Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

<ol>
	<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes:+practical+procedure,+interpretation+and+application.">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li><li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses.">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li><li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver,+brain,+and+spinal+cord:+factors+limiting+quantitative+analysis.">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li><li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity.">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li><li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li><li>Rollenhagen, A., L&#252;bke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+excitatory+central+synapses:+from+structure+to+function.">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li><li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses.">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li><li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus.">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li><li>Ny&#236;ri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus.">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li><li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure,+size,+ionotropic+receptor+expression,+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Amano, T., Unal, C. T., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala.">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li><li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear.">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li><li>J&#252;ngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction:+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala.">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li><li>Asede, D., Bosch, D., L&#252;thi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning.">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices.">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li><li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information.">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li><li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes.">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li><li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction.">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li><li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression.">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li><li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience.">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li><li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R., Cavalier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+Freeze-fracture+replica+labelling+(SDS-FRL).">SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL).</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 567-586 (2007).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li><li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum.">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex.">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Freeze-kırık elektron mikroskobu 40 yılı aşkın bir süredir ultrastrüktürel araştırma önemli bir teknik olmuştur. Ancak, membran moleküler kompozisyon çalışmak için etkin araçların eksikliği kullanımında önemli bir düşüş üretti. Son zamanlarda, bağlı immünolojik etiketleme 1, 2, yani FRIL tekniği ile yekpare zar proteinleri ortaya çıkarmak için etkin yolların geliştirilmesi için donma-fraktür elektron mikroskopisi büyük bir canlanma olmuştur. FRIL teknik diğer immünolojik ultrastrüktürel metotlardan fazla birkaç avantaj sahiptir. İlk olarak, proteinler, duyarlılığı artırmak antikorlara kolaylıkla temin edilebilir. İkincisi, çoğaltma iki boyutlu yüzey üzerinde böyle postsinaptik membranın olarak plazma zarı uzmanlık, büyük kısmının poz seri &#39;zahmetli ve zaman alıcı yeniden olmadan ilgi moleküllerin mekansal dağılımı ve fiziksel bitişiklik denetlenmesine izin veriral ince kesitler. Üçüncü olarak, plazma zarının iki yarısı mevcudiyeti, her bir yapı için etiketlenebilir proteinlerin sayısı, Resim uygun antikorlar mevcuttur arttırır. kırılma üzerine bölme zarın hidrofobik yüzü kırık yüzey üzerinde kalan protein etki güçlendirmektedir karbon platin ile kaplanır. Bu durum, bu etki antijenlerine karşı antikorların erişimi engeller. Bir yineleme P-yüzünde Örneğin protoplazma alan bakan tek epitopu ise, sadece antikor ile bağlı olabilir exoplasmic alan bakan epitoplar e-yüzünde, antikorlar ile tespit edilebilir (bakınız Şekil 2). Öte yandan, FRIL tekniği de bazı sınırlamalar 2 uğrar. kırıklar rasgele olarak belirli hücreler ya da yapıların hedef zor olabilir. Bu aynı zamanda fra farklı olasılık verilen, sinaps koleksiyonunda, örneğin bir örnekleme yanlılığı, yol açabilirFarklı eğrilik (milleri karşı örneğin, dikenler) yapıların zar boyunca cturing. Ayrıca, iki yüzlerinden birine zar proteinlerinin ayırma tahmin edilemez. Bu nedenle, P-yüze ya da E-yüzüne bir protein dağılımı, özellikle de niceliksel çalışmalar için, dikkatle hücre içi ve hücre dışı etki reaktif antikorları kullanılarak incelendi gerekir. sadece morfolojik özelliklere dayalı Son olarak, bu tür presinaptik akson terminalleri gibi bazı yapıların yinelemedeki tanımlanması zor olabilir. Bununla birlikte, işaret proteinleri için spesifik antikorların kullanımı veya etiketli integral membran proteinleri ya da ek araçlar viral vektörler sunar kullanılarak kanalların iletim kırılan membran belirlenmesini kolaylaştırmak için. Örneğin, bu çalışmada, postsinaptik Beni ortaya μ-opioid reseptörleri için amigdala ve etiketleme aksonal eferent nöronları tespit etmek talamik nöronlarda ChR2 YFP transdüksiyonu yararlandıITC nöron mbranes. başarılı bir şekilde FRIL tekniği gerçekleştirmek için, özellikle dikkat doku fiksasyon ilgili alınmalıdır. Güçlü doku fiksasyonu (&gt;% 2 paraformaldehid) çapraz kırık yüksek oranda ve etiketleme duyarlılığında azalmaya neden olabilir. Öte yandan, zayıf tespitler doku işleme ve hazırlama (bölümlerin örneğin, kesme) zorlaştırır. Kesilmiş blok kalınlığı çift taraflı bant kalınlığını eşleştiğini kontrol etmek de önemlidir. Numunenin kalınlığı bandının daha düşük ise, doku yüzeyleri iki metal taşıyıcı yüzeyine bağlanır olabilir, buna bağlı olarak, dondurulmuş numune parçalanmış değildir. Doku kalın ise iki bakır taşıyıcıların sandviç yapıldığında, bu kaçınılmaz yapısal bozukluklar ile sıkıştırılmış olacaktır. Numune kırılmış olan sıcaklık (Bu protokol, -115 ° C), aynı zamanda önemli bir rol oynamaktadırçoğaltma yapısı. Daha yüksek sıcaklıklar, bu tür önceki ya da buharlaşma sırasında doku yüzeyi üzerinde su buharının yoğunlaşması eserler daha yüksek bir oranı üretebilir. Düşük sıcaklıklar (&lt;-125 ° C) kırılma sırasında malzemenin kapalı bölme riskini artırabilir. Bu malzeme numune yüzeyi üzerine düşmesine ya da ona bağlı kalabilir. Malzemenin bu pulları da kaplanmış ve görüntü üzerinde koyu lekeler üreten tezat vardır. Daha düşük sıcaklıklarda, özellikle kırılma dendritik dikenler küçük ince yapılar için enine kırık sıklığını etkileyebilir. kopyaları hazırlanmasında bir başka kritik bir adım deterjan sindirim olduğunu. sindirim eksik ise, sindirilmemiş doku TEM de yapının analizini karıştırıcı, çoğaltma koyu lekeler belirir. Ayrıca, sindirilmemiş doku arka plan etiketleme artan non-spesifik tuzak veya bağlanan antikorlar olabilir. deterjan Diğer yandan, kullanımıDoku sindirimi için s ikincil ve üçüncül yapıları değiştirerek çoğaltma ilişkili molekülleri denatüre olabilir. Bu nedenle, bazı antijenler için yavaş yavaş ilave yıkama adımları ile SDS seyreltilmesi için gerekli olabilir. immunolabeling, ikincil antikorlara konjuge altın partikülü farklı boyutlarda mevcudiyeti, aynı zamanda tespit sağlar, ama sadece nitel, hatta postsinaptik uzmanlık olarak plazma zarının spesifik mikro bölgeler çok sayıda proteinler. Ancak, sterik engel nedeniyle, sayısal çalışmalar genel olarak tek bir molekülün saptanması ile sınırlıdır. altın parçacığı boyutu da markalama etkinliğini etkileyebilir. FRIL etiketleme yorumlanması için, bunun nedeni esnek karmaşık forma immunogold parçacık antijen 20-25 nm yarıçaplı bir hemisfer içinde herhangi bir yerde bulunabilir akılda tutulmalıdırBirincil ve ikincil antikor 26 ile ed. Teori ve FRIL ve ilgili tekniklerin uygulamaya hakkında daha fazla bilgi için, diğer metodolojik makaleler 27, 28&#39;e de okuyucu bakın. FRIL tekniği son zamanlarda 30. Ayrıca, AMPA-R için FRIL tekniğinin algılama hassasiyeti bir işlevsel AMPA başına bir immunogold parçacık olarak yüksek olarak tahmin edilmiştir çeşitli sinaps popülasyonlarında 29, glutamat reseptör lokalizasyonu yüksek çözünürlüklü sayısal analizler için kullanılmıştır -R kanal 29. Böylece, bu yaklaşım ölçmek ve merkezi sinapslarda AMPA-R ve NMDA-R postsinaptik ifade desen analiz etmek genel olarak çok faydalıdır. Burada, PIN / MGN-ITC sinaps uygulanabilirliğini, korku klima sırasında ABD bilgi geçişi için büyük olasılıkla önemli bir site gösterdi. AMPA reseptör alt birimlerinin Glu yüksek derecede korunmuş hücre-dışı amino asit kalıntıları karşı artan bir antikor kullanılarakA1-GluA4, biz postsinaptik membran uzmanlık karşılık gelen IMP kümeler içinde altın parçacıkları eşit dağılımını bulundu. ITC dikenler AMPA-R yoğunluğu PIN / MGN talamik afferentleri tarafından hedeflenen şaft sinaps göre anlamlı derecede yüksek bulundu. Her iki omurga ve şaft sinaps, AMPA-R için etiketleme ve postsinaptik alanı arasında pozitif bir korelasyon, diğer glutamat sinaps 25 ortak bir özellik tespit edildi. PIN / MGN-ITC sinapslarda AMPA-R yoğunluğu düşük varyans kortikal sinaps 25 den talamik efferentler 7 tarafından oluşturulan diğer sinaps benzer, ancak farklı bir homojen dağılımını göstermektedir. Tersine, NMDA-R yoğunluğu daha değişken ve AMPA-R farklı bir düzenleme düşündüren omurga ve mil sinaps arasında fark yoktu. Gelecekte, FRIL tekniği yüksek tekrarlanabilirliği sadece merkezi sinaps bazal molekül bileşimi değerlendirmek için izin vermez, ancak c saptanmasını kolaylaştırabilirkorku öğrendikten sonra iyonotropik glutamat reseptör numaraları ve subsynaptic dağılımındaki Hanges, bu girdilerin öncesi ve postsinaptik özellikleri ex-vivo kayıtları tamamlayan. girdilerin kökeni ve postsinaptik unsurların doğa ve kompozisyon disentangling önemli ama sorunlu olduğu Sonuç olarak, bu yaklaşım diğer birçok nöral devrelerde giriş özgü uyarıcı sinaps yapı-işlev ilişkilerinin içine anlayışlar kazanmak için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir .

nanometre ölçeğinde biyomembranlar fonksiyonel mimarisi tanımı transmisyon elektron mikroskobu için uygun immün bir takım teknikler geliştirilmesi ile son yıllarda öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler, örneğin, ön ve son gömme immünolojik, antijenlere ve / veya zar-bağlı protein sınırlı kantitatif bir değerlendirme zayıf algılama dahil önemli sınırlamalar, bir dizi vardır. Bu sınırlamalar, hücre çeşitliliği ve sinaps heterojen yüksek derecede ile karakterizedir sinir sistemi, ince yapısı soruşturma özellikle kritik hale gelir. Ön ve postsinaptik elemanları ya da diferansiyel ekspresyonu, zenginleştirme veya bu reseptörlerin taşıyıcılar ve efektör molekülleri olarak sinyal proteinleri arasındaki etkileşim tarafından dikte yapısal ve işlevsel farklılıklara bu heterojenite sonuçlanır. Doğrudan immunolabe için yeni bir yaklaşımDeterjan-çözünür donma-fraktür kopyaları (FRIL) integral ya da çapraz-bağlanmış membran proteinlerinin Ling ilk iki yıl önce 1 Fujimoto tarafından ortaya atılmıştır. Bu orijinal bir yöntem vardı, ancak, çeşitli sınırlamalar, yani beyin gibi karmaşık dokularda ayrı ayrı eşlenen hücreleri ile etiketlenmiş moleküllerin anlamlı korelasyon engel kopyaları, şiddetli parçalanması. Yaklaşık 10 yıl önce, Shigemoto ve Fukazawa giderek tekniği 2 düzeldi. Bu da önemli ölçüde gap junction 3 çalışması için, özellikle tekniği geliştirilmiş Colorado State University Boulder laboratuarlarında, bilim adamları başka bir grup çabaları paralel edildi. dondurularak kırılma protokolleri ve makinelerde iyileştirme, hem de (yüksek basınç altında) Hızlı dondurma giriş, Hi araştırmacılar nispeten büyük boyutta ve örneklerin kesintisiz kopyalarını üretmek için izin verirsınırlamaları ve güçlü kimyasal tespitler tarafından üretilen eserler olmadan en hücresel bileşenlerin gh kaliteli görüntüler. FRIL tekniği öncesi ve postsinaptik bir plan görünüşüdür ek avantajı, beyin gibi, karmaşık doku içinde bir ya da daha fazla eşleştirilmiş histolojik olarak (aynı anda) protein ve sitolojik tanımlanan hücrelerin in situ tespiti bir yüksek kantitatif büyük avantajı sunar tek bir çoğaltma unsurları. Bu nedenle, FRIL tekniği, birçok teknik engellere rağmen, özellikle bireysel sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin korelasyonu için, çok önemli bilimsel buluşlar bir dizi için umut vaat ediyor. Son birkaç on yılda, büyük bir bilgi anlaşma moleküler makyaj, yapısı üzerinde elde edilmiştir, ve sinapsların fizyolojik fonksiyonu; Henüz sinaps morfolojik ve moleküler oldukça çeşitli öncesi ve postsinaptik pa bağlı olankira nöronlar 4. Sadece sinaps türleri bir avuç yapı-fonksiyon şimdiye kadar yapılan çalışmalar 5-7 başarılı idi. Bu durum öncesi ve postsinaptik unsurların doğa kesin bir kimlik engelledi teknik kısıtlamalar çoğunlukla oldu. Ultrastrüktürel analiz sinaptik iletim gücü ve plastisite üzerinde büyük bir etkisi vardır nörotransmiter reseptörleri 6 farklı sinaptik kişileri arasında hem sinaptik boyutu ve içeriği bakımından postsinaptik membran uzmanlık değişkenliği, içine kritik bilgi sağlamaktadır. Bundan başka, bir araştırma büyük bir gövde sinaps farklı ifade iyonotropik glutamat reseptörlerinin sayısının afferent- ve hedef-bağlı bir şekilde 7-10 düzenlendiğini gösterir. Burada, bir yöntem define postsinaptik membran uzmanlık yapısı ve reseptör kompozisyon analizi izin veren ana hatlarıylad presinaptik elemanları ve işlevi. Bu yaklaşım, Channelrhodopsin2 (CHR2) geliştirilen yeni ışığa duyarlı alg proteinler, presinaptik ifade yararlanır ve FRIL tekniğin α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic postsinaptik sentezleme modelini analiz asit (AMPA-R) ve N-metil-D-aspartat (NMDA-R) glutamat reseptörleri. Bu amigdala (ITC) ve interkelatlaşmış hücre kütlelerinin nöronlar üzerine arka talamik-medial genikülat çekirdekleri (PIN / MGN) kaynaklanan aksonlar oluşturduğu sinaps gösterilmiştir. ITC nöronlar bazolateral amigdaloid kompleksi (BLA) 11, 12 çevreleyen kümeler düzenlenen küçük dikenli GABAerjik hücrelerdir. ITC nöronlar BLA ana nöronlardan eksitatör sinyaller almak ve (CEA) merkez çekirdeğini hedef bilinmektedir, bu nedenle bir inhibitör kapısı olarak işlev bilgi için BLA ve CEA 12-15 arasında akar. Son zamanlarda, biz IT gösterdiBLA ve CEA arasında medio-dorsal kümede bulunan C nöronlar da korku Pavlovian işitsel korku klima 16 sırasında öğrenme üzerine değiştirilmiş duyusal talamik ve temporal kortikal bölgelerde, direkt ve yakınsak eksitatör sinyaller alırlar. Korku şartlandırma beyin mekanizmaları açısından birleştirici öğrenme en iyi anlaşılan biçimlerinden biridir. Korku klima, başlangıçta nötr koşullandırılmış uyaran (CS, örneğin, bir ton) bir CS-ABD dernek sonuçlanan bir caydırıcı koşulsuz uyarıcı (ABD, örneğin, bir hafif ayak şoku) ile eşleştirilmiş ve korku tepkisi 17, 18 şartına bağlıdır. Eksitatör CS ve ABD temsil eden bilgiyi taşıyan talamik ve neokortikal alanlar, hem giriş, sırasıyla, amigdala (LA) yanal çekirdeğin piramidal nöronlar üzerine yakınsama ve plastisite 19 geçmesi biliniyordu. Bizim önceki çalışma duyusal giriş bilgileri ITC nöronlar geçirilen paralel de olduğunu ortaya koydu <s&gt; 16 kadar. Bireysel duyusal girdi mekanistik moleküler analiz doğru bir ilk adım ITC nöronlar üzerine sinapsların, biz ChR2 sarı floresan protein (YFP) ile etiketlenmiş ifade etmek için bir adeno-ilişkili virüs (AAV) kullanılır. AAV PIN / MGN enjekte edildi ve akson terminalleri ChR2 YFP bunların ifadesi ile belirlenmiştir. Biz PIN / MGN akson terminalleri tarafından ITC nöronlar ile oluşturulan sinaps postsinaptik AMPA-R ve NMDA-R yoğunluğunu değerlendirmek için FRIL tekniği ile üretilen, her iki yüzü kullanılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde EM grade</td>
			<td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td>
			<td>AGR1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated picric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P6744-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H20</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4-2H2O&#160;</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1063451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4N NaOH</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>T198.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental</td>
			<td>Sandoz, Austria</td>
			<td>5,133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenPure ultrapure water system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>50131235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>ISMATEC, Germany</td>
			<td>ISM 930C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td>
			<td>MN 615 1/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibroslicer, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scalpel</td>
			<td>Alcon Laboratories, USA</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion cannula</td>
			<td>Vieweg, Germany</td>
			<td>F560088-1</td>
			<td>can be replaced by similar items from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">High-pressure&#160; Freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper carriers</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td>
			<td>528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sidol Polish</td>
			<td>Henkel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamois skin</td>
			<td>Household supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole punch, 1,5mm</td>
			<td>Stubai, Austria</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatured ethanol</td>
			<td>Donauchem, Austria</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aceton</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>9372.5</td>
			<td>CAUTION!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td>
			<td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td>
			<td>HPM010</td>
			<td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAUTION!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>E309.1</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoCane</td>
			<td>Nalge Nunc International,USA</td>
			<td>5015-0001</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSleeve</td>
			<td>Nalge Nunc International,USA</td>
			<td>5016-0001</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage vessel</td>
			<td>Cryopal, France</td>
			<td>GT38</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td>
			<td>Werner &#38; Mertz Professional, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Freeze-fracture and Replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td>
			<td>JOKE Joisten &#38; Kettenbaum, Germany</td>
			<td>SANDURET 2-K</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&#181;</td>
			<td>JOKE Joisten &#38; Kettenbaum, Germany</td>
			<td>955932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Fracture System BAF 060</td>
			<td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td>
			<td>BAF060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic 12 well plate</td>
			<td>Gr&#246;pel, Austria</td>
			<td>14511</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>T3253</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5136.1</td>
			<td>CAUTION! ;&#160; can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>1,076,871,000</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5429.3</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Hybridization Oven</td>
			<td>Binder, Germany</td>
			<td>7001-0050</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunolabelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td>
			<td>Frontier Institute, Japan</td>
			<td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td>
			<td>ImmunoStar, USA</td>
			<td>24216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody</td>
			<td>BBInternational,</td>
			<td>EM.GAG5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody</td>
			<td>BBInternational,</td>
			<td>EM.GAR15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td>
			<td>AURION, Netherlands</td>
			<td>DAR 10nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td>
			<td>&#160;Agar scientific, UK</td>
			<td>G2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Major Science, USA</td>
			<td>MO-RC</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioloform Powder</td>
			<td>&#160;Agar scientific, UK</td>
			<td>R1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>CAUTION! ;&#160; can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM120 TEM</td>
			<td>Philips/FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada CCD camera</td>
			<td>Soft Imaging Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td>
			<td>Soft Imaging Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

Freeze-kırık elektron mikroskobu 40 yılı aşkın bir süredir ultrastrüktürel araştırma önemli bir teknik olmuştur. Ancak, membran moleküler kompozisyon çalışmak için etkin araçların eksikliği kullanımında önemli bir düşüş üretti. Son zamanlarda, immünolojik etiketleme ile yekpare zar proteinleri ortaya çıkarmak için etkin yolların geliştirilmesi için donma-fraktür elektron mikroskobu sayesinde önemli bir canlanma olmuştur. Bu yöntemlerden biri, deterjan-çözünür donma-fraktür çoğaltma immün (FRIL) olarak da bilinir. optogenetics ile FRIL tekniğinin kombinasyonu merkez sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili analiz sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, tespit ve etiketli channelrhodopsin ilgili ifadesi ve özel moleküler belirteçleri ile öncesi ve postsinaptik nöronların iki karakterize edilmesi mümkün olur. glutamat postsinaptik membran uzmanlık ayırt edici bir görünümerjik ölçmek ve bu reseptörlerin intrasynaptic dağılımının analizi için, daha sinapsların iyonotropik glutamat reseptörlerinin etiketlenmesi üzerine verir. Burada, eşleşmiş kopyaları ve bunların nasıl immunolabel hazırlamak için gerekli prosedürlerin adım adım tanımını verir. Biz de, potansiyel örnekleme önyargıları ile ilişkili özellikle de FRIL tekniğinin uyarılar ve sınırlamalar ele alınacaktır. optogenetics ile kombine edildiğinde FRIL tekniği yüksek tekrarlanabilirlik ve çok yönlülük, beyinde tespit nöronal mikrodevreler sinaptik iletim farklı yönlerini karakterizasyonu için çok güçlü bir yaklaşım sunuyor. Burada, bu yaklaşım fare amigdala interkalar hücre kütlelerinin nöronlar da uyarıcı sinaps yapı-işlev ilişkilerinin içgörü kazanmak için nasıl kullanıldığını bir örnek oluşturmaktadır. Özellikle, belirlenen girişlerin iyonotropik glutamat reseptörlerinin ekspresyonunu araştırdık veyatalamik arka intralaminar ve medial genikülat çekirdeklerine iginated. Bu sinapslar korku öğrenme için uygun duyusal bilgiyi röle ve korku klima üzerine plastik değişikliklere gösterilmiştir.

FRIL tekniği, mikrobiyal orijinli 21, örneğin, plazma membranında entegre ve etkili aksonları boyunca anterogradely taşınan kanallar Optogenetic aktüatörlerin ifadesi ile bir araya getirildiğinde, belirli bir alt grup niceliksel olarak AMPA-R ve NMDA-R postsinaptik ifade incelemeye olanak sağlar sinaps. Bu amigdala ITC nöronlar üzerine (örneğin, PIN / MGN) farklı talamik çekirdeklere kaynaklanan aksonlar için burada gösterilir. Bu yaklaşım, ITC nöronlar, şimdiye kadar ayrıntılı bir anatomik ve moleküler karakterizasyonu dirençli olan hücrelerin bir grup üzerinde ayrı ayrı duyusal girdi sinaps moleküler analiz edilmesini sağlar. Dört hafta PIN / MGN içine rAAV-ChR2 YFP stereotaktik enjeksiyonundan sonra, ChR2 YFP pozitif aksonlar yoğun LA, amygdalostriatal geçiş alanı (Astria) ve medial paracapsular I inerve<html> Amigdala TC küme, önceki izleme ile tamamen uyumlu bir desen 22, 16 inceler. Biz de rAAV-ChR2 YFP- gelen donma-kırık çoğaltma akson ve terminallerin P-yüzünde ChR2 YFP için immün yoğun altın tespit enjekte edilen fareler (Şekil 5A), ancak olmayan enjekte edilmiş farelerden alınan yinelemede. Bir yineleme glutamaterjik sinaps postsinaptik membran uzmanlık plazma zarı 2, 23 E-yüzünde zar içi parçacıklar (IMPS) bir küme olarak görülebilir ve sıklıkla presinaptik plazma zarı 7 P yüze eşlik ediyor (Şekil 5B-C). PIN / MGN akson terminalleri tarafından oluşturulan glutamaterjik sinaps postsinaptik uzmanlık belirlemek için izin Bu özellikler (Şekil 5 ve 6). Bu NMDA Rs esas NR1 alt birimine karşı bir antikor kullanılarak tespit edilmiştir, oysa tüm dört alt birimden (GluA1-4) tanıyan bir antikor ile AMPA-R etiketli. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; ntent 1 &quot;&gt; Bu sinapsların dendritik dikenler veya ITC nöronların milleri ile yapılmış olup aynı çoğaltma tespit araçlarının eksikliği nedeniyle, biz u için gelen çoğaltma yüzünü etiketli ITC nöronlar bu reseptörlerin 24 postsynaptically yüksek seviyelerde ifade şekilde -opioid reseptörleri. Bu yerler kullanan bir strateji kullanarak iki yineleme (Şekil 5C-F Şekil 6A-B) &#39;de, aynı postsinaptik profillerin tespit gerekir (Şekil 4E) . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Şekil 5. immunogold Parçacıklar tarafından Replica üzerinde ChR2 YFP ve iyonotropik glutamat reseptörlerinin, algılama. (A) çapraz kırık akson terminali (açık mavi) ve ChR2 YFP tespit 15 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş olan P-yüzünün küçük porsiyonlarda. terminal içinde membran Of sayıda sinaptik kesecikler gözlenebilir (SV). plazma membran ile sınırlı büyük ölçüde immunolabeling özgüllüğünü edin. ChR2 için Etiketleme PIN / MGN oluşan en terminali tanımlar. Terminal bir omurga ile asimetrik sinaps oluşturur. E-yüzünde postsinaptik zar uzmanlık (PSD) zar içi parçacıkların karakteristik kümesini gösterir ve AMPA-R ortaya 5 nm altın parçacıkları ile etiketlenir. (B) (15 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş), bir ChR2 ifade akson p-yüzü, iki dendrit onları NMDA Rs ortaya 5 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş iki PİO&#39;ların sahip birini çevreleyen gösterilmiştir. (CD) PIN / MGN-ITC sinaps öncesi ve postsinaptik membran Karşısı yüzleri. (C) terminalinin P-yüzü (15 nm altın parçacıkları ile etiketli) ChR2 ifade ve iki dendritik milleri, onları AMPA-R (5 nm altın parçacıkları) için etiketli iki PSDS içeren birinin e-yüze boyunca uzanır. ( <strong&gt; D) iki dendritler karşılık gelen P-yüz μ-opioid reseptörlerin (10 nm altın parçacıkları) etiketlenmiştir. (EF) kesik çizgilerle belirtilen alanların Genişletilmiş manzarası. Ölçek çubukları:. 500 nm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> PIN / MGN-ITC sinapslarda AMPA-R için İmmün parçacıklar postsinaptik uzmanlık (Şekil 5E) içinde homojen bir dağılım düşündüren, tüm IMP küme üzerinde bulundu. Bir anlamlı olarak daha yüksek (eşleşmemiş t-testi p &lt;0.018) AMPA-R etiketleme yoğunluğu PIN / MGN gözlendi ITC dikenler üzerine sinapsların (715 ± 38 altın parçacıkları / mikron 2, n = 32) ITC dendritler üzerine sinapsların karşılaştırıldığında (590 ± 44 altın parçacıkları / um 2, n = 32). Genel olarak, PIN / MGN-ITC sinapsların AMPA-R yoğunluğu nispeten düşük gösterdiVaryans (varyans katsayısı, CV = 0.37) homojen bir dağılım tutarlı. PIN / MGN-ITC sinapslarda NMDA Rs İmmün genellikle düzensiz postsinaptik IMP kümeleri (Şekil 5B) içinde dağıtılan gözlenmiştir. NMDA-R etiketleme yoğunluğu (eşleşmemiş t-testi, p = 0.39) PIN / MGN ITC dikenler üzerine sinapsların arasında benzerdi (1070 ± 153 altın parçacıkları / mikron 2, n = 8) ve ITC dendritler (812 ± 183 altın parçacıkları / um2, n = 9). AMPA-R gözlendi aksine ne PIN / MGN-ITC sinapsların NMDA-R yoğunluğu (CV = 0.54) çok değişken oldu. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Belirlenen PIN / MGN-ITC Sinapslar de Şekil 6. AMPA-R ve NMDA-R ile immün. (AB) PIN / MGN-ITC öncesi ve postsinaptik membran Karşısı yüzleriTerminalin P-yüzü ChR2 ifade eden bir dendritik omurga üzerine yapılan sinaps (15 nm altın parçacıkları ile etiketli) ve dendritik omurga üzerine PSD AMPA-R (5 nm altın parçacıkları) etiketlenmiştir. (CD) kesikli çizgi ile belirtilen alanların Genişletilmiş manzarası. Bu alanlar PSD daha iyi bir görünüm sağlamak için yaklaşık 45 ° saat yönünün tersine döndürülmüş edilmiştir. (E) ITC omurgada ve dendrit sinaptik alanına karşılık AMPA-R parçacıkların sayısının saçılım. Her iki yapılarda, pozitif bir korelasyon gözlenmiştir. (F) ITC omurgada ve dendrit sinaptik alanına karşı NMDA R parçacıkların sayısının saçılım. Anlamlı bir pozitif korelasyon sadece dendritik dikenler tespit edildi. Ölçek çubukları:. 500 nm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> çünkügenellikle kısmen postsinaptik IMP küme üste presinaptik plazma zarı P-yüz, biz sinapsların sadece% 30 sinaptik alanını tahmin olabilir (dikenler: parkı 0.032 mikron 2, aralık ortalama: 0.007 mikron 2 0.063 n = 8; dendritler: 0.047 mikron 2, aralığı: 0.024 11 mikron 2 0.166 kadar, n =). Daha önce analiz telencephalic glutamaterjik 25 sinapsların Bunlar benzer bir aralıkta idi. Her iki dikenler ve dendritler, bireysel sinapslarda AMPA-R için altın immün parçacıkları sayısının pozitif sinaptik alanı ile korelasyon (Spearman, dikenler: r = 0.88, dendritler: r = 0.60, p &lt;0.0001) (Şekil 6E). Ancak dendritler (r = 0.21, p = 0.29) (Şekil 6F içinde: Tersine, NMDA-R altın immün parçacıkları sayısını dikenler (r = 0.90, p &lt;0.002 Spearman, dikenler) sinaptik alanı ile ilişkili olduğu bulunmuştur ).

Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K Görüntüleme.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Video: Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nörobilim

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide limited information about muscle fiber membrane properties and underlying disease mechanisms. Muscle velocity recovery cycles (MVRCs) illustrate how the velocity of a muscle action potential depends on the time after a preceding action potential. MVRCs are closely related to changes in membrane potential that follow an action potential, thereby providing information about muscle fiber membrane properties. MVRCs may be recorded quickly and easily by direct stimulation and recording from multi-fiber bundles in vivo. MVRCs have been helpful in understanding disease mechanisms in several neuromuscular disorders. Studies in patients with channelopathies have demonstrated the different effects of specific ion channel mutations on muscle excitability. MVRCs have been previously tested in patients with neurogenic muscles. In this prior study, muscle relative refraction period (MRRP) was prolonged, and early supernormality (ESN) and late supernormality (LSN) were reduced in patients compared to healthy controls. Thereby, MVRCs can provide in vivo evidence of membrane depolarization in intact human muscle fibers that underlie their reduced excitability. The protocol presented here describes how to record MVRCs and analyze the recordings. MVRCs can serve as a fast, simple, and useful method for revealing disease mechanisms across a broad range of neuromuscular disorders.

Presented here is a protocol for the recording of muscle velocity recovery cycles (MVRCs), a new method of examining muscle membrane properties. MVRCs enable in vivo assessment of muscle membrane potential and alterations in muscle ion channel function in relation to pathology, and it enables the demonstration of muscle depolarization in neurogenic muscles.

Kas Hızı Kurtarma Döngüleri Kas Membranı Özelliklerini İncelemek için

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...