This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

1. SU8 Fabricação Mestre <ol><li> Projetar as estruturas microfluídicos para fabricação de três camadas usando software de design e têm os desenhos impressos por um fornecedor em filme placa de circuito com resolução de 10 m. Os detalhes da concepção do dispositivo são dadas em uma referência em anexo 6 e as geometrias de canal são mostradas na Figura 1. As camadas deverá incluir marcas de alinhamento para ajudar a colocar características de cada camada de fabricação 8. </li><li> Coloque um wafer de silício diâmetro pré-limpeza de 3 polegadas em um revestidor de rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando uma espessura de camada de 80 um. </li><li> Remover a bolacha e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 30 min. Permitir que o wafer arrefecer à RT antes de passar para a próxima etapa. </li><li> Expor o wafer revestido para o st máscara 1 camada sob a colimado 190 mW, LED 365 nm durante 3 minutos. Após a exposição, colocar a pastilha em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 1 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 5000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 40 uM. </li><li> Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa. </li><li> Alinhar a camada de máscara 2 nd para a geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 4 min 30 s, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida, 30segundos a 1000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 100 um. </li><li> Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa. </li><li> Alinhar a camada de máscara 3 rd na geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 9 minutos, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Desenvolver as máscaras por imersão num banho em agitação de acetato de éter propilenoglicol monometílico, durante 30 min. Lava-se a bolacha em isopropanol e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 1 min. Coloque o mestre desenvolvido em uma placa de Petri de 100 mm para polidimetilsiloxano moldagem (PDMS). </li></ol> 2. PDMS fabricação de dispositivos <ol><li> Preparar 10: 1 PDMS pela combinação de 50 g de base de silicone com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa equipada com uma vareta. degmedida que a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas. </li><li> Despeje o PDMS para dar uma espessura de 3 mm sobre o mestre e coloque de volta para o secador durante mais de desgaseificação. Uma vez que todas as bolhas são removidas, o dispositivo de cozer a 80 ° C durante 80 min. </li><li> Cortar o dispositivo a partir do molde utilizando um bisturi e coloque sobre uma superfície limpa com o lado estampado para cima e perfurar as entradas e saídas fluídicos com um soco biópsia 0,75 mm. O dispositivo tem de ser cortado de modo a que os 120 uM e 220 uM geometrias altos são acessíveis a partir do lado do dispositivo. </li><li> Plasma tratar o dispositivo, com o lado recurso acima, juntamente com um pré-limpas 2 polegadas por 3 polegadas lâmina de vidro a 1 mbar O 2 plasma durante 20 segundos em um aspirador de plasma 300 W. Unir o dispositivo de PDMS, colocando o lado modelado do dispositivo PDMS para o lado tratado com plasma da lâmina de vidro. Colocar o dispositivo num forno de 80 ° C e assar o dispositivo montado, durante 40 min. </li><li> Tornar os canaishidrofóbica usando uma seringa para irrigar o dispositivo com um fluido de tratamento de superfície fluorado. Imediatamente cozer o dispositivo a 80 ° C durante 10 minutos para evaporar o solvente. </li></ol> 3. Preparação de componentes ópticos <ol><li> Prepara-se o laser de fibra de excitação através da remoção do isolamento a partir da última 5mm de um núcleo 105 uM, 125 uM de revestimento, NA = 0,22 fibra óptica. </li><li> Prepare a fibra de excitação laser a cores 2 nd repetindo 3.1 para uma fibra idêntica 2º. </li><li> Preparar a fibra de recolha do sinal de fluorescência pela repetição 3,1 para um núcleo de 200 um, 225 uM de revestimento, NA = 0,39 fibra óptica. </li><li> Inspecione as pontas de todas as fibras - se as dicas não terminam em uma superfície plana, re-unir as extremidades com um escriba fibra. </li><li> Anexar um acoplador de fibra de laser a um 50 mW, 405 nm do laser e anexar um dos 105 mm fibras do núcleo para o laser. Direcionar a extremidade descarnada para o sensor da potência do lasermetro, e usar os ajustes finos do acoplador laser para maximizar a potência do laser. </li><li> Repetir para 3,5 nm de um laser de 50 mW, 473. </li><li> Montar uma 446/510/581/703 filtros de banda quad nm na PMT utilizando tubos de lente para bloquear a luz do laser e transmitir fluorescência emitida. Ajustar o engate de fibra de modo que a luz viaja através dos filtros antes de bater a PMT. </li><li> Anexar a fibra de 3,3 a unidade montada em 3.7. </li></ol> 4. offline Mixed Geração Emulsion <ol><li> Obter um dispositivo de microfluidos dropmaker foco de fluxo com um orifício de 60 x 60 mm uM. </li><li> Encha uma seringa de 1 ml com HFE 7500 óleos com 2% fluorado iônica 9. </li><li> Encha uma série de seringas de 1 ml com as seguintes combinações de fluoresceína (FITC) e corantes azul de dextrano conjugado (CB) em PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM de FITC / 10 nM CB, 1 nM de FITC / 100 nM CB, e 10 nM com FITC / 100 nM CB. </li><li> Montar o dispositivo dropmaker no palco de um micros invertidaslidar e as seringas aquosos e óleo sobre bombas de seringa. Casal das seringas para os dispositivos que utilizam tubos PE-2. </li><li> Executando bombas de seringa a 500 mL / h para o óleo e 250 ul / h durante as soluções aquosas, criar uma mistura de 80 uM gotículas contendo as soluções de 4,3. Para cada tipo de amostra aquosa, utilizar um dispositivo dropmaker fresco para eliminar a contaminação cruzada. Recolhe ~ 200 ul de emulsão a partir de cada combinação de corante para uma seringa vazia. </li><li> Após os 4 tipos gotas foram coletadas em uma única seringa coleção, misturar a emulsão girando repetidamente a seringa. </li><li> Repita os passos 4,2-4,6 com soluções aquosas contendo 0,1, 1, 10, e 100 nM com FITC em PBS. </li></ol> 5. Optical Fiber Inserção <ol><li> Coloque o chip microfluídico fabricados no passo 2 no palco de um microscópio invertido acoplado com uma câmera digital capaz de &lt;100 ms velocidades do obturador. </li><li> Trabalhando com cuidado de lado, inseta a fibra acoplado ao laser de 473 nm no montante de 120 canais mais distante mm, tomando cuidado para não perfurar até o canal de fluxo principal. </li><li> Inserir a fibra acoplado ao laser de 405 nm no canal 120 uM alta lado mais distante a jusante, fornecendo o espaçamento da fibra de 300 mm. </li><li> Inserir a fibra PMT-associado no canal 220 uM de altura normal, para as duas fibras de excitação de laser. </li></ol> 6. detecção de fluorescência de emulsões mistas <ol><li> Montar uma seringa de 5 ml cheio com HFE 7500 com 2% de surfactante fluorado iónica à entrada de óleo espaçador do dispositivo de detecção com tubagem PE-2. </li><li> Monte a seringa contendo a emulsão / CB mista FITC em uma bomba de seringa orientado verticalmente e casal a entrada de gota reinjeção do dispositivo utilizando tubagem PE-2. Conectar um comprimento de tubagem PE-2 a partir da saída do dispositivo a um recipiente de resíduos. </li><li> Primeiro o dispositivo rodando cada uma das bombas em 1000 uL / ​​hr até tantoóleo e as gotas são vistos para ser combinando regularmente no dispositivo e de fluxo a jusante. </li><li> Ajustar as taxas de fluxo de modo que o óleo espaçador funciona a 6.000 l / h e as gotas a 100 l / h, proporcionando espaçamento significativa entre gotículas viajam através da região de detecção. </li><li> Ligue os lasers, iniciar o programa de aquisição de dados e ajustar o ganho de PMT para fornecer sinais que são mais de 100 vezes o ruído da linha de base. Ajustar a potência do laser de modo a que todos os picos doublet são claramente visíveis em um único timetrace, linearmente dimensionado. </li><li> Adquirir 60 seg do timetrace tensão PMT em pelo menos 20 kHz. Importe os dados em programa de computação, tais como Matlab e medir as alturas dos picos das dobletes gravados a partir do roteiro de programa de computação personalizado. NOTA: Este é fornecido como informação suplementar. </li><li> Repita os passos de 6,2-6,7 usando o FITC-only emulsão mista criada em 4.7, com o laser de 405 nm desligado. </li></ol>

<ol>
	<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics.">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li><li>Hindson, B. J., Ness, K. 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M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer.">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li><li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis.">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li><li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides.">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li><li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching.">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

detecção de fibra óptica requer o alinhamento das fibras ópticas com respeito a canais de fluido. Uma vez que o nosso dispositivo utiliza canais de guia fabricadas com fotolitografia multicamada, a colocação de máscaras com relação um ao outro é de grande importância. Se os canais de guia de fibra são demasiado perto do canal de fluido, existe um potencial para a fuga de fluido; Se os canais de guia estão localizados muito longe ou desalinhado, o sinal de fluorescência recolhida pela fibra de detecção pode ser significativamente diminuída. alinhamento adequado pode ser auxiliado através da concepção de marcas de alinhamento, tais como círculos concêntricos em máscaras para ser co-localizados durante a padronização da foto. Além disso, a inserção manual das fibras ópticas para dentro do dispositivo é um processo delicado com o potencial para quebrar as pontas das fibras no interior do dispositivo, tornando-os inutilizáveis. Restrição de fibra contra a lâmina de vidro ligado ao dispositivo de PDMS e inserindo as fibras lentamente enquanto se observa com o microscópio são as chaves para succinserção de fibra essful. Por último, a reinjecção de emulsões pré-formadas deve ocorrer com um mínimo de manipulação. Idealmente, uma vez que a emulsão é feita e depositados directamente para uma seringa vazia, não deve ser transferido até ser utilizado para a reinjecção das gotículas. Multicolor detecção exige que os picos de um sinal dupleto ser distintos um do outro e que os sinais de gotas consecutivas não se sobrepõem. A configuração de detecção que usamos aqui usa um par de fibras ópticas 125 uM separadas a uma distância de centro a centro de 300 mm, proporcionando uma zona não iluminada de ~ 175 um entre as regiões de excitação. Isso permite que uma gota de 80 ^ m a ser excitado por uma única fonte de luz de cada vez e garante que cada um dos picos em um dupleto é apenas um resultado de um tipo de excitação laser. Desenhos onde a separação entre as regiões de excitação é semelhante ao diâmetro das gotículas dar sinais de sobreposição dupletos problemáticos com pico de emissão. Tele largura de um sinal dupleto correlaciona-se com o tempo que leva para o bordo dianteiro de uma gota para inserir as primeiras regiões de excitação para o momento em que o bordo de fuga da gotícula de sair da região de excitação final, uma distância de ~ 500 mm na dispositivo que descrevemos. A fim de manter a clareza de gotas detectadas adjacentes, dupletos de sinal têm de ser espaçadas por uma região de sinal de baixo, pelo menos, tão grande como o sinal de dupleto. Para a configuração descrita aqui, 80 uM gotículas são espaçadas de pelo menos 1 mm. Embora a detecção multi-cor com um único fotodetector permite uma economia significativa em termos de custo e complexidade em comparação com técnicas convencionais, existe alguma perda de robustez porque a luz emitida não é filtrada por comprimento de onda. Isto pode ser problemático quando detectar gotículas que contêm vários fluoróforos que excitam nos mesmos comprimentos de onda, porque a fonte de fluorescência é indistinguível. Estas limitações podem ser overcome através da realização de experimentos com perfis de excitação que não se sobrepõem, ou através da concepção de experiências onde spectral sangram mais não ocorre em um &quot;canal&quot; onde um ensaio sensível está sendo realizada. Isto é compatível com aplicações de detecção de microfluidos muitas das gotículas, em que um fundo brilhante corante é usado para indicar a presença de uma gotícula, e um segundo fluoróforo é usado para reportar o resultado de um ensaio de biologia molecular 10,11. Comparado com técnicas padrão, a nossa abordagem tem duas vantagens principais: 1) as regiões de excitação espacialmente registrados eliminam a necessidade de filtragem da luz complicado, e 2) o uso da fibra óptica elimina a necessidade de um microscópio e hardware óptico à luz direta. Porque nós abordar as preocupações técnicas comuns com sistemas de detecção de microfluídicos, os investigadores anteriores desenvolveram métodos para lidar com preocupações semelhantes. Por exemplo, Martini et al. Fluorescência frequência codificar multicolor registradospor um único detector, projetando uma fonte de excitação através excepcionalmente modelado &quot;código de barras&quot; filtra 12. A nossa utilização de uma matriz de fibra óptica permite a utilização de um esquema de codificação temporal análoga usando o padrão, desligar os componentes de prateleira. A literatura mostra várias técnicas de acoplamento ópticos ópticos que são mais controladas que a inserção de fibra simples que descrevemos. Bliss et al. Usar guias de onda óptico com líquidos para a entrega cuidadosamente controlada e recolha de luz a partir de locais de microcanais específicos 13, Martinez Vasquez et al. Usar guias de onda do laser gravado em substratos de sílica fundida para fornecer luz de excitação 14 e Vishnubhatla et al. São capaz de fabricar precisamente canais de inserção de fibra usando uma combinação de irradiação com laser e química gravura 15. Cada uma destas técnicas requerem passos adicionais para além dos utilizados para fabricar a arquitectura fluídica base de um microflchip de uidic. Enquanto pode ser necessária para aplicações de detecção altamente sensíveis estes procedimentos de fabrico, verificou-se que a inserção da fibra em um canal moldado PDMS é adequada para a maioria das aplicações diárias do nosso laboratório. O sistema de detecção foi capaz de detectar concentrações de FITC para baixo para 100 pM em 80 | iM gotículas, mais ou menos equivalente à detecção de ~ 17.000 moléculas de fluoróforo. Esta sensibilidade é adequada para a maioria das aplicações de detecção no nosso laboratório que actualmente utilizam um sistema à base de epifluorescência, o mais comum dos quais sendo PCR-activado separação de células positivas de gotículas de ensaio contendo o equivalente de 10 6 moléculas de fluoróforo 11. A sensibilidade de detecção também se compara favoravelmente com recentemente relatado sensibilidades de outros sistemas à base de fibras ópticas - por exemplo, é 200x mais sensível do que o limite de detecção de 20 nM de Alexa Fluor 488 relatados em&gt; 100 uM gotículas 7. WE têm apresentado um esquema de detecção de gota compacto e modular, de microfluidos de multi-cor como uma alternativa para sistemas baseados em microscópio de epifluorescência mais caros, complexos, e volumosos. Os componentes de detecção necessários usados ​​aqui (lasers, fibras, adaptadores de fibra, filtrar e PMT) podem ser comprados de &lt;US $ 10.000, fazendo a detecção gota multi-cor acessível a um grande número de investigadores, e permitindo que os investigadores individuais de suportar múltiplas estações de detecção num laboratório. O sistema também remover algumas barreiras à base de conhecimentos para a entrada, como é exigido um grau de familiaridade para alinhar os sistemas ópticos de espaço livre em conjunto com um microscópio de epifluorescência. Além disso, o tamanho reduzido da configuração detecções torna ideal para aplicações portáteis e de diagnóstico.

Microfluídica gotículas fornecer uma plataforma em alta biologia rendimento por compartimentar experimentos em um grande número de gotículas aquosas suspensas em uma transportadora de petróleo 1. Gotas têm sido utilizados para aplicações tão variadas como a análise de células individuais 2, reacção em cadeia da polimerase digitais (PCR), 3, e 4 evolução da enzima. ensaios fluorescentes são o modo padrão de detecção para microfluídica gota, como os seus sinais luminosos e tempo de resposta rápido são compatíveis com a detecção de volumes de gotículas sub-nanolitros a taxas kilohertz. Muitas aplicações exigem a detecção de fluorescência de pelo menos duas cores em simultâneo. Por exemplo, o nosso laboratório vulgarmente PCR realiza-activada de gotículas triagem experiências que utilizam um canal de detecção para o resultado de um ensaio, e utiliza um corante de fundo secundário para fazer gota-ensaio negativo contáveis ​​5. estações de detecção típicos para microfluídica gotículas são based em microscópios de epifluorescência, e exigem complicados esquemas de manipulações de luz para introduzir luz de excitação de lasers de espaço livre no microscópio a ser focada na amostra. Depois de fluorescência é emitida a partir de uma gotícula, a luz de fluorescência emitida é filtrada de modo a que cada canal de detecção utiliza um tubo fotomultiplicador (PMT) centrada sobre uma banda de comprimento de onda. sistemas de detecção óptica de epifluorescência baseado em microscópio fornecer uma barreira à entrada devido à sua custa, a complexidade ea manutenção necessária. As fibras ópticas dispõem de meios para construir um esquema de detecção simplificada e robusto, uma vez que as fibras podem ser inseridas manualmente em dispositivos de microfluidos, eliminando a necessidade de encaminhamento de luz à base de espelho, e permitindo caminhos de luz para ser interligado através de conectores de fibra óptica. Neste trabalho, nós descrevemos a montagem e validação de um sistema compacto e modular para realizar detecção de fluorescência multicolor, utilizando uma rede de fibras ópticas de umda fotodetector única 6. As fibras ópticas são acoplados aos lasers individuais e são inseridos normal a um canal de escoamento em forma de L em deslocamentos espaciais regulares. Uma fibra de recolha de fluorescência é orientada paralelamente às regiões de excitação e é ligado a um único PMT. Uma vez que uma gotícula passa através dos feixes de laser em momentos diferentes, os dados registados pelo PMT mostra um deslocamento temporal, que permite ao utilizador fazer a distinção entre a fluorescência emitida após a gotícula é excitada por cada feixe de laser distinta. Este deslocamento temporal, elimina a necessidade de separar a luz emitida PMTs separadas utilizando uma série de espelhos dicróicos e filtros passa-banda. Para validar a eficácia do detector, que quantificar fluorescência em populações de gotículas de encapsulação de corantes de cor diferente e concentração. A sensibilidade do sistema é investigada para detecção de cor única fluoresceína, e mostra a capacidade de detectar gotículas com concentrações de até 0,1 nm, uma sensibilidade impr 200xovement quando comparado a uma fibra baseada recentes relatados na literatura 7.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3035</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y311074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gaugue needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 2 polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc.</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>98-0212-2928-5</td>
			<td>Commonly knowns as HFE 7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Krytox Surfactant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis instructions in ref #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran- conjugated cascade blue dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-1976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMM02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber port</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAFA-X-4-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 um fiber stripping tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T08S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225 um fiber stripping tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T10S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser fiber adapter</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>FC/PC Adapter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm CW laser at 50 mW</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>MDL-III-405</td>
			<td>Distributor for CNI lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473 nm CW laser at 50 mW</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>MLL-FN-473-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor fluorescence detection for droplet microfluidics using optical fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

A fabricação de um dispositivo de PDMS que permite a inserção de fibras ópticas exige um processo de passos múltiplos a fotolitografia para criar canais de altura variável (Figura 1). Em primeiro lugar, uma camada de 80 um de altura de SU-8 é girada sobre uma bolacha de silício e modelado utilizando uma máscara para criar a geometria de manipulação de fluidos. Em seguida, um 40 um camada adicional de SU-8 é girado para a bolacha, e modelado usando uma segunda máscara para criar recursos que formarão 120 mm de altura a laser canais de inserção de fibra. Por último, 100 uM mais SU-8 é girado para a bolacha, e modelado para dar 220 uM de detecção de altura canais de inserção da fibra. O mestre está desenvolvido e utilizado para moldar um dispositivo de PDMS, o que por sua vez está ligado a uma lâmina de vidro. A fabricação final contém 80 pm geometria fluxo alto, acessado através de furos na parte superior do dispositivo e 120 mm e 220 mm canais de fibra óptica altas acessado através do lado dadispositivo. A geometria do dispositivo utilizado para a detecção é mostrado na Figura 2. Externamente gerados 80 uM emulsões são re-injectado numa abertura de queda e espaçadas por reinjecção óleo espaçador antes de fluir para dentro de um canal de detecção em forma de L. são inseridas duas fibras acoplado a laser em 120 uM canais altas proporcionar excitação a localizações espaciais discretas no canal de fluxo. Porque as fibras multimodo inseridos nestes canais têm um diâmetro externo de 125 um e um diâmetro de núcleo de 105 | iM, toda a secção transversal do canal de escoamento é iluminado por luz laser. Em nosso dispositivo do canal de fluxo de detecção faz uma curva de 90 graus abrupta após a última região excitação laser para criar acesso óptico perto de uma fibra OD 225 mm usado para detectar fluorescência emitida. A fibra maior é usado por causa da sua elevada abertura numérica (NA = 0,39), que é semelhante a uma objectiva de microscópio padrão. Uma gotícula flui através do canal de detecção encontra regiões discretas de excitação na frente de cada uma das fibras ópticas acoplado a laser (Figura 3A). O único PMT acoplado aos registos de fibra de detecção de fluorescência emitida com um deslocamento temporal, os mapas para a fonte de excitação. Para uma gotícula que contém corantes que excita a 473 nm (região de &quot;1&quot; na Figura 3A) e a 405 nm (região &quot;2&quot; na Figura 3B), o sinal de PMT resultante contém um dupleto de sinal, com um pico de separação que se correlaciona com o tempo que leva uma gota para se deslocar de uma região de excitação para o próximo. Ao codificar temporalmente dados espectrais deste modo, a necessidade de uma maior retenção de luz e PMTs separados para cada cor fluoróforo é eliminado. A Figura 3B mostra dupletos de sinal para um trem de 4 gotas com diferentes combinações de corantes. O primeiro pico na dupla correspondems para a fluorescência emitida depois da excitação pelo laser 473 nm na região de &quot;1&quot; e o segundo pico corresponde a fluorescência emitida depois da excitação pelo laser de 405 nm na região de &quot;2&quot;. A eficácia do sistema de detecção foi testada através da detecção de uma emulsão mista de gotículas contendo corantes que excita a 405 nm (azul de dextrano conjugado, CB) e a 473 nm (fluoresceína, ITCF). Gotículas foram fluiu através das regiões de detecção em aproximadamente 50 Hz e os dados foram registrados durante 60 segundos, em seguida, pós-processados ​​com um script programa de computação. Os dados são representados graficamente na Figura 4 e mostra uma clara separação entre os quatro tipos de gotículas injectadas-Re. Uma vez que o sistema de detecção não diferenciar entre as diferentes cores da luz emitida, cada gotícula é descrito por sua fluorescência total máximo depois de ser animado na região &quot;1&quot; (pico 1) e na região 2 (2 pico). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; A gama dinâmica e a sensibilidade absoluta do detector é investigada por desligar o laser de 405 nm e medindo a fluorescência de uma emulsão que contém gotículas de somente fluoresceína (Figura 5). Os dados mostram a capacidade para detectar a concentração de corante que variam de 0,1 a 100 nM FITC em um único detector, com as mesmas configurações de detecção. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig1.jpg" /> Figura 1. Multi-camada de fotolitografia. O dispositivo de microfluidos é fabricado através da criação de um mestre com três alturas diferentes funcionalidades. Em primeiro lugar, uma camada de 80 um de altura de SU-8 é fiado em e modelado utilizando uma máscara para os canais de fluido. Em seguida, mais 40 mm SU-8 é girada sobre e 120 mm de altura recursos são padronizados com um 2º mascarar tanto através dos SU-8 camadas para produzir a geometria para acomodar 125 mm fibras ópticas de altura. Após isto, uma00 mm mais SU-8 é girada sobre e modelado com uma máscara de 3ª para produzir 225 mm características de altura. Depois de desenvolver, ligas PDMS, e ligação de plasma ao vidro, o dispositivo resultante contém grandes canais acessíveis a partir do lado para a inserção de fibra, além de canais de fluido fechados padrão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig2.jpg" /> Figura 2. Projeto de dispositivos e layout óptico. As porções de fluidos do dispositivo são compostos por um reinjector gota e um espaçador óleo, acoplado a um canal em forma de L. Fibras acoplados aos lasers individuais são inseridos normal à direcção de fluxo. Uma fibra de detecção é inserido perpendicular às fibras de laser, a fim de recolher a luz fluorescente. Esta luz é filtrada através de abandpass filtro, antes de ser detectado por um único PMT. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig3.jpg" /> Figura 3. codificação temporal da informação multicolor. Gotas (a) Fluxo através de regiões de excitação &quot;1&quot; e &quot;2&quot; em momentos diferentes, proporcionando deslocamento de tempo que permite a identificação da luz emitida. (B) de dados a partir de um trem de 4 gotas de diferentes fluem através do canal de detecção. O primeiro pico de cada dupleto corresponde à fluorescência emitida após excitação na região de &quot;1&quot; e o segundo pico em cada duplos corresponde à fluorescência emitida após excitação na região &quot;2&quot;. A altura dos picos das gotículas são proporcionais a quantidade de corante a uma animadodado comprimento de onda, excepto quando de purga espectral ocorre devido ao uso de corantes com sobreposição de espectros de excitação. A largura dos picos são determinadas pela quantidade de tempo que leva uma gota de atravessar uma região de excitação. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig4.jpg" /> Figura 4. multicolorido detecção de uma população mista de gotícula. Gráfico de dispersão que mostra a intensidade máxima da gota por uma população mista de gotículas depois da excitação e emissão de 473 nm por um laser (pico 1) e um laser de 405 nm (pico 2). As gotículas contêm combinações de fluoresceína (FITC) e azul cascata (CB) em concentrações Nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta</a>figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig5.jpg" /> Figura 5. detecção de cor Única sobre população gota altamente variada. Histograma de emissões por uma população gota mista contendo 0,1-100 nM de fluoresceína após excitação por um laser 473 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54010/54010fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K visualizações.  University of California, San Francisco. Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Vídeo: Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioengenharia

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...