This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

لتحديد بدقة دوران cardiomyocyte ويجب أن المقايسات تجديد تميز بين جيل cardiomyocyte صحيح والانقسام الحمض النووي غير منتجة. لا تزال العديد من الدراسات ببساطة تجاهل هذه الأحداث غير منتجة، قياس انتشار cardiomyocyte فقط عن طريق التعبير عن الحركية عند السيكلين وعلامات دورة الخلية. حتى الآن أسلوب واحد الذي يسمح للتقدير دقيق لدوران cardiomyocyte في حين السيطرة على هذه الأحداث غير منتجة يبقى ملمح. وعلى وجه الخصوص ما زال من الصعب حساب لpolyploidization cardiomyocyte الذي يسهم تصل الى ~ 65٪ من cardiomyocyte تكرار الحمض النووي (13). لذلك للمساعدة في تقدير دقيق للجيل cardiomyocyte قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح الكمي القوي لمعدلات نوى cardiomyocyte الجدد مع استبعاد تكرار الحمض النووي أن يؤدي إلى زيادة الصيغة الصبغية. على الرغم من أن هذا البروتوكول لا يمكن التمييز بين الأجناس الجدد cardiomyocyteنشوئها وcardiomyocyte ثنائية التنوي، ويمكن استخدامه بسرعة وبدقة حساب الجزء العلوي من الحد (المحاسبة عن الصيغة الصبغية) من الجيل cardiomyocyte. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول أداة فحص لتقييم التغيرات المحتملة في معدلات توليد cardiomyocyte وpolyploidization في نماذج المرض أو لتقييم كفاءة المحتملة من العلاجات. مرة واحدة يتم تحديد التغيرات في معدل توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte باستخدام هذا البروتوكول دراسات لاحقة يمكن أن تستخدم للتأكد ما إذا كان هذا نتيجة للتغيرات في الجيل cardiomyocyte عدد cardiomyocyte التنوي، كما هو موضح سابقا 2،13،17،18. وتشمل هذه استخدام النسيجية ديناميات التنوي الكمي cardiomyocyte خلال الفترة النبض أو تحليلات أقسام الأنسجة التي تم الحصول عليها من ايدو الحيوانات نابض في لمقارنة EDU التأسيس في السكان cardiomyocyte mononucleated ومتعددة النوى. ويرجع ذلك إلى انخفاض مستويات دوران cardiomyocyte هذايستخدم بروتوكول الحقن متعددة من ايدو على مدى 7 أيام. وهذا يسمح أيضا &quot;مطاردة&quot; من جميع المصادر المحتملة الخلوية من الجيل cardiomyocyte ويسمح الكمي من الجيل cardiomyocyte نوى التراكمي خلال هذه الفترة الزمنية. اعتمادا على هذه الدراسة، يمكن تعديل هذا الإطار الزمني لتتناسب مع المستويات المتوقعة من الجيل cardiomyocyte. لتقدير دقيق لايدو التأسيس في نوى cardiomyocyte، لا بد من أن ليس هناك وسم غير محدد من النوى مع الأجسام المضادة الثانوية تستخدم لكشف PCM-1 التفاعل. وبالتالي سيكون من الحكمة لإجراء التجارب الأجسام المضادة المعايرة الثانوية إضافية من أجل تحسين هذا الجانب من البروتوكول، لا سيما إذا كان الضد الثانوية غير أن اقترح في هذا البروتوكول هو لاستخدامها. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم PCM-1 التعبير لتحديد نوى cardiomyocyte. في حين أن هذا هو علامة cardiomyocyte المعمول بها، علامات بديلة يمكن استخدامها للتحقق من صحةالبيانات؛ وتشمل هذه الأجسام المضادة المحددة للالقلب تروبونين تي والتي تم تحديدها على أنها مترجمة جزئيا في نوى cardiomyocyte 1. وبالمثل، يمكن استخدام البروتينات المترجمة النووية بديلة لتحديد وقياس EDU التأسيس في السكان أنويتها غير ذلك من العضلية. من المهم أن كل نواة cardiomyocyte التي تشهد بنشاط الانقسام مستثناة من التحليل، ومصير هذه توليف الحمض النووي غير معروف ويمكن أن يؤدي في أي انقسام الخلية أو زيادة الصيغة الصبغية. تم تفكيكها PCM1 خلال المرحلة M من دورة الخلية وبالتالي العضلية تمر الانقسام لن يتم تحديدها من قبل التعبير PCM1. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تستبعد كل نواة في مرحلة من مراحل دورة الخلية من تحليل لاحقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق المعزولة من جميع نوى مع كثافة دابي فوق السكان 2N بما في ذلك تلك التي لديها كثافة دابي بين 2N و4N السكان. على الرغم من أنها على نحو متزايدقبلت أن القلب لديه القدرة على استبدال العضلية أثناء الشيخوخة الطبيعية، وبعد الإصابة الحادة، ويبقى مصدر ودرجة هذه الإمكانات المثير للجدل. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن معدلات متباينة من دوران cardiomyocyte 1،7،20-22. قد يكون هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات في تحديد بدقة وقياس الجدد cardiomyocyte جيل 19. حتى الآن غالبية الدراسات اعتمدوا فقط على استخدام التحليل النسيجي وتحديد العضلية عن طريق التعبير عن بروتينات حشوية، بما في ذلك البروتينات من قسيم عضلي، لتقدير حجم دوران cardiomyocyte وتجديد 2،4،23،24. استخدام هذه الأساليب للكشف عن التعبير عن علامات انتشار الأسلحة النووية، أو كما هو موضح هنا، وإدماج نظائرها ثيميدين يمكن أن يؤدي بسهولة في عدم التعرف على أنواع الخلايا القلبية الأخرى العضلية. في حين أن استخدام التصوير متحد البؤر 3D يمكن أن يساعد على التخفيف من حدة هذه المشاكل عشرطرق جنوب شرقي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. ومن المثير للاهتمام، وبروتوكول الموصوفة هنا يوضح يحدث جيل أنويتها الجدد cardiomyocyte بمعدل 0.17٪ في الأسبوع. وهذا يتفق مع تدفق الآخر الخلوي الدراسات التي تعتمد إظهار معدلات دوران أسبوعية تصل إلى 0.13٪ 5. على الرغم من أنه من المغري لاستقراء معدلات دوران السنوية بناء على هذه البيانات، كما هو الحال في الدراسات السابقة 2،5،25،26، وهذا هو صورة غير ملائمة معدلات دوران ديناميكية خلال فترة حياة الحيوان (13). هذا الأسلوب لديه عدد من التطبيقات المحتملة بما في ذلك تقييم العلاجات المحتملة لتعزيز تجديد cardiomyocyte أو التحقيق في آثار أمراض القلب على دوران cardiomyocyte ومعدلات polyploidization cardiomyocyte.

في السنوات الأخيرة كان هناك تراكم الأدلة تتحدى الافتراض بأن القلب هو متباينة عضال، بعد الإنقسامية الجهاز 1،2. ومع ذلك، وتحديد حجم دوران cardiomyocyte وتجديد يبقى تحديا. وذكرت الصعوبات في تحديد بدقة الجيل cardiomyocyte نادر باستخدام تقنيات المناعى القياسية أيضا 3. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مصدر الخلوية من الجيل cardiomyocyte لا يزال غير مؤكد مع الدليل على مساهمات من انتشار cardiomyocyte فضلا عن الخلايا الجذعية التمايز 4-6. ولذلك، فإن استخدام نماذج النسب تتبع التي تتطلب معرفة النمط الظاهري cardiomyocyte السلف مستحيل وتقدير الانتشار في عدد السكان واحد، بما في ذلك العضلية، غير مناسب. وعلاوة على ذلك لcardiomyocyte ديه القدرة على endoreplication دون الحرائك النووية (مما أدى إلى السيارة المتعددة الصبغياتdiomyocyte) أو الحرائك النووية في غياب الانقسام السيتوبلازمي (مما أدى إلى cardiomyocyte binucleated) 7،8. والتقدير الدقيق دوران cardiomyocyte يعتمد على القدرة على التمييز بين هذه الأحداث وجيل صحيح الجدد cardiomyocyte. وهذا يخلق تعقيدات فريدة من نوعها لتكرار الحمض النووي والتعبير عن تحركات تعتمد على السيكلين في العضلية لا تظهر على وجه الحصر انقسام الخلايا الحقيقية 9،10. للمساعدة في القياس الكمي للجيل الجدد cardiomyocyte، جمعنا بين تقنية أنشئت العزلة نوى، ووضع العلامات المناعي من المواد محيط بالمريكز 1 (PCM1) لتحديد نوى cardiomyocyte كما وصفها برغمان وآخرون 7،11 مع طرق جديدة للالمدى الطويل وضع العلامات الحمض النووي وتحليل الصيغة الصبغية. PCM-1 هو بروتين الجسيم المركزي التي تتراكم على سطح النووي متباينة، myocytes غير ركوب الدراجات. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الأجسام المضادة ضدPCM-1 تسمية تحديدا نوى cardiomyocyte 7،11 وكما تم استخدام هذا PCM1 من قبل عدد من جماعات مستقلة لتحديد العضلية 1،12،13. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا أن PCM1 التعبير خرائط لنوى cardiomyocyte المسمى وراثيا في نموذج لجنة المساواة العرقية تي ان تي المعدلة وراثيا الماوس 14 (الشكل التكميلي 1). بروتوكول صفها هنا يمكن تحديد دقيق وحساس من جيل cardiomyocyte نوى الجدد في قلب فأر، بغض النظر عن أصول الخلوية (الشكل 1A و B) مع استبعاد في نفس الوقت وضع العلامات نوكليوزيد بسبب polyploidization من التحليل (الشكل 1C و D). على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن السيطرة على ازدواجية النواة cardiomyocyte، لأنها تتيح الكمي السريع والقوي من نوى الجدد cardiomyocyte وهو مطلوب لتقدير دقيق لدوران cardiomyocyte. علاوة على ذلك،أنه يوفر أداة الفرز السريع لتقييم التغيرات المحتملة في ديناميات الجيل cardiomyocyte. في حين وصفها الحمض النووي وعادة ما ينطوي 5-برومو-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) كما التناظرية ثيميدين، وبروتوكول الموصوفة هنا يستخدم فحص 5-إيثينيل-2&#39;-deoxyuridine (EDU) استنادا لأنه يتطلب خطوات المعالجة أقل لأسرع من خلال-وضع ولا يتطلب تغيير طبيعة الحمض النووي للالمناعية الكشف، مما يجعلها متوافقة مع بروتوكولات المناعية الأخرى، وبالتالي زيادة التطبيقات المصب المحتملة لهذه الطريقة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> الشكل 1: ينبض المستمر مع ايدو تسميات الجدد العضلية بغض النظر عن الأسلاف الخاصة بهم. أدرج (A) EDU في الحمض النووي العضلية أثناء انقسام الخلية. وانتشار بين السكان cardiomyocyte بالنتيجهتي في زيادة أو استبدال الخلايا العضلية وهو توليف الحمض النووي وبالتالي إنتاجية (يساهم في صيانة الأنسجة وإصلاح). أدرج (ب) EDU في الحمض النووي للخلايا السلف القلب أثناء انقسام الخلية. سيتم الاحتفاظ هذا في الخلية خلال التمايز إلى النسب cardiomyocyte. وهذا تمايز الخلايا الجذعية يؤدي أيضا إلى زيادة في عدد الخلايا العضلية، وبالتالي يساهم في صيانة الأنسجة والإصلاح. (C) العضلية لديها القدرة على الخضوع لتكرار الحمض النووي &quot;غير منتجة&quot; مما أدى إلى زيادة الصيغة الصبغية cardiomyocyte، الذي يرتبط مع تضخم cardiomyocyte وإعادة عضلة القلب، ولكن لا يحل محل العضلية المفقودة. عملية polyploidization تختلف عن ازدواجية النواة كما أنه يؤدي إلى cardiomyocyte مع نواة واحدة والذي يحتوي على أربعة أو أكثر من مجموعات من اثنين من الكروموزومات المتماثلة (&gt; 2N). (D) وبعد نوى ص المستمرulse، يصف هذا البروتوكول العزلة النوى وتحديد نوى cardiomyocyte من التعبير PCM1 للسماح الكمي لكلا الصيغة الصبغية cardiomyocyte وايدو التأسيس. PCM1 التعبير وايدو التأسيس الكشف باستخدام التدفق الخلوي. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2038">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:501px;">0.32 M sucrose</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">84100</td>
			<td style="width:1156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c5086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM magnesium acetate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M-5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mM EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mM EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mM DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 mM KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mM spermine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td>
			<td>abcam</td>
			<td>abc7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-PCM-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">HPA023374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 F(ab&#39;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell strainers&#160; 70 &#956;m and 100&#956;m&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11597522, 11517532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10634</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for section, EdU reaction buffer,&#160; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyStain DNA 2 step kit,</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>05 5005</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe homogeniser e.g. TissueRuptor&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueRuptor Disposable Probes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:267px;">990890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Facscanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

على الرغم من أن من المسلم به أن القلب لديها امكانات محدودة لتجديد العضلية بسبب الإصابة بجانب أن انخفاض مستويات دوران cardiomyocyte تحدث أثناء الشيخوخة الطبيعية، وتحديد حجم هذه الأحداث لا يزال تحديا. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى ندرة هذه العملية وحقيقة أن مصادر الخلوية متعددة تساهم في صيانة عضلة القلب. وعلاوة على ذلك، ازدواجية الحمض النووي داخل العضلية وغالبا ما يؤدي إلى cardiomyocyte المتعددة الصبغيات ونادرا ما يؤدي إلى العضلية الجديدة عن طريق الانقسام الخلوي. من أجل تحديد بدقة التمييز دوران cardiomyocyte بين هذه العمليات أمر ضروري. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم العلامات نوكليوزيد على المدى الطويل من أجل تسمية كل نوى التي نشأت نتيجة لنوى تكرار الحمض النووي وcardiomyocyte التي تم تحديدها من خلال الاستفادة من العزلة النوى وimmunolabeling PCM1 لاحق. معا وهذا يسمح بتحديد دقيق وحساس من وضع العلامات نوكليوزيد من جardiomyocyte السكان أنويتها. وعلاوة على ذلك، 4 &quot;، ووضع العلامات وتحليل الصيغة الصبغية أنويتها 6 diamidino-2-phenylindole، يمكن التمييز نوى الجدد cardiomyocyte من نوى التي أدرجت نوكليوزيد خلال polyploidization. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن السيطرة على ازدواجية النواة cardiomyocyte، لأنها تتيح الكمي السريع والقوي من نوى الجدد cardiomyocyte بينما يمثل polyploidization. هذا الأسلوب لديه عدد من التطبيقات المصب بما في ذلك تقييم العلاجات المحتملة لتعزيز تجديد cardiomyocyte أو التحقيق في آثار أمراض القلب على دوران cardiomyocyte والصيغة الصبغية. هذا الأسلوب هو أيضا متوافقة مع تقنيات immunohistological المصب إضافية، مما يسمح الكمي التأسيس نوكليوزيد في جميع أنواع الخلايا في القلب.

يسمح هذا الأسلوب الكمي لزيادة دمج EDU بسبب انقسام نواة cardiomyocyte في حين السيطرة على زيادة polyploidization. عن طريق فحص BrdU القائمة، ونحن أثبتنا سابقا أن قلب الثدييات يستجيب لفقدان cardiomyocyte المزمنة، في نموذج الفأر MDX ضمور العضلات دوشين، مع تجديد الخلايا العضلية الجديدة. وقد استخدمنا الأساليب المذكورة هنا لمزيد من التحقق من صحة النتائج التي نشرت لدينا، وإثبات فائدة من البروتوكول. وفقا للبروتوكول وصفها. ونابض الكبار (12 أسبوع من العمر) MDX والسيطرة الفئران bl10 مع الحقن اليومي واحدة من ايدو لمدة 7 أيام، وذكرت في وقت سابق للسماح للتحليل إحصائيا بين المجموعات التجريبية 5،13. تحليل Immunohistological القلوب نابض يوضح وجود PCM1 التعبير العضلية التي أدرجت ايدو (الشكل 3A). النقيب ومع ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليهاز طرق immunohistological يمكن أن يساء تفسيرها، وأنواع الخلايا الأخرى التي أدرجت ايدو يمكن أخطأ في التعرف كما العضلية. ويتجلى مثال على هذا في الشكل 1A التكميلي وباء. وعلاوة على ذلك أساليب immunohistological لا تميز polyploidization من الانقسام النووي. تدفق تحليل الخلوي بالتفصيل في هذا البروتوكول تمكن الكمي السريع لتقسيم النووي cardiomyocyte في الفئران MDX والسيطرة، مع استبعاد الخلايا التي أدرجت ايدو بسبب polyploidization. على غرار البيانات المنشورة سابقا 13، وكشف التحليل زيادة في معدلات توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte في قلوب MDX الماوس بالمقارنة مع سن يقابل الضوابط (1.2٪ مقابل 0.17٪، الشكل 3B و C). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> الشكل (3): </strong&gt; الكمي من ايدو صفت العضلية في wildtype وقلوب MDX. (أ) صورة من التوقعات Z كومة مأخوذة من 40 ميكرون أبواب سميكة من قلوب MDX. PCM-1 التعبير عن نوى cardiomyocyte (الأخضر) التي أدرجت ايدو (الحمراء). يشير السهم الأصفر EDU المسمى العضلية. الأول والثاني يشير الفردية EDU المسمى العضلية هو مبين في Z-الطائرة. وصفت نوى مع دابي (الأزرق) (B و C) التدفق الخلوي من نواة معزولة تظهر المؤامرات تمثيلية 12-13 أسبوع النوع القديم البرية (C57 / BL10) والفئران MDX (MDX - / ص على C57 / خلفية BL10). (ب) رسم بياني يظهر دابي كثافة والتمييز بين 2N و&gt; 2N نوى. (C) المؤامرات التي تبين التأسيس ايدو في عدد السكان نوى 2N cardiomyocyte عند تحليلها على النحو المفصل في هذا البروتوكول. لجميع الفئران كانت تدار ايدو ل1 أسبوع من 12 أسابيع من العمر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الشكل التكميلي 1: PCM-1 هو علامة معينة لنوى cardiomyocyte باستخدام بروتوكول وصف تم عزل نواة من الماوس المعدلة وراثيا المزدوج التي تنتجها عبور الفئران TNT-لجنة المساواة العرقية 14 مع ROSA NT / NG خط مراسل لجنة المساواة العرقية حساسة 16. في ينجم عن ذلك من تفعيل الماوس لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة تروبونين تي (TNT) المروج يؤدي إلى التعبير لا رجعة فيه GFP مع المترجمة إلى نوى. وصفت نوى مع isotype السيطرة (ايزو) يدل على القدرة على تحديد GFP معربا عن cardiomyocyte نوى السكان (488/530/30-A). وضع العلامات من نوى مع مكافحة PCM1 (الضد الثانوية الكشف عنها بواسطة 633-660 / 20-A) يدل على ارتباط التعبير PCM1 مع cardiomyocy GFP التعبيرالسكان أنويتها الشركة المصرية للاتصالات. في هذا المثال 98.8٪ من نوى cardiomyocyte كما حددها نشاط المروج تي ان تي، وصفت من قبل PCM1 الأجسام المضادة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل الشكل التكميلي 1.</a> معارض التحديات لقياس تجديد cardiomyocyte بواسطة تقنيات immunohistological (A) 2D صورة اثنين PCM-1 التعبير عن نوى cardiomyocyte (الأخضر) التي يبدو أنها وصفت أيضا لايدو (الأحمر): الشكل التكميلي 2. وتشير الأسهم الصفراء على ما يبدو العضلية التي أدرجت ايدو. هذا ويرجع ذلك إلى ظاهر شارك في توطين التعبير PCM1 وEDU الوسم عندما تصور باستخدام التصوير 2-dimentional. (ب) إسقاط 3-الأبعاد من هذه الصورة يحدد ايدو وصفت الخلايا ليست العضلية ولكن هي خلايا غير cardiomyocyte المغطي PCM1 معربا عن نوى cardiomyocyte. الفئران C57 / BL10 في 12 أسابيع من العمر المستخدمة في التجارب. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل التكميلي الشكل 2A.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل التكميلية الشكل 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> مكونات رد فعل </td><td colspan="2"> عدد من ردود الفعل </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> 875 ميكرولتر </td><td> 2.19 مل </td></tr><tr><td> بروتيكتانت النحاس </td><td> 20 ميكرولتر </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> صبغة الفلورسنت picolyl أزيد </td><td> 5 ميكرولتر </td><td> 12.5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> رد فعل مخففالمخزن المؤقت أعد 4.1 </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> 250 ميكرولتر </td></tr><tr><td> إجمالي حجم رد الفعل </td><td> 1 مل </td><td> 2.5 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 2: ايدو المكونات كوكتيل. وصفة لEDU الوسم كوكتيل المطلوبة في القسم بروتوكول 4 (الكشف عن EDU التأسيس).

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

التحضير للثقافات الجرذ دبقية قليلة التغصن السلف والكمي لOligodendrogenesis عن طريق ثنائي الأشعة تحت الحمراء الضوئي الإسفار

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...