This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

1. SU8 Ana Fabrikasyon <ol><li> tasarım yazılımı kullanarak üç katmanlı imalat için mikroakışkan yapıları tasarlamak ve 10 mikron çözünürlükte devre kartı film üzerine bir satıcı tarafından basılan tasarımları var. Cihaz tasarımı detayları ekli referans 6&#39;da verilmiştir ve kanal geometrileri, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Katmanlar, her imalat tabaka 8&#39;den özellikleri yan yana koymak yardımcı hizalama işaretleri içermelidir. </li><li> spin kaplayıcı bir ön temizliği 3 inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 80 um bir tabaka kalınlığına sağlayan 1,750 rpm&#39;de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır. </li><li> gofret çıkarın ve 30 dakika süre ile 135 ° C sıcak plaka üzerinde pişirilir. gofret sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Bir paralel 190 m altında 1. katman maskesine kaplı gofret Açığa3 dakika için LED mil W, 365. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 1 dakika boyunca oda sonra serin bir 135 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 40 um&#39;lik bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka ile sonuçlanan, 5,000 rpm&#39;de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın. </li><li> 1.3 desenli geometri üzerine 2. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 4 dakika 30 saniye boyunca 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin. </li><li> Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. daha sonra, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde 30 SU8-3050 1 ml uygulamasan 1000 rpm&#39;de, 100 um bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka elde edilir. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın. </li><li> 1.3 desenli geometri üzerine 3. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 9 dakika süreyle 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin. </li><li> 30 dakika boyunca, propilen glikol monometil eter asetat içinde karıştırılan bir banyoda daldırarak maskeleri geliştirir. 1 dakika için 135 ° C bir sıcak plaka üzerindeki izopropanol ve fırında gofret yıkayın. polidimetilsiloksan (PDMS) kalıplama için 100 mm Petri kabındaki geliştirilen usta yerleştirin. </li></ol> 2. PDMS Cihaz İmalatı <ol><li> plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g silikon taban 50 g birleştirerek 1 PDMS: 10 hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir döner aracı ile içeriğini karıştırın. deg30 dakika boyunca bir desikatör içinde karışım olarak veya tüm hava kabarcıkları bertaraf kadar devam eder. </li><li> Master üzerinde 3 mm kalınlığında vermek ve daha fazla gaz alma için desikatörde geri yerleştirmek için PDMS dökün. Bir kez tüm kabarcıklar kaldırılır, 80 dakika boyunca 80 ° C &#39;de cihaz fırında. </li><li> desenli tarafı ile temiz bir yüzey üzerinde bir neşter ve yer kullanarak kalıp cihazı kesin ve 0.75 mm&#39;lik biyopsi yumruk ile akışkan giriş ve çıkış yumruk. 120 mikron ve 220 mikron boyunda geometrileri cihazın yan erişilebilir, böylece cihaz kesmek gerekir. </li><li> Plazma 300 W plazma temizleyici 20 saniye boyunca 1 mbar O 2 plazmada 3 inç cam slayt tarafından önceden temizlenmiş 2 inç ile birlikte yukarı özelliği tarafı, cihazı davranın. cam slayt plazma ile işlenmiş yüzüne PDMS cihazın desenli tarafını yerleştirerek PDMS cihaz Bond. 80 ° C sıcaklıkta fırında Cihazı ve 40 dakika boyunca monte edilmiş cihazın fırında. </li><li> kanal Renderflorlanmış bir yüzey işleme sıvısı ile cihaz temizlemek için bir şırınga kullanılarak hidrofobik. 10 dakika çözücünün buharlaşması için hemen 80 ° C&#39;de cihazı fırında. </li></ol> Optik Bileşenleri 3. hazırlanması <ol><li> 105 mikron çekirdek, 125 mikron kaplama son 5 mm yalıtımı kaldırarak lazer uyarma lif hazırlayın, NA 0.22 fiber optik =. </li><li> Bir 2. özdeş elyaf için 3.1 tekrarlayarak 2. renkli lazer uyarma fiber hazırlayın. </li><li> 200 mikron çekirdek, 225 mikron kaplama için 3.1 yineleyerek floresan sinyalini toplamak için fiber hazırlayın, NA 0.39 fiber optik =. </li><li> ipuçları düz bir yüzeye sona yoksa, bir lif çubukla uçları yeniden tutunmaya - tüm liflerin ipuçlarını inceleyin. </li><li> 50 mW, 405 nm lazer lazer fiber bağlayıcı takın ve lazer 105 mikron çekirdek liflerinin birini ekleyin. Lazer gücünün sensörüne elimden ucunu yönlendirinmetre ve lazer gücünü maksimize etmek lazer coupler ince ayar kullanın. </li><li> 50 mW, 473 nm lazer için 3.5 tekrarlayın. </li><li> Lazer ışığı bloke ve yayılan floresan iletmek için objektif tüpleri kullanarak PMT bir 446/510/581/703 nm dört band geçiren filtreler monte edin. o ışık PMT isabet önce filtreler üzerinden geçecek, böylece fiber kuplörünü takın. </li><li> 3.7 toplandı birimine 3.3 ile fiber takın. </li></ol> 4. Çevrim karıştırılmış bir emülsiyon Üretim <ol><li> 60 mm x 60 mm delik bir akış odak Mikroakiskan dropmaker cihazı edinin. </li><li> % 2 iyonik fluorosurfactant 9 HFE 7500 yağlar ile 1 ml şırınga doldurun. </li><li> 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM: floresein aşağıdaki birleşimleri (FITC) ve dekstran-konjuge mavi boyalar PBS (CB) 1 ml şırınga bir dizi doldurun CB, ve 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> ters MICROS sahnede dropmaker cihaz montebaş ve şırınga pompalarında sulu ve yağlı şırınga. Çift PE-2 boru kullanan cihazlar için şırınga. </li><li> 500 ul / sulu çözeltiler için bir yağ, 250 ul / saat saat sonra şırınga pompaları çalıştıran, 4.3 çözümler içeren 80 um damlacıkların bir karışım oluşturmak. Sulu örneğin her türü için, çapraz bulaşmayı önlemek için yeni bir dropmaker cihazı kullanın. Boş şırıngaya Her bir boya kombinasyonu emülsiyon ~ 200 ul toplayın. </li><li> 4 damlacıklar türleri tek bir koleksiyon şırınga içinde toplanmıştır sonra, defalarca şırınga çevirerek emülsiyonu karıştırın. </li><li> Tekrar sulu çözeltiler, PBS içinde 0.1, 1, 10 ve 100 nM FITC içeren 4.2-4.6 adımları tekrarlayın. </li></ol> 5. Fiber Optik Ekleme <ol><li> &lt;100 mikro-saniye deklanşör hızları yeteneğine sahip dijital kamera ile birleştiğinde ters bir mikroskop sahnede 2. adımda imal mikroakışkan çip yerleştirin. </li><li> yan, INSE dikkatle ÇalışmaAna akış kanalı aracılığıyla ponksiyon özen uzak yukarı 120 mikron kanalı içine 473 nm lazer bağlanmış lif rt. </li><li> , Uzak aşağı 120 mikron yüksek yan kanalı içine 405 nm lazer bağlanmış lif eklemek 300 mikron fiber boşluk sağlar. </li><li> iki lazer uyarım lifleri normal 220 mikron boyunda kanala PMT-birleştiğinde lif yerleştirin. </li></ol> Karışık Emülsiyonlar 6. Floresan Algılama <ol><li> PE-2 boru ile bir algılama cihazı aralayıcı yağı girişine% 2 iyonik fluorosurfactant HFE 7500 dolu bir 5 ml şırıngaya monte edin. </li><li> PE-2 boru kullanılarak cihazın damlacık reenjeksiyon girişine bir dikey olarak yönlendirilmiş şırınga pompa ve çift karışık FITC / CB emülsiyonu içeren şırınga monte edin. atık konteynerine cihaz çıkışından PE-2 boru uzunluğu bağlayın. </li><li> Her iki kadar 1.000 ul / saatte pompaların her çalıştırarak Başbakan cihazYağ ve damlacıkları düzenli cihazda birleştiren ve aşağı akan görülmektedir. </li><li> algılama bölgeye seyahat damlacıklar arasında önemli bir boşluk sağlar boşluk yağı 6.000 ul / saat hızında çalışır şekilde debileri ve 100 ul / saatte damlacıklarını ayarlayın. </li><li> , Lazerler açmak veri toplama programını başlatın ve bazal gürültü zemin 100x daha vardır sinyalleri sağlamak için PMT kazancı ayarlayın. duble zirveleri tek bir doğrusal ölçekli timetrace üzerinde açıkça görülebilir şekilde lazer gücünü ayarlayın. </li><li> en az 20 kHz PMT gerilim timetrace 60 saniye kazanır. Böyle Matlab olarak bilgisayar programına veri almak ve özel bilgisayar programı komut kullanılarak kaydedilen çifti zirvelerinden yükseklikleri ölçülür. Not: Bu ilave bilgi olarak verilmektedir. </li><li> Tekrarlayın 405 nm lazer kapalı olan, 4,7 oluşturulan FITC sadece karışık emülsiyon kullanılarak 6.2-6.7 adımları. </li></ol>

<ol>
	<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics.">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li><li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li><li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution.">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR.">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics.">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li><li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+droplet-based,+optofluidic+device+for+high-throughput,+quantitative+bioanalysis.">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li><li>. Lithography Available from: <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015)</li><li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis:+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants.">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li><li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution.">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops.">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li><li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer.">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li><li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis.">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li><li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides.">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li><li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching.">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Fiber optik algılama akışkan kanal ile ilgili olarak, optik fiberlerin hizalanmasını gerektirir. Bizim cihaz çok tabakalı fotolitografiyle imal kılavuz kanalları kullandığından, birbirlerine göre olan maske yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Fiber kılavuz kanallar sıvı kanala çok yakın ise, sıvı sızması için bir potansiyel var; kılavuz kanallar çok uzakta bulunan ya da hizadan ise, algılama fiber tarafından toplanan floresan sinyali önemli ölçüde azalabilir. Tam hizalama fotoğraf desen sırasında birlikte bulunduğu için maskeler bu tür konsantrik daireler olarak hizalama işaretlerini, tasarlayarak destekli olabilir. Ayrıca, cihazın içine fiber optik manuel yerleştirme kullanılamaz onları render cihaz içinde liflerin ipuçları kırmaya potansiyeline sahip hassas bir süreçtir. Mikroskop ile gözlemlerken tuşları olan PDMS cihazına bağlanmış cam slayt karşı lif kısıtlama ve yavaş yavaş lifleri ekleyerek SUCC içinessful lif ekleme. önceden oluşturulmuş emülsiyonların Son yeniden enjeksiyon işleme minimum gerçekleşmelidir. emülsiyon hazırlanmadan ve boş şırınga içine doğrudan bırakıldığı, bir kez damlacık tekrar enjeksiyon için kullanılan kadar İdeal olarak, bu transfer olmamalıdır. Çok renkli algılama sinyal duble içinde zirveleri birbirlerinden ve ardışık damlacıkların gelen sinyaller üst üste olmadığını farklı olmasını gerektirir. Burada kullanımı algılama ayarları uyarım bölgeler arasında ~ 175 um ışıksız bölge temin 300 um bir merkez-merkez mesafede ayrılan 125 um, optik elyafın bir çift kullanır. Bu 80 um damla aynı anda yalnızca tek bir ışık kaynağı tarafından uyarılan sağlar ve dubletin piklerin her sadece lazer uyarma bir tipinin bir sonucu olduğunu garanti eder. uyarma bölgeler arasındaki ayrım damlacık çapı benzer Tasarımlar emisyon tepe çiftleri üst üste sorunlu sinyallerini veriyor. To çiftli final uyarma bölgesini içinde ~ 500 mikron mesafe bırakmak için zaman damlacık arka kenarını ilk uyarım bölgeleri girmek için bir damlacık ön kenarına için gereken süre ilişkilendirir bir sinyalin genişliği cihaz biz tarif. Bitişik tespit damlacıkların farklılığı korumak için, sinyal ikili sinyal duble en az kadar geniş bir düşük sinyal bölgeye göre aralıklı olması gerekir. Burada açıklanan yapılandırma için, 80 mikron damlacıkları birbirinden en az 1 mm aralıklı. Tek bir fotodetektör ile çok renkli algılama maliyet ve standart tekniklere göre karmaşıklık açısından önemli tasarruflar için izin verse yayılan ışık dalga boyu tarafından filtre değil çünkü, sağlamlık bazı kaybı vardır. floresan kaynağı ayırt edilemez, çünkü aynı dalga boylarında heyecanlandırmak birden fluorophores ihtiva damlacıklar tespit ettiğinde bu sorunlu olabilir. Bu sınırlamalar overc olabilirörtüşmeyen uyarma profilleri ile deneyler yaparak, ya da hassas bir tahlil yapılmaktadır bir &quot;kanal&quot; olarak oluşmaz üzerinde kanamaya spektral deneyleri tasarlayarak ome. Bu parlak bir arka boyası bir damlacık varlığını belirtmek için kullanılan bir çok damlacık mikroakışkan algılama uygulamaları ile uyumlu, ve bir ikinci fluorofor moleküler biyoloji tahlilinde 10,11 sonucunu bildirmek için kullanılır. 1) mekansal kayıtlı uyarma bölgeleri karmaşık ışık filtreleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve fiber optik 2) kullanımı doğrudan ışığa mikroskop ve optik donanım ihtiyaçlarını kaldırır: standart tekniklere göre, bizim yaklaşımımız iki ana avantajı vardır. Biz mikroakışkan algılama sistemleri ile ortak teknik kaygılarını, çünkü daha önceki araştırmacılar benzer endişeleri gidermek için yöntemler geliştirmişlerdir. Örneğin, Martini ve ark. Frekans kodlamak çok renkli floresan kaydedildibenzersiz desenli &quot;barkod&quot; aracılığıyla bir uyarım kaynağı yansıtarak, tek bir detektör ile 12 filtreler. fiber optik dizinin Bizim kullanılması raf bileşenleri kapalı standardını kullanarak benzer bir zamansal kodlama şemasının kullanımı, izin verir. Literatür daha biz tarif basit lif ekleme kontrollü optik sayıda optik bağlantı teknikleri gösterir. Uyarma ışık 14 ve Vishnubhatla ark sunmak için erimiş silika yüzeyler kazınmış Bliss ve ark. Martinez Vasquez ve arkadaşları belirli mikrokanal yerleri 13, ışık titizlikle kontrol dağıtımı ve toplanması için sıvı dolu optik dalga kılavuzları kullanın. Kullanın dalgakılavuzları lazer. Vardır tam 15 gravür, lazer ışınlama ve kimyasal bir arada kullanarak elyaf ekleme kanalları imal etmek mümkün. Bu tekniklerin her biri, bir microfl taban akışkan mimarisi imal etmek için kullanılan ötesinde ek adımlar gerektirmezuidic çip. Bu üretim işlemleri çok hassas algılama uygulamaları için gerekli olmakla birlikte, bir kalıplanmış PDMS kanalı içine elyaf ekleme laboratuarımızda, günlük uygulama için en uygun olduğunu bulduk. algılama sistemi ~ 17.000 florofor moleküllerinin tespiti kabaca eşdeğer, 80 mikron damlacıklar halinde 100 pm&#39;den aşağı FITC konsantrasyonlarını tespit etmeyi başardı. Bu duyarlılık, şu anda 10 6 florofor moleküllerinin 11 eşdeğeri içeren tahlil pozitif damlacıkların hücre sıralama PCR aktif hale En yaygın olan bir Epifloresans tabanlı bir sistem kullanılarak laboratuvarımızda en algılama uygulamaları için yeterlidir. Algılama hassasiyeti yakın zamanda diğer fiber optik tabanlı sistemlerin hassasiyetlerini bildirilen olumlu karşılaştırır - örneğin, o&gt; 100 mikron damlacıklar 7 rapor Alexa Fluor 488 20 nM algılama sınırından daha 200x daha duyarlıdır. We daha pahalı, karmaşık ve hantal Epifloresans mikroskop tabanlı sistemlerine alternatif olarak kompakt ve modüler damlacık mikroakışkan çok renkli algılama düzeni sundu. Burada kullanılan gerekli algılama bileşenleri (lazerler, lifler, lif adaptörler, filtre ve PMT) çoklu algılama istasyonları göze bireysel araştırmacılara araştırmacılar çok sayıda çoklu renk damlacık algılama erişilebilir hale ve izin &lt;10.000 $ için satın alınabilir bir laboratuarda. yakınlık derecesi bir Epifloresans mikroskop ile birlikte serbest uzay optik sistemleri hizalamak için gerekli olan sistem aynı zamanda, giriş bazı uzmanlık tabanlı engelleri kaldırmak. Ayrıca tespitler kurulum küçük ayak izi bu ideal taşınabilir ve teşhis uygulamaları için uygun hale getirir.

Damlacık Mikroakiskan bir taşıyıcı yağ 1 içinde süspansiyon haline sulu damlacıkların çok sayıda deney bölümlere yüksek verimli biyoloji için bir platform sağlar. Damlacıklar tek bir hücre analizi 2, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 3 gibi çeşitli uygulamalarda kullanılan ve evrim 4 enzim edilmiştir. Parlak sinyaller ve hızlı zaman yanıtı kilohertz oranlarında alt nanoliter damlacık hacimleri tespit uyumlu olarak Floresan tahlilleri, damlacık Mikroakiskan için algılama standart modu bulunmaktadır. Birçok uygulama, aynı anda en az iki renk için floresans algılama gerektirir. Örneğin, bizim laboratuar yaygın bir tahlil sonucu için bir algılama kanalı kullanmak damlacık sıralama deneyleri PCR aktive gerçekleştirir ve 5 tahlil negatif damlacık sayılabilir yapmak için ikincil bir arka plan boya kullanır. damlacık Mikroakiskan için tipik algılama istasyonları ba vardırEpifloresans mikroskoplar üzerinde sed ve numune odaklı olmak mikroskop içine boş alan lazerler uyarma ışık tanıtmak için ışık manipülasyonlar düzenleri karmaşık gerektirir. floresan bir damlacık yayılan sonra her algılama kanalı dalgaboyu bandında merkezli bir photomultiplier tüp (PMT) kullanır, böylece yayılan fluoresced ışık süzülür. Epifloresans mikroskop tabanlı optik algılama sistemleri nedeniyle gider, karmaşıklık girişine bir bariyer sağlar ve bakım gereklidir. Optik fiberler fiberler elle ayna tabanlı ışık yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırarak, ve ışık yolları fiber optik konnektörleri kullanarak arabirim sağlayan mikroakışkan cihazlar eklenebilir çünkü araçlar, basitleştirilmiş ve sağlam algılama düzeni inşa etmek sağlarlar. Bu yazıda, optik fiberler An bir dizi kullanarak çok renkli floresan algılama gerçekleştirmek için kompakt ve modüler bir düzeni montaj ve doğrulama tarifda tek fotodetektör 6. Optik fiberler bağımsız lazer bağlanır ve düzenli mekansal uzaklıklar bir L şeklinde bir akış kanalına dik yerleştirilir. Bir flüoresan toplama fiber uyarım bölgelerine paralel yönlendirilmiş olan ve tek bir PMT bağlanır. Bir damlacık farklı zamanlarda lazer ışınları geçer, çünkü PMT tarafından kaydedilen veriler zamansal kullanıcı damlacık her ayrı lazer ışını tarafından heyecan sonra yayılan floresan ayırt sağlar ofset gösterir. Bu zamansal kayma dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler bir dizi kullanarak ayrı Proje Yönetim Ekipleri yayılan ışık ayırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Dedektörün etkinliğini doğrulamak için, biz farklı renk ve konsantrasyon boyalar encapsulating damlacık popülasyonlarında floresan ölçmek. sistemin duyarlılığı tek renkli floresan saptama için incelenmiş, ve 0.1 nM bir 200x hassasiyet göstr kadar konsantrasyonlarda damlacıklar tespit edilebildiğini gösterirLiteratürde 7 bildirilen son elyaf bazlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında ovement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3035</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y311074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gaugue needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 2 polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc.</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>98-0212-2928-5</td>
			<td>Commonly knowns as HFE 7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Krytox Surfactant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis instructions in ref #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran- conjugated cascade blue dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-1976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMM02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber port</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAFA-X-4-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 um fiber stripping tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T08S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225 um fiber stripping tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T10S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser fiber adapter</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>FC/PC Adapter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm CW laser at 50 mW</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>MDL-III-405</td>
			<td>Distributor for CNI lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473 nm CW laser at 50 mW</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>MLL-FN-473-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor fluorescence detection for droplet microfluidics using optical fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Optik fiberlerin yerleştirilmesi için izin veren bir PDMS cihazın imalatı değişen yükseklik (Şekil 1) kanalları oluşturmak için çok adımlı bir fotolitografi prosedürü gerektirir. İlk olarak, SU-8 80 um boyunda tabaka silikon yonga üzerine bükülmüş ve akışkan geometrisini oluşturmak için bir maske kullanılarak şekillendirilmiştir. Sonraki, SU-8 ek 40 mikron katman gofret üzerine bükülmüş ve 120 mikron boyunda lazer fiber ekleme kanalları oluşturacak özellikleri oluşturmak için ikinci bir maske kullanılarak desenli. Son 100 mikron daha SU-8 gofret üzerine bükülmüş ve 220 mikron boyunda algılama fiber ekleme kanalları vermek için desenli. Ana gelişmiş ve bu da cam bir slayta yapıştırılmış olan bir PDMS cihaz, kalıp için kullanılır. Nihai imalat yan aracılığıyla erişilen cihaz ve 120 um ve 220 mikron boyunda fiber optik kanalları üst açılmış delikler üzerinden erişilen, 80 mikron boyunda akış geometri içerircihazı. Tespiti için kullanılan cihazın geometrisi Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Harici olarak oluşturulan 80 um emülsiyonlar bir damla yeniden enjeksiyon portuna yeniden enjekte edildiği ve bir L şekli algılama kanalına akış önce boşluk yağı ile aralanmıştır. 120 mikron boyunda kanallar akış kanalında ayrı uzaysal noktada uyarılmaya sağlamak içine iki lazer birleştiğinde lifler eklenir. bu kanallar içine yerleştirilir modlu fiberler, bir 125 mikron dış çapa ve 105 um&#39;lik bir çekirdek çapa sahip olduğundan, akış kanalının toplam enine kesiti lazer ışığı ile aydınlatılır. Bizim cihazda algılama akış kanalı yayılan floresan algılamak için kullanılan bir 225 mikron OD elyaf yakın optik erişim oluşturmak için son lazer uyarma bölgesinden sonra ani bir 90 derecelik dönüş yapar. Büyük lif nedeniyle standart bir mikroskop objektif benzer yüksek sayısal açıklık (NA = 0.39), kullanılır. Algılama kanalı boyunca akan bir damlacık lazer bağlanmış optik fiberlerin (Şekil 3A), her birinin önünde ayrı uyarı bölgeleri karşılaşır. Tek PMT haritaları uyarım kaynağına zamansal değişimi ile floresan yayılan algılama fiber kayıtlarına birleştiğinde. 473 nm&#39;de (Şekil 3A&#39;da bölge &quot;1&quot;) de ve 405 nm&#39;de (Şekil 3B&#39;de bölge &quot;2&quot;) de tahrik boyaları içeren bir damlacık için, elde edilen PMT sinyali ile korele tepe ayrılması sahip bir sinyal dublet içeren kez bir uyarım bölgeden diğerine taşımak için bir damlacık alır. Geçici olarak bu şekilde spektral veri kodlama ile, bundan başka bir ışık filtreleme ve her bir flüorofor renk için ayrı Proje Yönetim Ekipleri ihtiyacı ortadan kalkar. Şekil 3B, farklı boya kombinasyonları ile 4 damlacıkların bir tren sinyal çiftleri göstermektedir. çift ​​tekabül ilk zirve&quot;1&quot; Bölgede 473 nm lazer ve ikinci zirve ile uyarma sonrasında yayılan floresan s &quot;2&quot; Bölgede 405 nm lazer ile uyarma sonrasında yayılan floresan gelir. algılama düzeni etkinliği 405 nm&#39;de (dekstran-bağlı, mavi, CB) olarak tahrik ve 473 nm&#39;de (florosein FITC) de boyalar içeren damlacıkların bir karıştırılmış bir emülsiyon tespit test edilmiştir. Damlacıklar kabaca 50 Hz&#39;de algılama bölgelerine akan ve veriler daha sonra bir bilgisayar programı komut post-işlenmiş 60 saniye, kaydedildi. Veri Şekil 4&#39;te çizilen ve dört yeniden enjekte damlacık türleri arasındaki net bir ayrım gösterir. algılama sistemi yayılan ışığın farklı renklerde arasında ayrım yapmaz, çünkü her damlacık 2 (pik 2) (tepe 1) bölge &quot;1&quot; de heyecanlı kaldıktan sonra ve bölgedeki maksimum toplam floresan tarif edilmektedir. (Şekil 5) 405 nm lazer kapatarak ve floresan damlacıklar ihtiva eden bir emülsiyonun floresan ölçüm incelenmiştir. Veriler aynı algılama ayarları ile tek bir dedektör 0.1 ila 100 nM FITC değişir boya konsantrasyonu tespit yeteneğini gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig1.jpg" /> 1. Çok katmanlı fotolitografi rakam. mikroakışkan cihaz üç farklı özellik yükseklikleri ile bir master oluşturarak imal edilir. İlk olarak, SU-8 bir 80 mikron boyunda tabaka üzerinde bükülmüş ve sıvı kanallar için bir maske kullanılarak desenli. Sonraki 40 mikron daha SU-8 bükülmüş ve 120 mikron boyunda özellikler 125 mikron boyunda optik fiberler karşılamak için geometri elde etmek için SU-8 tabakadan hem aracılığıyla 2 ile desenli nd maske vardır. Bundan sonra, 100 mikron daha SU-8 bükülmüş ve 225 mikron boyunda özellikleri elde etmek için bir 3. maskesi ile desenli. Cam, PDMS döküm ve plazma yapıştırma geliştirdikten sonra, ortaya çıkan cihaz standart kapalı akışkan kanallarına ek olarak, lif yerleştirilmesi için taraftan erişilebilir büyük kanalları içerir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig2.jpg" /> Şekil 2. Aygıt tasarımı ve optik düzen. Cihazın akışkan bölümleri, bir L-şekilli kanala birleştirilmiş bir damlacık reinjector ve bir yağ ayırıcı, oluşmaktadır. Bireysel lazerler bağlanmış lifler akış yönüne dik yerleştirilir. Bir algılama fiber flüoresan ışığı toplamak üzere bir lazer liflerine dik yerleştirilir. Bu ışık ab ile süzülürandpass filtre, tek bir PMT tarafından tespit edilmeden önce. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54010/54010fig3.jpg" /> Çok renkli bilgilerin 3. Geçici kodlama rakam. (A), damlalar yayılan ışığın belirlenmesini sağlar zaman değişimi sağlayan, farklı zamanlarda uyarım bölgeleri &quot;1&quot; ve &quot;2&quot; akar. Algılama kanalından akan 4 farklı damlacıkların bir tren (B) veri. Her ikilisinin ilk zirve &quot;1&quot; Bölgedeki uyarma ve &quot;2&quot; Bölgede uyarım sonrasında yayılan floresan her çift tekabül ikinci zirve sonrasında yayılan floresan karşılık gelir. damlacık dorukları yüksekliği de boya heyecanlı miktarını orantılıdırspektral kanama uyarma spektrumları örtüşen boyaların kullanımı nedeniyle meydana dışında, dalga boyu verilen. Piklerin genişliği bir uyarım bölgeyi çapraz bir damlacık geçen süre miktarına göre belirlenir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54010/54010fig4.jpg" /> Karışık damlacık nüfusun 4. Multicolor algılama rakam. Bir 473 nm lazer (pik 1) ile uyarma ve emisyon sonra karışık bir damlacık nüfus için maksimum damlacık yoğunlukları gösteren dağılım çizim ve 405 nm lazer (pik 2). Damlacıkları nM konsantrasyonlarda floresein (FITC) ve kaskad mavi (CB) kombinasyonlarını içermektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig4large.jpg" target="_blank">Bu büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakam. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54010/54010fig5.jpg" /> Çok çeşitli damlacık nüfus 5. Tek renk algılama rakam. Bir 473 nm lazer ile uyarma sonra floresein 0.1-100 nM içeren karışık bir damlacık nüfus tarafından emisyonların histogram. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers at JoVE.com

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Video: Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Biyomühendislik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...