This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Hayvan çalışmaları yetkili ve Newcastle Üniversitesi Etik inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan prosedürleri bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Yönerge&#39;de 2010 Avrupa Parlamentosu / 63 / EU gelen yönergelere uygun gerçekleştirilir bulundu. 1. Edu İdaresi <ol><li> steril tuzlu su çözeltisi içinde çözülür edu (w /% 0.9 h) 12.5 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda. <ol><li> tamamen çözülmesi için 40 ° C ve vorteks çözelti ısıtılır. 6 günlük enjeksiyonlar için izin çalışmada tüm fareleri enjekte 4 ° C&#39;de yeterli edu / Saline saklayın. Not: Genellikle 6 farelerin her bir deney grubu için gereklidir. Ancak, güç hesapları bağımsız çalışmalar için yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Bireysel fareler tartılır. Her fare edu / tuzlu su çözeltisi içinde 100 ug / g (g başına stok edu solüsyonu 8 ul) yönetmek için gerekli hacmi hesaplayın. </li><li> Uygun volum çizmek25 G iğne ile insülin şırınga içine edu / tuzlu e. </li><li> onaylı Ev Ofis tekniklerini kullanarak fareleri işlerken intraperitoneal (ip) enjeksiyonları gerçekleştirin. <ol><li> kafes kapağındaki bir fare yerleştirin. Yavaşça kuyruk tabanı geri çekin ve sıkıca yapışmak fare kavramak. </li><li> kafa tabanına yakın işaret parmağı ve başparmak ile fare tutan ve yere doğru geriye hayvanın kafasını devrilme enjeksiyon için karın Açığa. </li><li> % 70 alkol solüsyonu ile karın silin. Hayvanın orta hat ve sağ alt kadranda bulun. Sağ alt kadran içine hayvana edu / Tuzlu çözüm enjekte. </li><li> Edu / tuzlu su çözeltisi ile fareler enjekte edilir ve günün saatini kaydeder. </li></ol></li><li> Tekrarlayın 6 gün boyunca, günün aynı anda 1.4 1.2 adımları tekrarlayın. Not: Bir Edu negatif kontrol akım sitometri analizi için yolluk ayarlamak için gerekli olduğundan, ek bir yaş, cinsiyet enjekte ve deneysel maçEdu olmayan tuz denk hacimde Ed fare. Bu, gerekli kontrolü (hiçbir EDU kontrolü) sağlayacaktır. Her çalışma reaktiflerin gruplar halinde varyasyonlara izin için bu kontrol dahil edilmelidir ve sitometresi kurdu. </li></ol> 2. Hasat Kalpler <ol><li> 6. Edu enjeksiyonundan 24 saat sonra, servikal dislokasyon (ya da 1 Home Office onaylı alternatif Çizelgesi yöntemi) kullanılarak fareler kurban. </li><li> Bir yatar pozisyonda kurban hayvan koyun ve cerrahi makas ile diyaframa orta karın cilt kesi yapmak. </li><li> diyaframı kesti ve kalp maruz bilateral kesilmiş vücut boşluğunda uzak sternum tutarak. </li><li> biraz kalbi kaldırın ve göğüs boşluğu dışında kalbini incelemek için çıkış yolunda büyük kan damarları kesilmiş. </li><li> Hemen PBS 4 ° C&#39;ye soğutulmuş 10 ml içeren bağımsız bir 15 ml santrifüj tüpüne her kalp yerleştirin. </li><li> sep kalpleri aktarınarate 10 cm Petri kapları, bir neşter sagital yönde ikiye her kalbi kesilmiş ve yavaşça forseps bir çift ile sıkarak kalbi yıkayın kullanarak. Sonra mümkün olduğunca kan kaldırmak için PBS değiştirin. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Aynı birey 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine her kalbin iki parçayı yerleştirin. </li><li> 3 veya alternatif mağaza örnekleri adıma -80 ° C adımlarla 2.9 ve 2.10 ayrıntılı olarak devam etmektedir. </li><li> 25 G iğne kullanılarak, kalp işlendiğinde Mikrosantrifüj tüpü kapak küçük bir delik dolayı gazların genişlemesine kapağın açılmasını önlemek için kullanılır. </li><li> dondurma için sıvı azotun, bir kap içinde her bir mikrosantrifüj tüpü ve yer etiketi. </li></ol> 3. Çekirdekler Ayrılma ve kardiyomiyosit Çekirdekler Etiketleme . 11 Bu çekirdekler ayrılma kardiyomyosit çekirdekleri etiketleme Bergmann ve ark o uyarlanmıştır enjekte tüm örnekler üzerinde bu yordamı gerçekleştirin: NotEdu ve enjekte tuz (hiçbir EDU kontrolü) negatif kontrol ile. Bu adımları gerçekleştirmek için gerekli çözümlerin tarifi için Tablo 1&#39;e bakınız. <ol><li> Her bir kalp analiz edilmesi için, 30 dakika inkübe edilir, bir ultra santrifüj tüpüne% 1 BSA / PBS çözeltisi 36 mL yer çözeltisi atılır ve daha sonra kurumaya bırakın. Not: Bu tüp adım 3.6 kullanılır. </li><li> kalpleri kıyma işlemi sırasında defrost sağlayan bir neşter kullanılarak buz ve kıyma üzerinde 10 mm çanak üzerine bireysel dondurulmuş kalpleri yerleştirin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpünde hücre lisis tamponu, 15 ml inceltilmiş kalpleri yerleştirin ve oda sıcaklığında 25.000 rpm&#39;de 15 saniye için bir sonda homojenleştirici ile homojenize edilmiştir. </li><li> Santrifüj tüpüne Celi Lysis Buffer bir başka 15 ml ilave edilir ve geniş bir açıklık havan tokmağı ile 40 ml&#39;lik bir Dounce transfer. havaneli ile 10 kez gerçekleştirmek ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine, bir 100 um ile daha sonra 40 mikron hücre süzgecinden süzülür. </li><li> 10 dk için santrifüjT 700, 4 ° C&#39;de xg ve supernatant çıkarın. </li><li> Sükroz Gradyan çözeltiden 25 ml, nükleer pelet yeniden süspanse edin ve 3.1 hazırlanan bir ultra santrifüj tüpüne taze sukroz gradyanlı çözeltisi 10 ml üzerine çözelti içeren hücre çekirdekleri katman. </li><li> bir salıncak üzerinden boru rotor kullanılarak 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve etiket PCM1 çekirdekler saklama tamponu 1.300 ul çekirdekleri pelletini. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süspansiyon 300 ul çıkarın ve taze çekirdekler depolama tamponu 700 ul ekle. ISO kontrolü gibi bu tüp etiketleyin. </li><li> PCM1 etiketli mikrosantrifüj tüpüne mi 8 ug / mL&#39;lik nihai bir konsantrasyonda anti PCM1 ekleyin ve ISO kontrolü etiketli mikrosantrifüj tüpüne 8 ug / ml bir konsantrasyonda Tavşan IgG izotip kontrol antikoru ilave edin. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. aşağıdaki inkubasyonation, 10 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj 700 x g&#39;de 10 dakika boyunca tekrar taze çekirdek saklama tamponu, tekrar süspansiyon ve santrifüj 1 ml yerine, süpernatant atılır. Süpernatantı atın ve taze çekirdekler depolama tamponu 1 ml ile değiştirin. </li><li> 2 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için F (ab &#39;) Keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru (FITC veya eşdeğer yeşil floresan boya) 2 Fragment 1 ul ekle. Not: bir F (ab &#39;) kullanımı 2 fragmanı antikorun makrofajlar ve B hücreleri gibi immün hücrelerin spesifik olmayan etiketleme potansiyelini azaltır. </li><li> alüminyum folyo sarma borular ışıktan korumak ve 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübasyona. </li></ol> Edu Kuruluş 4. Algılama <ol><li> Seyreltin 10x deiyonize su ile edu reaksiyon tamponu 01:10 konsantre. </li><li> Santrifüj PCM-1 ve ISO kontrolü etiketli çekirdek süspansiyonları, 10 dakika boyunca 700 x g hızında, süpernatan atılır ve 1 ml çekirdekleri pelet% 1 BSA / PBS solüsyonu. iki çekirdek pelet yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, süpernatantı atmak ve edu fiksatif 100 ul ile değiştirin. </li><li> ışıktan korumak ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin, alüminyum folyo ile tüpler sarın. </li><li> 700 xg% 1 BSA / PBS çözeltisi, santrifüj kez 1 ml örneği yıkama ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x saponin bazlı permeabilizasyon çözeltisi ile inkübe edilir. </li><li> 1x edu etiketleme kokteyl (Tablo 2) hazırlayın. 2 reaksiyonların en az hiçbir EDU kontrolü de gerekecektir. </li><li> şirketinden önce 1x saponin bazlı permeabilizasyon çözeltisi 100 ul çekirdek içeren her bir örnek için 1x edu markalama kokteyl 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> % 1 BSA / PBS 1 ml 700 xg ve tekrar süspansiyon Santrifüj ve bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 700 xg&#39;de santrifüj, supernatant atmak ve 4 ile değiştirinDNA boyama çözeltisi 00 ul (Malzeme Tablo). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> 1. Hücre Liziz Tamponu </td></tr><tr><td> 0.32 M sukroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCI (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl2 </td></tr><tr><td> 5 mM magnezyum asetat </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradyan Çözelti </td></tr><tr><td> 2.1 M sukroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCI (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM magnezyum asetat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 3. Çekirdekler depolama tamponu (NSB) </td></tr><tr><td> 0.44 M sukroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCI (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCI </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1.5 mM spermin </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Çekirdekler izolasyon tampon maddeler protokol bölüm 3 (Çekirdekler ayrışma kardiyomyosit çekirdekleri etiketleme) kullanılan tüm Tamponlar için Reçete.. 5. Akım Sitometrisi Analizi Not: Daha önce 7,11,15 tarif edildiği gibi izole çekirdekler üzerinde sitometri Akışı gerçekleştirin. <ol><li> İlk olarak, enkaz (Şekil 2A) gelen çekirdeklerin ayrımcılık izin İleri Yayılım (FSC) ve Yana Yayılım (SSC) açıklayan bir arsa oluşturun. </li><li> Yüksekliği karşı 4 çizerek agrega (Şekil 2B) dan tek çekirdekleri ayırmak için bir komplo &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) oluşturun (DAPI) alan (3-405 / 450/50-A) (33-405 / 450 / 50-H). tha sağlamakt 3-405 / 450/50 sinyal DNA içeriğinin doğru belirlenmesini sağlamak için doğrusal bir ölçek üzerinde toplanır. </li><li> SSC vs 488/535/30 A açıklayan bir arsa (PCM-1) oluşturma ve tekli popülasyonda PCM-1 ifadesini değerlendirmek için 5.2 oluşturulan tekli kapısından sadece olayları görüntülemek. </li><li> PCM-1 pozitif kapı (Şekil 2C) oluşturmak üzere İzotip kontrol örneği çalıştırın. PCM1 küçük bir miktar nüfus ve yolluk konumunu ifade PCM1 doğrulamak için örnek etiketli çalıştırın. </li><li> 405/450/50-A (DAPI algılamak için) vs SSC-A açıklayan bir arsa oluşturun. Bu arsa içinde, ekran sadece 5.3 oluşturulan kapıları kullanarak, PCM1 ifade çekirdekleri tekli. Sadece 2N çekirdekleri (Şekil 2B) içeren ek bir hiyerarşik kapısı yaratmak için bu komplo kullanın. </li><li> Kardiyomiyosit nüfusu ifade PCM1 EDU etiketleme tanımlanmasını sağlamak için 1-633 / 660/20-A vs 488/535 / 30 A tanımlayan bir arsa oluşturun. tekli, P sadece çekirdekleri görüntülemek<html> Yukarıdaki ayırıp kullanarak CM1 + ve 2N. </li><li> Hiçbir EDU kontrolü çalıştırın kalp örnek edu pozitif kapısı (Şekil 2E) ayarlamak için. Edu + hücreleri için uygun kapı oluşturun. </li><li> Tutanak ve ölçmek tekli, Edu dahil olması PCM-1 ifade 2N çekirdekler. </li><li> toplam tekli, PCM1 + çekirdek bir yüzdesi olarak bu nüfusu hesaplayın. Bu, toplam kardiyomiyosit çekirdekleri bir yüzdesi olarak, 7 günlük edu darbe süresince neo-kardiyomiyosit çekirdek oluşum oranını sağlayacaktır. Not: DNA bağlanma DAPI stoikiometrik olduğu floresan yoğunluğu DNA miktarı ile orantılıdır. Daha önce tarif edildiği gibi, 7 405/450/50 bir sinyalin yoğunluğuna dayalı olarak ploidi belirler. </li><li> Toplam kardiyomiyosit nüfus içinde ploidi değerlendirmek için 5.5 kurulan arsa ve DNA konsantrasyonu 7 dayalı bir yolluk strateji kullanın. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2:. Kardiyomiyosit Edu katılmasını ve ploidi ölçmek için strateji yolluk (A) Çekirdekler forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) dayalı enkaz ayırt edilir. (B) doğrusal kapı oluşturulur ve tekli çekirdek nüfus DAPI etiketleme ve alan sinyali vs 405/450/50 boyuna göre belirlenir. (C), Floresan yolluk kalp dokusunda kardiyomiyosit çekirdekleri (PCM-pozitif 1) ve non-kardiyomiyosit (PCM-1-negatif) çekirdeklerin ayrılmasını sağlar. DAPI sinyalinin (D) Yoğunluk DNA konsantrasyonu ve PCM1 + kardiyomiyosit nüfusun böylece çekirdek ploidi belirlemek için kullanılır. farede&gt; kardiyomiyosit çekirdeklerinin% 80 diploid (2n) &#39;dir. (E) Floresan yolluk 2N ayrılmasını sağlar 2N Edu (PCM + / EDU + =% 0.9) dahil olması kardiyomiyosit çekirdeklerinin, Edu dahil değil kardiyomiyositlerde (PCM + EDU-). Tüm adımlar protokolde 5.0 detaylandırılmıştır. MDX gösterilmeleri Örnek -. C57 / BL10 arka plan üzerinde / y fareler <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

doğru Kardiyomiyosit ciro ölçmek için ve rejenerasyon deneyleri gerçek kardiyomiyosit üretimi ve nonprodüktif DNA bölümü ayırt etmeliyiz. Birçok çalışma, sadece siklin kinesis ve hücre döngüsü belirteçleri ifadesi aracılığıyla kardiyomiyosit çoğalması miktarının, sadece bu nonprodüktif olayları görmezden gelmeye devam. Bu nonprodüktif olaylar için kontrol kinayeli kalırken kardiyomyosit ciro doğru ölçümü sağlar tek bir yöntemi bugüne kadar. Özellikle bu kardiyomiyosit DNA replikasyonu 13 65% ~ kadar katkıda kardiyomiyosit poliploidleşmeyi hesaba güçtür. Bu nedenle Kardiyomiyosit nesil doğru ölçümü biz artan ploidleşmede sonuçlanan DNA replikasyonu hariç ise neo kardiyomiyosit çekirdeklerinin oranlarının güçlü ölçümü sağlar bir protokol geliştirdi yardımcı olmak. Her ne kadar bu protokol can neo-kardiyomiyosit cins arasında değil ayrımcılıkyon kardiyomyosit iki çekirdeklenme, hızla kullanılan ve doğru bir üst limit kardiyomiyosit nesil (ploidleşmede için muhasebe) hesaplamak mümkündür. Bu protokol, bu nedenle hastalık modellerinde kardiyomiyosit üretimi ve poliploidleşmeyi oranlarında potansiyel değişiklikleri değerlendirmek için ya da terapötik potansiyel etkinliğini değerlendirmek için bir tarama aracı sağlar. Neo-kardiyomiyosit çekirdekler üretimi hızındaki değişiklikler bu protokolü kullanılarak tespit edildikten sonra kardiyomiyosit çekirdeklenme sayısının kardiyomiyosit nesil değişiklikler nedeniyle, bu, daha önce tarif edildiği gibi 2,13,17,18, eğer daha sonraki çalışmalarda tespit etmek için kullanılabilir. Bunlar darbe döneminde histolojik miktar kardiyomiyosit çekirdeklenme dinamikleri kullanımını içerir veya mononükleer ve çok çekirdekli kardiyomiyosit popülasyonlarında edu birleşmesini karşılaştırmak için edu darbeli hayvanlardan elde edilen doku kesitlerinde analiz eder. Nedeniyle kardiyomiyosit ciro bu düşük seviyelerdeprotokol 7 günlük bir süre içinde edu birden enjeksiyonları kullanır. Bu aynı zamanda Kardiyomiyosit nesil tüm potansiyel hücresel kaynakların &quot;peşinde&quot; ve bu süre boyunca kümülatif kardiyomiyosit çekirdeklerinin nesil ölçümü izin verir. Çalışmada bağlı olarak, bu zaman aralığı kardiyomiyosit nesil tahmin düzeylerine uygun şekilde ayarlanabilir. kardiyomiyosit çekirdeklerde edu dahil doğru ölçümü için, PCM-1 reaktivitesini tespit etmek için kullanılan ikincil antikor ile çekirdeklerin herhangi spesifik olmayan etiketleme olup zorunludur. Nedenle, bunun dışında, bir ikincil antikor, bu protokol, kullanılacak önerilen, özellikle protokol bu yönünü optimize etmek için ilave ikincil antikor titrasyon deneyleri gerçekleştirmek için mantıklı olacaktır. Burada açıklanan protokol kardiyomiyosit çekirdekleri tanımlamak için PCM-1 ifadesini kullanır. Bu kurulu bir kardiyomiyosit belirtecidir Ancak, alternatif markörler doğrulamak için kullanılabilirveri; Bu, kısmen kardiyomiyosit çekirdekleri 1. lokalize olarak tanımlanmıştır cTnT&#39;nin için spesifik antikorları içerir. Benzer şekilde, alternatif çekirdek lokalize proteinler kardiyomiyositlerin dışındaki çekirdek popülasyonlarda edu birleşmesini belirlemek ve ölçmek için kullanılabilir. DNA sentezinin akıbeti henüz bilinmiyor ve hücre bölünmesi ya da artmış ploidleşmede ya neden olabilir aktif olarak mitoz geçiren tüm kardiyomiyosit çekirdekler, analize dahil edilmesi önemlidir. PCM1 nedenle mitoz geçiren PCM1 ifade tarafından tespit olmayacaktır kardiyomiyositlerinin hücre döngüsünün M fazında demonte edilir. Buna ek olarak, hücre döngüsünün S fazında Tüm çekirdekler daha sonra analize dahil edilmelidir. Bu 2N ve 4N popülasyonlar arasındaki bir DAPI yoğunluğu da dahil olmak üzere 2N nüfus üzerinde bir DAPI yoğunluğu ile tüm çekirdekleri dışarı yolluk elde edilebilir. giderek rağmenKalp normal yaşlanma ve sonrası akut yaralanma sırasında kardiyomiyositlerde yerine kapasitesine sahip olduğunu kabul, bu potansiyelin kaynağı ve derecesi tartışmalıdır. Buna ek olarak, kardiyomiyosit devir farklı oranları 1,7,20-22 bildirilmiştir. Bu, doğru tanımlanması ve neo-kardiyomiyosit Üretimi 19 miktarının zorluklara kısmen olabilir. Çalışmaların büyük çoğunluğu sadece histolojik analizinin kullanımı kardiyomyosit devir ve yenileme 2,4,23,24 miktarının sarkomerinde proteinler de dahil olmak üzere sitoplazmik proteinlerin ekspresyonu ile kardiyomiyositlerin tanımlanması dayanmıştır Bugüne kadar. Bu yöntemlerin kullanılması çoğalması markerlerinin ifadesi tespit etmek için, ya da burada gösterildiği gibi, timidin analogları dahil kolayca kardiyomiyositlerde ve diğer kardiyak hücre tiplerinin hatalı tanımlama neden olabilir. 3D konfokal görüntüleme kullanımı inci bu sorunları hafifletmek için yardımcı olabilirESE yöntemler pahalı ve zaman alıcıdır. İlginç bir şekilde, burada açıklanan protokol, neo-kardiyomiyosit çekirdekler üretimi haftada% 0.17 oranında oluşur göstermektedir. Bu kadar 0.13% 5 haftalık ciro oranlarını gösteren bazlı çalışmalar sitometri diğer akışı ile tutarlıdır. Önceki çalışmalarda 2,5,25,26 gibi bu verilere dayalı yıllık cirosu oranları tahmin etmek cazip olmasına rağmen ciro oranları bir hayvanın 13 yaşam süresi boyunca dinamik olarak, bu uygunsuz. Bu yöntem kardiyomyosit rejenerasyonu artırmak için potansiyel terapötikler değerlendirilmesi veya kardiyomiyosit ciro kalp hastalığı etkilerini kardiyomyosit poliploidleşmeyi oranları araştıran dahil olmak üzere potansiyel uygulamaları bir dizi vardır.

Son yıllarda kalp terminal farklılaşmış, post-mitotik organı 1,2 olduğunu varsayım zorlu delil birikimi olmuştur. Ancak, kardiyomiyosit ciro ve yenilenme ölçümü zor kalır. Doğru, standart immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nadir kardiyomiyosit nesil belirlenmesinde zorluklar iyi 3 bildirilmiştir. Buna ek olarak, kardiyomiyosit nesil hücresel kaynak kardiyomiyosit çoğalması ve kök hücre farklılaşması 4-6 katkıları için kanıt belirsizdir. Bu nedenle, kardiyomiyosit progenitör fenotip bilgisi gerektiren soyu izleme modellerin kullanımı imkansız ve kardiyomiyositlerde dahil olmak üzere tek nüfus, çoğalma ölçümü ise, uygun değildir. Ayrıca, bir kardiyomiyosit karyokinesis olmayan endoreplication potansiyeline sahip (bir poliploid araba sonuçlanandiomyocyte) ya da sitokinez (a binükleer kardiyomiyosit sonuçlanır) 7,8 yokluğunda karyokinesis. Kardiyomiyosit ciro doğru ölçümü bu olaylar ve gerçek neo-kardiyomiyosit nesil arasında ayrım yeteneğine bağlıdır. Kardiyomiyositlerde DNA replikasyonu ve sikline bağımlı kinazlann ekspresyonu sadece gerçek hücre bölünmesini 9,10 göstermektedir, çünkü bu özel sorun çıkarmaktadır. Uzun vadede yeni yöntemlere göre Bergmann ve ark., 7,11 tarif edildiği gibi, neo-kardiyomiyosit nesil miktar yardımcı olmak için, kurulu bir çekirdek izolasyon tekniği ve kardiyomiyosit çekirdekleri tanımlanması için pericentriolar madde 1 (PCM1) immünolojik etiketleme birleştirdik DNA etiketleme ve ploid analizi. PCM-1 farklılaşmış olmayan bisiklet miyositler nükleer yüzeyinde birikir bir sentrozom proteindir. Daha önceki çalışmalar, karşı antikor olduğunu göstermiştirPCM-1, özellikle kardiyomiyosit çekirdekleri 7,11 etiket ve PCM1 bağımsız grupların sayısına göre kullanılır olmuştur olarak kardiyomiyositlerde 1,12,13 tanımlamak için. Buna ek olarak, PCM1 sentezleme TNT-cre transjenik fare modelinde 14 (Ek Şekil 1) genetik olarak etiketlenmiş kardiyomiyosit çekirdekleri eşleştiren olduğunu göstermiştir. Burada açıklanan protokol bağımsız bağlı analizi (Şekil 1C, D) için poliploidleşmeyi hücresel kökenli (Şekil 1 A ve B), aynı zamanda nükleozit etiketleme hariç ise bölgesinin fare kalp neo kardiyomiyosit çekirdeklerinin üretiminin doğru ve hassas bir tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, kardiyomiyosit binucleation için kontrol edemez birlikte, kardiyomiyosit devir doğru ölçümü için gerekli olan yeni-kardiyomiyosit çekirdeklerin hızlı ve sağlam bir ölçümü sağlar. Ayrıca,o Kardiyomiyosit nesil dinamikleri potansiyel değişiklikleri değerlendirmek için hızlı bir tarama aracı sağlar. DNA etiketleme genellikle timidin analoğu gibi, 5-bromo-2&#39;-deoksiüridin (BrdU) içerirken, burada açıklanan protokolü daha hızlı için daha az işlem adımı gerektirir gibi bir 5-etinil-2&#39;-deoksiüridin (edu) bazlı analiz kullanır iş-zaman ve diğer immün protokolleri ve böylece yöntemin potansiyel alt uygulamaları artan ile uyumlu hale immüno saptanması için DNA denatüre gerektirmez. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Şekil 1: Edu ile sürekli darbe bakılmaksızın atalarıdır neo-kardiyomiyositlerde etiketler. (A) edu hücre bölünmesi esnasında kardiyomiyositlerin DNA&#39;ya dahil edilir. kardiyomiyosit popülasyonda çoğalma Resul olacakkardiyomiyositlerinin bir artış ya da değiştirilmesi t ve dolayısıyla verimli DNA sentezi (doku bakım ve onarımı katkıda) &#39;dir. (B) edu hücre bölünmesi sırasında kalp progenitör hücrelerin DNA içine dahil edilir. Bu kardiyomiyosit soy farklılaşma sırasında hücrede muhafaza edilecektir. Bu kök hücre farklılaşması da kardiyomiyositlerinin sayısında bir artışa neden ve bu nedenle doku bakım ve onarım katkıda olacaktır. (C) Kardiyomiyositler kardiyomiyosit hipertrofisi ve miyokard biçimlenme ile ilişkili artmış kardiyomiyosit ploidi, sonuçlanan &quot;üretken olmayan&quot; DNA replikasyonu geçmesi potansiyeline sahip, ancak kaybedilen kardiyomiyositlerde yerine geçmez. Bu iki homolog kromozomlar (&gt; 2 N), dört veya daha fazla grup ihtiva eden bir tek çekirdek bir kardiyomiyosit sonuçlanan şekilde poliploidleşmeyi bir işlem binucleation farklıdır. Sürekli bir çekirdek p aşağıdakı (D)Ulse, bu protokol kardiyomiyosit ploidinin ve edu dahil hem miktarının izin PCM1 ifade tarafından kardiyomiyosit çekirdeklerinin çekirdekleri izolasyonu ve tanımlanmasını açıklar. PCM1 ifade ve akım sitometri kullanılarak tespit edu kuruluş. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2038">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:501px;">0.32 M sucrose</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">84100</td>
			<td style="width:1156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c5086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM magnesium acetate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M-5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mM EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mM EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mM DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 mM KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mM spermine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td>
			<td>abcam</td>
			<td>abc7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-PCM-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">HPA023374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 F(ab&#39;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell strainers&#160; 70 &#956;m and 100&#956;m&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11597522, 11517532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10634</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for section, EdU reaction buffer,&#160; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyStain DNA 2 step kit,</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>05 5005</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe homogeniser e.g. TissueRuptor&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueRuptor Disposable Probes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:267px;">990890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Facscanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

kalp, normal yaşlanma sırasında yaralanma aşağıdaki kardiyomiyositlerde kardiyomyosit ciro bu düşük seviyelerde meydana yenilemek için sınırlı bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmekle birlikte, bu olayların ölçümü zor kalır. Bu durum sürecin nadir ve çok sayıda hücresel kaynaklar miyokard korunmasına katkıda gerçeğine bölümünde yer almaktadır. Ayrıca, kardiyomiyositlerinin içinde DNA çoğaltılması genellikle polyploid kardiyomiyosit yol açar ve nadiren hücresel bölümü tarafından yeni kardiyomiyositlere yol açar. doğru bu süreçler arasındaki kardiyomiyosit ciro ayrımcılığı ölçmek için esastır. Burada açıklanan protokol çekirdek izolasyon ve sonraki PCM1 immün kullanılarak belirlenen DNA replikasyonu kardiyomyosit çekirdekleri sonucunda ortaya çıkan tüm çekirdeklerin etiketlemek için uzun vadeli nükleozid etiketleme kullanır. Birlikte bu c nükleozid etiketleme doğru ve hassas bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olmaktadırçekirdekler nüfus ardiomyocyte. Ayrıca, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol etiketleme ve çekirdekler ploidinin analizi, poliploidleşmeyi sırasında nükleosit dahil olan çekirdeklerin neo-kardiyomiyosit çekirdeklerin ayrım sağlar. Bu yöntem, kardiyomiyosit binucleation için kontrol olamaz da poliploidleşmeyi için gerekli hesaplamaların, neo-kardiyomiyosit çekirdeklerin hızlı ve sağlam bir ölçümü sağlar. Bu yöntem kardiyomyosit rejenerasyonu artırmak için potansiyel terapötikler değerlendirilmesi veya kardiyomiyosit ciro ve ploidleşmede kardiyak hastalığın etkilerini araştıran dahil mansap uygulamaları bir dizi vardır. Bu teknik, aynı zamanda tüm kardiyak hücre tiplerinde nükleosit esas sayılmasına olanak tanıyan ek bir alt immünohistolojik tekniklerle uyumludur.

artan poliploidleşmeyi için kontrol ederken bu yöntem nedeniyle kardiyomiyosit çekirdeklerinin bölünme arttı edu kuruluş ölçümü sağlar. Bir BrdU bazlı bir deney kullanılarak, daha önce, memeli kalp yeni kardiyomiyositlerde rejenerasyonu ile, Duchenne kas distrofisi MDX fare modelinde kronik kardiyomiyosit kaybına cevap gösterdi. Biz daha da yayınlanan bulgularını doğrulamak ve protokol yarar göstermek için burada açıklanan yöntemleri kullandık. açıklanan protokol gereği; Yetişkin (12 haftalık) mdx ve kontrol bl10 fareler 7 gün boyunca edu bir günlük enjeksiyonu ile pulse edildi, deney grupları 5,13 arasında statik analiz izin önceden bildirmiştir. Darbeli kalplerin immünohistolojik analizi edu (Şekil 3A) dahil olması kardiyomiyositlerde ifade PCM1 varlığını ortaya koymaktadır. Ancak, veri elde istimalEdu dahil diğer hücre tipleri kardiyomiyositlerde olarak misidentified edilebilir g immünohistolojik yöntemler, yanlış yorumlanabilir. Bunun bir örneği, Ek Şekil 1A ve B&#39;de gösterilmiştir. Ayrıca immünohistolojik yöntemler nükleer bölümünden poliploidleşmeyi ayrım yapmıyor. Bu protokol ayrıntılı sitometri analizi akış nedeniyle poliploidleşmeyi için edu dahil olan hücreleri hariç tutarak, mdx ve kontrol farelerde kardiyomyosit nükleer bölünme hızla miktarının sağlar. Daha önce yayımlanmış verilere 13 benzer şekilde, analiz yaş kıyasla mdx fare kalplerinde neo-kardiyomyosit çekirdekler nesil oranlarında bir artış ortaya denetimleri (Şekil 3B ve C% 0.17 karşı% 1.2) eşleşti. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Şekil 3: </strong&gt; Edu Niceleme yabanitipte ve mdx kalplerinde kardiyomiyositlerde etiketli. Mdx kalplerin 40 mikron kalınlığında kesitler alınan Z-yığın projeksiyonlar (A) Görüntü. PCM-1 ifade kardiyomiyosit çekirdeklerinin Edu (kırmızı) yer vermiş (yeşil). Sarı ok Edu kardiyomiyositlerde etiketli gösterir. I ve II ayrı ayrı edu Z düzleminde gösterildiği kardiyomiyositlerde etiketli gösterir. (- C57 / BL10 arka plan üzerinde / y mdx) Çekirdekler DAPI (mavi) (B ve C) sitometri izole çekirdeklerin Flow 12-13 haftalık vahşi tip (C57 / BL10) ve mdx farelerden alınan temsili arsaları gösteren etiketli. (B) Histogram 2N ve&gt; 2N çekirdekleri arasındaki DAPI yoğunluğu ve ayrımcılık gösteren. Bu protokol ayrıntılı olarak analiz edildiğinde 2N kardiyomiyosit çekirdeklerinin popülasyonunda edu birleşmesini gösteren (C) Arsalar. Tüm fareler edu 1&#39;den 1 hafta uygulandıYaş 2 hafta. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ek Şekil 1:. PCM-1 kardiyomiyosit çekirdeklerinin için özel bir işaretleyici protokolünü kullanarak çekirdekleri ROSA nT / nG CRE hassas muhabir hattı 16 ile TNT-CRE fareler 14 geçerek üretilen çift transgenik fare izole edildi nitelendirdi. Troponin (TNT) promoterinin kontrolü altında elde edilen, fare cre aktivasyonu çekirdekler lokalize olan GFP geri dönüşümsüz ekspresyonuna yol açar. Çekirdekler GFP ifade kardiyomiyosit çekirdeklerinin nüfusu (488/530/30-A) tanımlamak için yeteneği gösterir İzotip kontrolü (Iso) ile etiketlenmiş. Anti-PCM1 ile çekirdeklerin Etiketleme (tespit ikincil antikor 633-660 / A 20) GFP ifade cardiomyocy ile PCM1 ifade korelasyon göstermektedirte çekirdekler nüfus. TNT promotör aktivitesi ile tanımlanan, PCM1 antikoru ile etiketli kardiyomiyosit çekirdeklerinin bu örnekte 98.8% olarak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Ek Şekil 1 indirmek için tıklayınız.</a> Ek Şekil 2:. Immünohistolojik tekniklerle kardiyomiyosit yenilenmesini ölçülmesi için Zorluklar (A) 2D görüntü de edu (kırmızı) için etiketlenmiş gibi görünen iki PCM-1 ifade kardiyomiyosit çekirdekleri (yeşil) gösterir. Sarı oklar Edu dahil olması kardiyomiyositlerde gibi görünen gösterir. Bu durum PCM1 ifade ve Edu etiketleme 2-boyutlu görüntüleme kullanılarak görüntülendi belirgin ortak yerelleştirme etmektir. (B) bu görüntünün bir 3 boyutlu projeksiyon Edu hücreleri kardiyomiyositlerde değil, PC örten olmayan kardiyomiyosit hücrelerdir etiketli tanımlarM1 kardiyomiyosit çekirdekleri ifade. Deneylerde kullanılan yaş 12. haftada C57 / BL10 fareler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Ek Şekil 2A indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Ek Şekil 2B indirmek için buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reaksiyon Bileşenleri </td><td colspan="2"> Reaksiyonların sayısını </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 ul </td><td> 2.19 mi </td></tr><tr><td> bakır koruyucu </td><td> 20 ul </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Floresan boya pikolil azid </td><td> 5 ul </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> Seyreltilmiş tepkime4.1 hazırlanan tampon </td><td> 100 ul </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Toplam reaksiyon hacmi </td><td> 1 mi </td><td> 2.5 mi </td></tr></tbody></table> Tablo 2: edu kokteyl maddeler. Edu etiketleme kokteyl için reçete protokol bölüm 4 (Algılama edu esas) gerekli.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Görüntüleme.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Gelişim Biyolojisi

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...