omurilik segmenti rağmen vardır. </li><li> DRG kadar enjeksiyon için maruz kaldıktan sonra, stereotaksik şırınga tutucuya ısmarlama, 33-gauge küt iğneye sahip virüs doldurulmuş mikrolitre şırınga yerleştirerek şırıngayı hazırlar. enjeksiyondan önce, enjeksiyon iğnesinin sokulmasından yardımcı olmak üzere, hedeflenen DRG her bir yüzeyel açıklığı yapmak için bir 30-gauge şevli iğne kullanın. </li><li> 33 g yerleştirinstereotaksik koordinatları ayarlamak için hafifçe düğmeleri çevirerek DRG merkezine auge iğne. Bu sıvı DRG ventral taraftan dışarı sızmasına neden olabileceğinden, iğne aşırı sokmayın. Meydana hemen iğnenin konumunu ayarlamak sızdırma. NOT: sayısal stereotaksik koordinatlar kullanılmaz; ancak, enjeksiyon için iğne tutmak için çerçeve kullanmak yararlıdır. </li><li> bir infüzyon şırınga pompası kullanılarak 0.2 uL / ​​dakika, her DRG virüsün 1 uL enjekte edilir. iğne çekilmeden önce üç dakika daha bekleyin. virüs çözümü renkli bir boya içeriyorsa Enjeksiyon sırasında, DRG yavaşça rengi değişir. </li><li> Eş zamanlı bir C5 gerçekleştirmek için - C8 dorsal kök ezilme yaralanması, her bir kök 10 sn için üç kez ezmeye her biri kullanılarak tamamen forseps uçlarına karşı ince uçlu forseps (Bonn Mikro), bir çift; dokuda beyaz çizgi ezilme yerinde görünmelidir. Forc ile gerekli daha derine gitmeBu şekilde eps, ventral kök hasara neden olabilir. </li><li> Enjeksiyon ve / veya ezilme takiben, kanama veya hayvan yukarı kapatmadan önce kesi yerinde sol kemik parçalarının küçük parçalar olduğundan emin olun. Tercih edilmesi durumunda, maruz omurilik ve DRG üstünde cerrahi emilebilen sünger küçük bir parça koyun. </li><li> kasının üçüncü tabaka dikiş olmadan omurga üzerine doğal olarak geri toplanmasını sağlayınız. Gevşek olarak, ikinci tabaka üzerinde iki uzunlamasına kas emilebilir 6-0 sütür malzemesi (≈ 3 sütür kesilmiş) dikin. emilebilir 6-0 sütür malzemesi ile kas birinci tabaka (≈ 5 sütür kesintiye) dikin. </li><li> emilebilir 5-0 sütür malzemesi ile deri (≈ 10 dikiş kesilmiş) dikin. NOT: dikişler çok sıkı olmadığından emin olun. Cildin Şişkin aşırı sıkma bir işaretidir ve hayvana rahatsızlık verebilir. </li><li> yoğun kanama ameliyat sırasında meydana gelmesi halinde, deri altından enjekte 1-2yerel yönetmeliklere göre izin verilen salin ml hayvandan sıvı kaybını önlemek için. </li><li> yenilebilir nemlendirici jel sağlar ve tutma alanına geri hayvan dönmeden önce en az 1 saat boyunca normal izleme yapılması, hayvan anesteziden bütünüyle geri izin verir. </li><li> duyu aksonu rejenerasyon değerlendirmek için en uygun transgen ifadesi için en az 3 hafta süreyle hayvan tutun. </li></ol> Hayvan 5. Sahne Ameliyat sonrası bakım <ol><li> ilk hafta sonrası ameliyat sırasında hayvan için yiyecek püre ve yumuşak pamuklu yatak sağlayın. Gerekirse, yerel / ulusal düzenlemelere ve veteriner tavsiyesi doğrultusunda iyileşme ile yardımcı olmak için analjezik ve antibiyotik ilave dozları uygulama. </li><li> 10 gün - 7 sonra ciltte dikiş çıkarın. NOT: Ameliyattan yaygın yan etkileri, kesi yerinde seroma veya hematom oluşumunu kapsar nedeniyle sebep olduğu kaşıntı için ciltte iz çizikİç emilebilir dikişlerle, ince duyusal veya lokomosyon açıkları ve dorsal kök ezilme yaralanması sonrası deafferented pençe üzerinde kendini yaralama işaretler. esasen beklenenden daha şiddetli herhangi refah sorunları için acil veteriner başvurun. </li></ol> 6. Aksonal İzleme için bir İleriye CTB Enjeksiyonu Sahne NOT: doku koleksiyonuna bir hafta önceden izleme kolera toksini B alt birimi (CTB) aksonal gerçekleştirmek için tavsiye edilir. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre% 1 CTB çözeltisi hazırlayın. </li><li> İsteğe bağlı: Daha sonra, enjeksiyon kolay görülmesi için çözeltiye% 1 renkli boya ekleyin. çok nazikçe çözüm karıştırın. </li><li> hayvan anestezisi (adım 3.2.1) ve tabloya ekstremite bantlama, sol forepaw kararlı hale getirir. </li><li> El ve yavaş yavaş deri altından tüysüz ayak tabanı merkezine% 1 CTB 1 uL enjekte dört basamaklı bir mikrolitre şırınga monte wi kullanılarakısmarlama, 33-geyçlik iğne th. NOT: Enjeksiyon önce, ilk enjeksiyon iğne yerleştirilmesi konusunda yardımcı ciltte küçük yüzeysel açılışını yapmak için 30-gauge eğimli iğne kullanmak için yardımcı olur. </li><li> hayvan bekleme salonuna hayvan dönmeden önce anestezi tamamen kurtarmak için izin verin. </li></ol> 7. Toplama Doku <ol><li> İmmünohistokimya için, virüs enjekte DRG ve omurilik toplamak için, anestezi aşırı dozda uygulanması ve transkardiyal soğuk% 4 paraformaldehid, ardından fosfat tamponlu tuzlu su ile hayvan serpmek. Dikkatle mikroskop altında sabit doku toplamak omurga üzerinde tam laminektomi gerçekleştirmek. Analiz 4, 5, 6 için gerekli olan doku terkibi, kesit ve işleme devam edin. Not: s varlığı ile gözlendi olarak elde yara yeri, açıkça görüleceğiaraba dokusu. </li><li> Alternatif olarak, in vitro kültür için virüs enjekte DRG toplamak için, örneğin, karbon dioksit, bir yükselen konsantrasyonu olarak, uygun bir yöntem ile insani hayvan kurban. Dikkatle mümkün olduğunca aseptik koşullar sağlanması mikroskop altında DRG teşrih. 10, 6, 5, 4, istenen doku kültürü ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rat+forepaw+function+in+two+models+of+cervical+dorsal+root+injury.">Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury.</a> J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).</li><li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases.">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).</li><li>Cheah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+Activated+Integrin+Promotes+Long-Distance+Sensory+Axon+Regeneration+in+the+Spinal+Cord.">Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord.</a> J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).</li><li>Andrews, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha9+integrin+promotes+neurite+outgrowth+on+tenascin-C+and+enhances+sensory+axon+regeneration.">Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration.</a> J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).</li><li>Tan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-1+enhances+axon+growth+on+inhibitory+chondroitin+sulfate+proteoglycans+and+promotes+sensory+axon+regeneration.">Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration.</a> J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).</li><li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+adeno-associated+virus+(AAV)+and+recombinant+AAV+vectors.">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).</li><li>Mason, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+AAV+serotypes+for+gene+delivery+to+dorsal+root+ganglion+neurons.">Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons.</a> Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).</li><li>Hermens, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+by+iodixanol+gradient+ultracentrifugation+allows+rapid+and+reproducible+preparation+of+vector+stocks+for+gene+transfer+in+the+nervous+system.">Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).</li><li>Kappagantula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neu3+sialidase-mediated+ganglioside+conversion+is+necessary+for+axon+regeneration+and+is+blocked+in+CNS+axons.">Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons.</a> J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).</li><li>Alto, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+facilitates+axonal+regeneration+and+synapse+formation+after+spinal+cord+injury.">Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).</li><li>Bonner, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafted+neural+progenitors+integrate+and+restore+synaptic+connectivity+across+the+injured+spinal+cord.">Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord.</a> J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+restoration+of+sensory+function+by+immediate+or+delayed+systemic+artemin+after+dorsal+root+injury.">Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury.</a> Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).</li><li>Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemin+promotes+functional+long-distance+axonal+regeneration+to+the+brainstem+after+dorsal+root+crush.">Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).</li><li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice.">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).</li><li>Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+intraperitoneal+or+intravenous+injections+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+8+transduce+dorsal+root+ganglia+and+lower+motor+neurons.">Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons.</a> Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).</li><li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+adeno-associated+virus+mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture.">Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31 (2010).</li><li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+novel+adeno-associated+virus+(AAV)+vector+that+crosses+the+seizure-compromised+blood-brain+barrier+(BBB).">Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB).</a> Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).</li><li>Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+ATF3+or+the+combination+of+ATF3,+c-Jun,+STAT3+and+Smad1+promotes+regeneration+of+the+central+axon+branch+of+sensory+neurons+but+without+synergistic+effects.">Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects.</a> Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).</li></ol>

James Fawcett is a paid consultant for Acorda Therapeutics and Novartis.

Bu makalede, bir yetişkin farenin alt servikal spinal kord bir DRG enjeksiyon ve dorsal kök ezilme yaralanması gerçekleştirmek için adım adım kılavuzu mevcut. Bu son derece invaziv ve hassas cerrahi olduğu için, şiddetle tüm potansiyel kullanıcılar hayvan ameliyatı yaşamaya ilerlemeden önce yeterli eğitim ve uygulama elde öneririz. Kullanıcıların omurilik anatomisi ile değil, aynı zamanda çevredeki kas dokularının, omurga kemik yapısı ve damar sistemine sahip sadece aşina olmalıdır. İdeal olarak, yetkili bir kullanıcının omuriliğe zarar indüklemeden omurların bir bölümünün ortadan kaldırılması ile temiz bir laminektomi gerçekleştirilmesi, çevre dokulara en az hasar ile işlemi gerçekleştirmek mümkün olmalıdır. omurilik yaralanması belirgin olarak, omurilikteki küçük lezyon tüm sinir sistemi için yaygın bir zararlı bir etkiye sahip olabilir. Buna ek olarak, bir &quot;temiz&quot; ameliyat geçiren hayvanlar beklenmedik Direk- muzdarip olasılığı daha düşüktürameliyat komplikasyonları ve sosyal sorunlar ve bu nedenle arzu edilen deneysel zaman noktasından önce kurban edilmesi için daha az muhtemeldir. 15 intravenöz, intraperitoneal 16, intratekal 17 veya doğrudan enjeksiyon hedef 4, 8 içine: sinir sistemi içine virüsü yönetmek için bir uygulama birkaç olası yolları vardır. Damar içi ve intraperitoneal enjeksiyonlar nispeten invazif olmayan bir olmasına rağmen, kan-beyin bariyerinin kesişme bir sorun 18 olabilir ve bu rotalar özel bir akson rejenerasyonunun çalışmasında yararlı olmayacaktır spesifik olmayan transdüksiyon ile sonuçlanır. Benzer şekilde, subaraknoid boşluk, daha istilacı yönetim rotasına, zar içi enjeksiyon için, CNS içindeki çoğu nöronal ve nöronal olmayan hücre tipleri, potansiyel olarak spesifik olmayan ya da off-targe üretilmesi, dönüşüm yoluylat etkileri. Böylece, DRG içine virüsün doğrudan enjeksiyon olumlu seçenek ve diğer yöntemlere göre çok daha yüksek transdüksiyon etkisi sonuçlanması muhtemeldir. Bu seçeneğin en büyük dezavantajı ise uzman eğitim gerektirir cerrahi prosedür, bir invazivlik olduğunu. Kullanıcıların gerekli cerrahi beceri hakim olması, bu protokol esneklik büyük miktarda sunuyor. Toplanan dokular anatomik analiz veya doku kültürü 4 için de kullanılabilir sırasında bir akson rejenerasyonunun çalışmada, hayvanlar, örneğin, in vivo elektrofizyoloji ve duyusal-motor davranış testleri gibi diğer teknikler ile kombine olarak yapılabilir. Çeşitli deneysel zaman noktaları ile, bu tekniklerin bir kombinasyonu, örneğin, ezilme yaralanması 4 sonra dejenerasyonu ya da NF200, CGRP ve IB4 olarak farklı lif alt-tipleri, yenilenme ilerlemesini incelemek için kullanılabilir. Deneysel requireme bağlıNTS, bir ya da sunulan prosedürler diğer tek başına gerçekleştirilebilir. yalnız dorsal kök ezilme yaralanması ön pençe Deafferentasyon gereklidir herhangi çalışmalarda kullanılabilecek Örneğin, tek başına DRG enjeksiyon, aksonal izleme deneyleri için de kullanılabilir. Buna ek olarak, kullanıcılar virüsü ve enjeksiyon için, transgen ürünün tipi değişebilir, tam DRG enjekte edilir ve tam olarak dorsal kök hasarı için gereken. Mevcut ise, DRG içine hücre transplantasyonu, ya farmakolojik uygulama da bu protokolü kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca omurilik fonksiyonunu 5 incelemek için, 19 veya dorsal kolon ezilme yaralanması - (hindlimb fonksiyonunu değerlendirmek için L5 L3 içine örneğin) edinilen cerrahi becerilerin üzerine kurulan deneyimli bir kullanıcı, bel bölgesinde DRG enjeksiyon gibi diğer tekniklerle geçebilirsiniz. Sonuç olarak, DRG enjeksiyon ve dorsal kök ezilme yaralanması duyusal akson reg incelemek için yararlı bir model olduğuna inandığımızeneration. invaziv cerrahi işlem gerçekleştirmek için özelleşmiş eğitim için gerekliliğe rağmen, protokol esnektir ve potansiyel kullanıcıların deneysel gereksinimlerini karşılamak için birçok parça değiştirebilir. Bu prosedürler, duyu aksonu yenileme çalışmaları için uygun bir hayvan modeli arama için bir temel olarak hizmet edebilir.

Sinir sistemi yaralanması sonrası akson rejenerasyonunu sağlanması zor bir iştir 1&#39;dir. Merkezi sinir sisteminde (MSS) akson rejenerasyon başarısızlığını incelemek için araştırmacılar sinir yaralanması modelleri bir bolluk kullandık. MSS bölgeler farklı olarak, akson rejenerasyon çalışması için anatomik uygun modeli kullanmak önemlidir. Uygun bir model kullanarak, araştırmacılar, &quot;tek için tüm&quot; tedavi stratejisi karşıt olarak, yaralanma şiddetine, ilgili nöronal hücre tipine göre belirli bir tedavi ve rejenerasyon değerlendirmek için arzu edilen spinal kanal formüle edebilir. omurilik yaralanması, örneğin, en zayıflatıcı semptomlar duyu ve hareket kaybı kaynaklanıyor. lokomosyon kaybı inen motor yolların hasar sonucu ise duyu kaybı, artan duyusal yolların hasar kaynaklanır. Nedeniyle bu tw arasındaki hücresel ve anatomik farklılıklarao yolları, birçok hedef akson rejenerasyonu çalışmaları sadece birinin başarılı kurtarma hastalara muazzam fayda olacağını gerekçe ile, bir ya da diğer yoluna odaklanmak. Bu makalede, bir viral vektör ve duyu aksonu rejenerasyonu araştırmak için bir model olarak bir yetişkin farenin alt servikal spinal kord eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanması ile direkt arka kök gangliyon (DRG) enjeksiyon kullanan bir protokol mevcut. DRG duyu nöronları CNS&#39;ye çevresinden, Dokunma duyusu ve ağrı gibi duyusal bilgilerin geçişi için sorumludur. omurilikte duyusal nöronların uzun akson çıkıntıların uzun mesafe akson rejenerasyonunu çalışmak için iyi bir model olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, kemirgenler bu tür minimal refah komplikasyonlu bir dorsal kök ezilme yaralanması gibi bir duyusal yol lezyonu yaşayabilir olarak, araştırmacılar tamamen omuriliği lezyon oluşturmak gerek kalmadan MSS akson rejenerasyon çalışması olabilir. Dörtlü C5 - C8 (servikal level 5-8) dorsal kök ezilme yaralanması ön pençe deaferentasyon 2 için yararlı bir model olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bir dorsal kök ezilme yaralanması böyle glial skar oluşumu gibi diğer faktörler tarafından -komplikasyonsuz çünkü doğrudan omurilik yaralanması daha akson rejenerasyonu incelemek için &quot;daha temiz&quot; modelini sağlamaktadır. Bir rejeneratif duruma nöronların yeniden programlamak için, viral gen terapisinin kullanımı giderek daha çok nörolojik durumlar 3 için umut verici bir tedavi stratejisi olarak kabul edilmiştir. Çalışmalar davranışsal iyileşme 4, 5, 6, sağlam akson rejenerasyonunu elde edebilirsiniz büyümeyi teşvik edici bir protein transgeni taşıyan bir adeno-bağlantılı virüs (AW) vektörü uygulanmasını göstermiştir. bir bağışıklık yanıtı ve nöronlar gibi bölünmeyen hücreleri transdüse yeteneğini ortaya çıkarmak AAV&#39;nin belirgin düşük patojenik yapmakBu gen terapisi için uygun vektör. Buna ek olarak, rekombinant AAV bir şekilde tedavisi için kullanılır. Bu formda, bu, konakçı genomu 7 içine viral genomu entegre gibi lentivirüs gibi diğer viral vektörler ile karşılaştırıldığında girmeyle mutagenez riski azaltmanın kabiliyetine sahip değildir. Bu AAV gen tedavisi uygulamaları için güvenli bir seçim yapar. bir DRG duyu nöronlarının hücre kütleleri içeri olarak, çalışma ve / veya duyu aksonu rejenerasyonunu teşvik etmek gen terapisi için virüsün tatbik için en uygun anatomik bir hedeftir. Kodlayan farklı AAV serotip ve lentivirüs karşılaştıran bir çalışmada, AAV serotip 5 (AAV5) DRG 8 enjekte edilmesi halinde, en az 12 haftalık bir süre boyunca DRG nöronlarını transdüse edilmesinde en etkili olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, AAV gibi büyük çaplı nörofilaman 200 kDa olarak tüm DRG nöronal alt tipleri, iletici fazla% 40 dönüşüm verimliliğini elde edebilirsiniz(NF200) pozitif nöronların küçük çaplı kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) - ya da isolectin b4 (IB4) pozitif nöronların 4, 8. DRG enjeksiyonu ve dorsal kök ezilme yaralanması cerrahi prosedür olarak son derece invaziv ve narin, biz bu makalede, yeni kullanıcıların çok verimli bir şekilde prosedürünü öğrenmek için yardımcı olacağına inanıyoruz. C8 dorsal kök ezilme yaralanması - eşzamanlı C5 C7 DRG&#39;ler - Bu yazıda, yetişkin dört hafta C6 bir kontrol virüsü AAV5-GFP (yeşil floresan protein) enjeksiyonundan sonra farelerde temsil edici sonuçlar göstermektedir. Bu model, duyu aksonu rejenerasyonunu teşvik etmek için, viral gen terapisinin kullanımı soruşturma araştırmacılar için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1%</td></tr><tr><td>Cholera Toxin B subunit</td><td>List Biological Laboratories</td><td>104</td><td>For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane)</td></tr><tr><td>Baytril 2.5% injectable</td><td>Bayer</td><td>05032756093017</td><td>Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer&#039;s recommended dosage: 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Carprieve 5.0% w/v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer&#039;s recommended dosage: 4 mg/kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>Eye ointment</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11083-07</td><td>For performing dorsal root crush injury</td></tr><tr><td>Tissue Separating Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Goldstein Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors (straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>For bleeding control</td></tr><tr><td>Microliter Syringe RN701 (10 &amp;mu;L)</td><td>Hamilton</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made Removable Needle (for DRG injection)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 38 mm, point style 3</td></tr><tr><td>Custom-made Removable Needle (for CTB injection)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 10 mm, point style 3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

dorsal root ganglion injection and dorsal root crush injury as a model for sensory axon regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

bir temsili olarak, bağlı DRG enine bir omurilik bölümü C7 doğrudan, DRG nöronlarını transduse ve dört hafta kontrol virüsü, AAV5-GFP enjekte sonra omurilikte duyu aksonları izleme bu protokol etkinliğini göstermek için sunulmaktadır dorsal kök ezilme yaralanması (Şekil 1A) olmadan DRG. Sırt kolon ve omurilik dorsal boynuzu hem de Aksonlar GFP (Şekil 1B), hem de enjekte DRG (Şekil 1C) içinde hücre gövdeleri ve aksonlar ifade eder. Kama şeklinde çekirdeğin ek anatomik analizi, beyin sapı duyu aksonu terminali, pozitif anterograd CTB (Şekil 1D) izleme ortaya koymaktadır. DRG enjeksiyon tam bir C5-C8 dorsal kök ezilme yaralanması olan eşzamanlı gerçekleştirildiğinde, omurilik ya da CTB-pozitif terminalde GFP pozitif aksonlarkama şeklinde çekirdeğe s (Şekil 2A) gözlenir. Ancak, axotomized duyusal aksonlar hala ama ötesinde omurilik 4, 5 (Şekil 2A) içine, bir PNS ortamdır tamamen ezilmiş dorsal kökü, dorsal kök giriş bölgesi kadar yenileyebilir belirtmekte fayda olduğunu. Enjekte virüs büyüme potansiyeli olan bir destekleyici proteinin transgen içerir durumunda, omurilikte etiketli aksonların mevcudiyeti rejenerasyon ya da eksik bir dorsal kök ezilme yaralanması (Şekil 2B) ya da temsil edebilir. Bu iki çıktıları arasında ayrımcılık için, cuneate çekirdeğinde CTB aksonal izleme analiz edilmelidir. CTB-pozitif terminaller yokluğu yeniden akson omuriliğe kısmi rejenerasyon, anlaşılacağı ise kama şeklinde çekirdekte CTB-pozitif terminaller varlığı, tam olmayan yaralanma (Şekil 2C) olasılığını vurgulamaktadırcuneate çekirdeği (Şekil 2B) ulaşmak için tüm mesafeyi büyümeye muhtemeldir mümkün değildir. Bugüne kadar, kama şeklinde çekirdeğe başarılı duyu aksonu yenilenmesi çoğunlukla yüksek servikal yaralanması 11, 12 ya da nörotrofinlerin 13, 14 uygulama ile vakalarda bildirilmiştir. Eksik yaralanma belirtileri gösteren herhangi bir hayvan akson rejenerasyon çalışmalarının dışında tutulmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55535/55535fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir Dorsal Kök ezilme yaralanması olmaksızın DRG Enjeksiyon. (AC) dört hafta AAV5-GFP enjeksiyonundan sonra DRG (C) &#39;de, sırt kolon ve dorsal boynuzu (B) ve hücre gövdeleri içeren omurilikteki GFP pozitif aksonlar (A) gösteren Omurilik bölümü. &lt;kama şeklinde çekirdeğin güçlü&gt; (D) CTB-pozitif duyusal akson terminalleri CTB enjeksiyonun bir hafta ardından. Ölçek çubuğu 650 um (AC) ve 250 um (D) &#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55535/55535fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55535/55535fig2.jpg" /> Şekil 2: Dorsal Kök Yaralanma ve Axon Rejenerasyon Crush değerlendirilmesi. (A), kama şeklinde çekirdeğinde omurilik veya CTB-pozitif akson terminallerinde bir etiketli aksonlarda tam bir dorsal kök ezilme yaralanması sonucu. Axotomized duyusal aksonlar ama ötesinde omurilik içine, dorsal kök giriş bölgesi kadar yeniden oluşturabilirsiniz. (BH) omurilikte etiketli aksonların mevcudiyeti eksik yaralanma veya regenerati herhangi birini temsil eder(B). Bunların yokluğu omurilik (D) içine tam yaralanma ve potansiyel olarak kısmi rejenerasyon anlaşılacağı ise ek analizi ile, kama şeklinde çekirdekte CTB-pozitif terminaller varlığı, tam olmayan yaralanma (C) göstermektedir. ölçek çubuğu 250 um&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55535/55535fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration at JoVE.com

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

dorsal-root-ganglion-injection-dorsal-root-crush-injury-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.7K Görüntüleme.  University of Cambridge. This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Video: Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Nörobilim

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biyomühendislik

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of communication with the brain. One of the goals of our research is to promote axon regeneration to restore connectivity across the lesion site. To accomplish this we developed a peripheral nerve (PN) grafting technique where segments of sciatic nerve are either placed directly between the damaged ends of the spinal cord or are used to form a bridge across the lesion. There are several advantages to this approach compared to transplantation of other neural tissues; regenerating axons can be directed towards a specific target area, the number and source of regenerating axons is easily determined by tracing techniques, the graft can be used for electrophysiological experiments to measure functional recovery associated with axons in the graft, and it is possible to use an autologous nerve to reduce the possibility of graft rejection. In our lab we have performed both autologous (donor and recipient are the same animal) and heterologous (donor and recipient are different animals) grafts with comparable results. This approach has been used successfully in both acute and chronic injury situations. Regenerated axons that reach the distal end of the PN graft often fail to extend back into the spinal cord, so we use microinjections of chondroitinase to degrade inhibitory molecules associated with the scar tissue surrounding the area of SCI. At the same time we have found that providing exogenous growth and trophic molecules encourages longer distance axonal regrowth into the spinal cord. Several months after transplantation we perform a variety of anatomical, behavioral and electrophysiological tests to evaluate the recovery of function in our spinal cord injured animals. This experimental approach has been used successfully in several spinal cord injury models, at different levels of injury and in different species (mouse, rat and cat). Importantly, the peripheral nerve grafting approach is effective in promoting regeneration by acute and chronically injured neurons.

Traumatic injury to the spinal cord disrupts communication with the brain. To restore lost connectivity we utilize a peripheral nerve graft to provide a substratum for regenerating fibers in combination with neurotrophic factors and matrix-modulating enzymes to remove inhibitory molecules to promote long distance growth.

Periferik Sinir Aşılama ve Matrix Modülasyon birleştiren Yaralı Rat Spinal Kord Onarım

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

Biyoloji

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Tıp

Sheath-Preserving Optic Nerve Transection in Rats to Assess Axon Regeneration and Interventions Targeting the Retinal Ganglion Cell Axon

Retinal ganglion cell (RGC) axons converge at the optic nerve head to convey visual information from the retina to the brain. Pathologies such as glaucoma, trauma, and ischemic optic neuropathies injure RGC axons, disrupt transmission of visual stimuli, and cause vision loss. Animal models simulating RGC axon injury include optic nerve crush and transection paradigms. Each of these models has inherent advantages and disadvantages. An optic nerve crush is generally less severe than a transection and can be used to assay axon regeneration across the lesion site. However, differences in crush force and duration can affect tissue responses, resulting in variable reproducibility and lesion completeness. With optic nerve transection, there is a severe and reproducible injury that completely lesions all axons. However, transecting the optic nerve dramatically alters the blood brain barrier by violating the optic nerve sheath, exposing the optic nerve to the peripheral environment. Moreover, regeneration beyond a transection site cannot be assessed without reapposing the cut nerve ends. Furthermore, distinct degenerative changes and cellular pathways are activated by either a crush or transection injury.
The method described here incorporates the advantages of both optic nerve crush and transection models while mitigating the disadvantages. Hydrostatic pressure delivered into the optic nerve by microinjection completely transects the optic nerve while maintaining the integrity of the optic nerve sheath. The transected optic nerve ends are reapposed to allow for axon regeneration assays. A potential limitation of this method is the inability to visualize the complete transection, a potential source of variability. However, visual confirmation that the visible portion of the optic nerve has been transected is indicative of a complete optic nerve transection with 90-95% success. This method could be applied to assess axon regeneration promoting strategies in a transection model or investigate interventions that target the axonal compartments.

This protocol describes an optic nerve transection that preserves the optic nerve sheath in rats. Hydrostatic pressure from microinjections into the optic nerve generate a complete transection, allowing for sutureless reapposition of the transected optic nerve ends and direct targeting of the axonal compartment in a transection model.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler