Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie hat seit über 40 Jahren eine wichtige Technik in Ultrastrukturforschung gewesen. das Fehlen einer wirksamen Mittel jedoch die molekulare Zusammensetzung von Membranen zu studieren erzeugt einen deutlichen Rückgang in ihrer Nutzung. In jüngster Zeit hat es eine große Wiederbelebung in Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie war aufgrund der Entwicklung wirksamer Weise zu integrale Membranproteine ​​durch Immunogoldmarkierung zeigen 1, 2, nämlich der FRIL - Technik. Die FRIL Technik besitzt mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Immunogoldmarkierung ultra. Erstens sind Proteine ​​leicht zugänglich an Antikörper, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Zweitens Exposition von großer Teil der Plasmamembran Spezialisierungen wie der postsynaptischen Membran, auf der zweidimensionalen Oberfläche des Replika ermöglicht die Inspektion der räumlichen Verteilung und physikalische Kontiguität der Moleküle von Interesse ohne aufwendige und zeitraubende Rekonstruktion serial ultradünne Schnitte. Drittens erhöht die Verfügbarkeit der beiden Hälften der Plasmamembran, die Anzahl von Proteinen, die für jede einzelne Struktur gekennzeichnet werden können, sofern geeignete Antikörper zur Verfügung stehen. Beim Brechen wird die hydrophobe Seite der geteilten Membran mit Kohlenstoff-Platin beschichtet, die verbleibenden Proteindomänen auf der gebrochenen Oberfläche verschanzt. Dies verhindert den Zugang von Antikörpern gegen Antigene in diesen Domänen. Zum Beispiel auf dem P-Gesicht einer Replik nur Epitope der plasmatischen Raum mit Blick kann nur durch Antikörper, während auf der E-Gesicht erkannt werden Epitope der exoplasmic Raum zugewandten kann durch Antikörper (siehe Abbildung 2) gebunden sein. Auf der anderen Seite leidet der FRIL - Technik auch gewisse Einschränkungen 2. Frakturen zufällig auftreten, könnte es schwierig sein, bestimmte Zellen oder Strukturen zu zielen. Dies kann auch zu einer Stichprobenverzerrung führen, beispielsweise in Synapse Sammlung, die unterschiedliche Wahrscheinlichkeit fra gegebenencturing entlang der Membran von Strukturen mit unterschiedlichen Krümmung (zB Stacheln gegen Wellen). Außerdem ist die Zuordnung von Membranproteinen zu einer der beiden Flächen nicht vorhersagbar. Daher sollte die Verteilung eines Proteins an das P-face oder E-face, insbesondere für quantitative Studien werden sorgfältig untersucht Antikörper reaktiv intrazellulären und extrazellulären Domänen verwenden. Schließlich kann die Identifizierung in der Nachbildung bestimmter Strukturen, wie präsynaptischen Axonterminalen, schwierig sein, wenn nur auf morphologischen Merkmalen basieren. die Verwendung spezifischer Antikörper für Proteine ​​Markers oder der Transduktion von markierten integrale Membranproteine ​​oder Kanäle unter Verwendung von viralen Vektoren zusätzliche Werkzeuge bietet Identifizierung der gebrochenen Membranen zu erleichtern jedoch. Zum Beispiel nahm diese Studie die Vorteile der Transduktion von ChR2-YFP in Thalamus Neuronen ihre axonalen efferents in der Amygdala oder der Etikettierung μ-Opioid-Rezeptoren zu identifizieren postsynaptischen mir zu offenbarenmbranes von ITC Neuronen. Um in Bezug auf Gewebefixierung durchführen sollte die FRIL Technik erfolgreich, besondere Sorgfalt getroffen werden. Starke Gewebefixierung (&gt; 2% Paraformaldehyd) kann in einer hohen Rate von Querbrüchen und einer Abnahme in Etikettierungs Empfindlichkeit führen. Auf der anderen Seite, schwach Fixierungen machen das Gewebe Handhabung und Zubereitung (zB Schneiden von Abschnitten) schwierig. Es ist auch wichtig zu steuern, dass die Dicke der getrimmten Blöcke entspricht der Dicke des doppelseitigen Klebebands. Wenn die Dicke der Probe niedriger ist als die des Bandes, die Oberfläche des Gewebes nicht an die Oberfläche der beiden Metallträger befestigen kann folglich die gefrorenen Probe wird nicht zerbrochen. Wenn das Gewebe dicker ist, wird es mit unvermeidbare strukturelle Verzerrungen zusammengedrückt werden, wenn das Sandwich aus den beiden Kupferträger hergestellt wird. Die Temperatur, bei der die Probe gebrochen wird (in diesem Protokoll -115 ° C) spielt auch eine wichtige Rolleauf die Struktur der Replik. Höhere Temperaturen können eine höhere Rate von Artefakten, wie beispielsweise die Kondensation von Wasserdampf auf der Oberfläche des Gewebes erzeugen, bevor oder während der Verdampfung. Niedrigere Temperaturen (&lt;-125 ° C) kann während des Fracturing-off von Material das Risiko der Spaltung erhöhen. Dieses Material kann auf die Oberfläche der Probe fallen oder ihm in Verbindung zu bleiben. Diese Flocken von Material sind auch beschichtet und Kontrast auf das Bild dunkle Flecken zu erzeugen. bei niedrigeren Temperaturen beeinflussen können Fracturing auch die Häufigkeit von Kreuzbrüchen vor allem für kleine feine Strukturen wie dendritischen Dornen. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Herstellung der Repliken ist das Detergens-Verdauung. Wenn die Verdauung nicht vollständig ist, wird das unverdaute Gewebe als dunkle Flecken auf der Replik, an der TEM die Analyse der Struktur Verwechselung. Darüber hinaus kann die unverdauten Gewebe unspezifisch Falle oder binden Antikörper, die Erhöhung der Hintergrundmarkierung. Auf der anderen Seite ist die Verwendung von Detergenss für Gewebe Verdauung können die Moleküle zu denaturieren, um die Replik zugeordnet ihre Sekundär- und Tertiärstrukturen zu verändern. Daher ist für bestimmte Antigene kann es notwendig sein, um allmählich die Konzentration von SDS mit zusätzlichen Waschschritten verdünnt. Für Immunmarkierung ermöglicht die Verfügbarkeit der verschiedenen Größen von Goldteilchen an Sekundärantikörper konjugiert gleichzeitig zu erfassen, sondern nur qualitativ, multiple Proteine, auch in bestimmten Mikrodomänen der Plasmamembran, wie beispielsweise die postsynaptischen Spezialisierung. Jedoch aufgrund sterischer Hinderung, sind quantitative Studien zum Nachweis von nur einem Molekül begrenzt. Die Größe der Goldpartikel können auch die Markierungsausbeute beeinflussen. Für die Auslegung der Kennzeichnung in FRIL, sollte es im Auge behalten werden, dass die Immun Teilchen irgendwo innerhalb einer Halbkugel mit einem Radius von 20 bis 25 nm von der Antigen aufgrund der flexiblen komplexe Form angeordnet werden kanned durch die primären und sekundären Antikörper 26. Für weitere Informationen über die Theorie und Praxis der FRIL und verwandte Techniken, verweisen wir den Leser auch auf andere methodische Artikel 27, 28. Die FRIL Technik wurde für die hochauflösende quantitative Analysen von Glutamatrezeptorlokalisierung in verschiedenen Synapsenpopulationen 29, 30. Darüber hinaus kann die Erfassungsempfindlichkeit der FRIL Technik für die AMPA-Rs wurde geschätzt , so hoch wie ein Immunogold Teilchen pro eine funktionelle AMPA kürzlich verwendete -R Kanal 29. Somit ist dieser Ansatz insgesamt sehr nützlich, um die Muster der postsynaptischen Expression von AMPA-Rs und NMDA-Rs an zentralen Synapsen zu quantifizieren und zu analysieren. Hier haben wir gezeigt, seine Anwendbarkeit bei PIN / MGn-ITC Synapsen, eine Website, die meisten wahrscheinlich wichtig für die Weiterleitung US Informationen während der Angstkonditionierung. Verwendung von einem Antikörper gegen die extrazelluläre hochkonservierten Aminosäurereste des AMPA-Rezeptor-Untereinheiten GluA1-GluA4, fanden wir eine gleichmäßige Verteilung von Goldpartikeln in IMP Clustern postsynaptischen Membran Spezialisierungen entspricht. Die Dichte von AMPA-Rs in ITC Stacheln war signifikant höher im Vergleich zu Welle Synapsen gezielt durch PIN / MGn Thalamus Afferenzen. An beiden Wirbelsäule und Welle Synapsen, eine positive Korrelation zwischen Kennzeichnung für AMPA-Rs und postsynaptischen Bereich erkannt wurde, ein gemeinsames Merkmal andere glutamatergen Synapsen 25. Die geringe Abweichung in der Dichte von AMPA-Rs im PIN / MGn-ITC Synapsen zeigt eine homogene Verteilung ähnlich wie bei anderen Synapsen durch Thalamus efferents 7 ausgebildet, unterscheidet sich aber von kortikalen Synapsen 25. Im Gegensatz dazu war die Dichte des NMDA-Rs variabler und nicht zwischen Wirbelsäule und Welle Synapsen was darauf hindeutet, eine andere Regelung als AMPA-Rs unterscheiden. In der Zukunft wird nicht nur die hohe Reproduzierbarkeit der FRIL-Technik ermöglichen die basale molekulare Zusammensetzung von zentralen Synapsen zu beurteilen, sondern kann Erkennung von c erleichternHanges in ionotropen Glutamat - Rezeptor - Zahlen und subsynaptischen Verteilung nach Angst Lernen ergänzt ex-vivo - Aufnahmen von prä- und postsynaptischen Eigenschaften dieser Eingänge. Abschließend könnte dieser Ansatz von anderen Forschern verwendet werden, um Einblicke in Struktur-Funktionsbeziehungen von Eingangsspezifischen Synapsen in vielen anderen neuronalen Schaltungen, bei denen die Herkunft der Eingänge zu entwirren und die Art und Zusammensetzung der postsynaptischen Elemente von entscheidender Bedeutung ist aber problematisch .

Die Definition der funktionalen Architektur von Biomembranen in Nanometer-Bereich ist in den letzten Jahren durch die Entwicklung einer Anzahl von Techniken, Immunmarkierung geeignet für die Transmissionselektronenmikroskopie in Frage gestellt. Allerdings sind diese Techniken, beispielsweise vor und nach dem Einbetten Immunogold, haben eine Reihe von wichtigen Beschränkungen, die eine schlechte Erkennung von Antigenen und / oder begrenzte quantitative Beurteilung der membrangebundene Proteine ​​umfassen. Diese Einschränkungen werden besonders kritisch bei der Untersuchung der Feinstruktur des Nervensystems, die durch einen hohen Grad an Zell Vielfalt und Synapse Heterogenität gekennzeichnet ist. Diese Heterogenität resultiert sowohl aus strukturellen und funktionellen Vielfalt diktiert durch die prä- und postsynaptischen Elemente und durch die differentielle Expression, Anreicherung oder Interaktion von Signalproteinen, wie Rezeptoren, Transporteure und Effektormoleküle. Ein neuer Ansatz für die direkte immunolabeling von integralen oder vernetzten Membranproteinen in Detergens-solubilisierten Gefrierbruch - Replikate (FRIL) wurde ursprünglich vor 1 von Fujimoto zwei Jahrzehnten eingeführt. Diese ursprüngliche Verfahren hatte jedoch mehrere Einschränkungen, dh starke Fragmentierung von Repliken, die mit individuell zugeordneten Zellen in komplexen Geweben sinnvolle Korrelationen von markierten Molekülen behindert wie das Gehirn. Vor ungefähr 10 Jahren, Shigemoto und Fukazawa verbessert schrittweise die Technik 2. Dies wurde an den Boulder Laboratorien der Colorado State University durch die Bemühungen von einer anderen Gruppe von Wissenschaftlern parallel, der auch deutlich die Technik verbessert, insbesondere für die Untersuchung von gap junctions 3. Die Verbesserung der Gefrier-Fracturing-Protokolle und Maschinen, sowie die Einführung von Schnellgefrieren (unter hohem Druck), erlaubt es nun Ermittler ungebrochene Repliken von Exemplaren der relativ großen Größe zu erzeugen, und hallogh hochwertige Bilder der meisten zellulären Komponenten ohne die Einschränkungen und Artefakte, die durch starke chemische Fixierungen hergestellt. Die FRIL Technik bietet den großen Vorteil einer sehr quantitative in - situ - Identifizierung von einem oder mehreren Proteinen (gleichzeitig) in histologisch kartiert und zytologisch identifizierten Zellen in komplexen Geweben, wie dem Gehirn, mit dem zusätzlichen Vorteil einer Draufsicht auf prä- und postsynaptischen Elemente in einem einzigen Replik. Daher ist der FRIL-Technik trotz seiner vielen technischen Hürden, hält das Versprechen für eine Reihe von sehr bedeutenden wissenschaftlichen Durchbruch, insbesondere zur Korrelation der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Synapsen. Während der letzten Jahrzehnte hat sich eine große Menge an Informationen wurden auf die Struktur erhalten, molekularen Aufbau und physiologische Funktion von Synapsen; noch Synapsen sind morphologisch und molekular sehr unterschiedlich in Abhängigkeit von der Vor- und postsynaptischen pamieten Neuronen 4. Nur für eine Handvoll Synapse Typen waren Struktur-Funktions - Studien bisher 5-7 erreicht. Dies war vor allem auf technische Zwänge, die eine genaue Identifizierung der Art der prä-und postsynaptischen Elemente verhindert. Ultrastrukturelle Analyse über verschiedene synaptische Kontakte sowohl in Bezug auf die synaptische Größe und Inhalt in Neurotransmitterrezeptoren 6, kritische Einblicke in die Variabilität der postsynaptischen Membran Spezialisierungen vorgesehen , die einen großen Einfluss auf die Festigkeit und Plastizität der synaptischen Transmission aufweist. Weiterhin gibt eine große Anzahl von Studien , dass die Anzahl von ionotropen Glutamat - Rezeptoren auf verschiedenen Arten von Synapse ausgedrückt in einem afferent- und zielabhängig 7-10 reguliert wird. Hier wird ein Verfahren erläutert, dass die Analyse der Struktur und der Rezeptor Zusammensetzung der postsynaptischen Membran Spezialisierungen ermöglicht mit definierend präsynaptischen Elemente und Funktion. Dieser Ansatz nutzt den Vorteil der präsynaptischen Expression kürzlich lichtempfindlichen Algenproteine, wie Channelrhodopsin2 (ChR2), entwickelt, und der FRIL-Technik das Muster der postsynaptischen Expression von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zu analysieren Säure (AMPA-Rs) und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA-Rs) Glutamatrezeptoren. Dies wird an den Synapsen nachgewiesen durch Axone gebildet Ursprung aus den hinteren Thalamus medialen geniculate Kerne (PIN / MGn) auf Neuronen der Einlagerungen Zellmassen der Amygdala (ITC). ITC Neuronen sind kleine GABAergen Zellen stachelig in Cluster 11 rund um die basolaterale Amygdala - Komplex (BLA) organisiert, 12. ITC Neuronen sind dafür bekannt, exzitatorischen Eingänge von BLA Haupt Neuronen empfangen und den zentralen Kern (CEA) zu zielen, also als hemmender Gate funktioniert für den Informationsfluss zwischen dem BLA und CeA 12-15. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ITC Neuronen befindet sich in der medio-dorsale Cluster zwischen BLA und CeA erhalten auch direkte und konvergente erregenden Eingänge von sensorischen Thalamus und zeitlichen kortikalen Regionen, die so modifiziert sind auf Angst während Pavlovian auditorischen Angstkonditionierung 16 zu lernen. Angst Anlage ist eine der am besten verstanden, Formen des assoziativen Lernens in Bezug auf die Mechanismen des Gehirns. In Angstkonditionierung, einem zunächst neutral konditionierten Reiz (CS, zum Beispiel ein Ton) mit einem aversiven unkonditionierten Stimulus (US, zum Beispiel ein mildes Fuß - Schock) , was zu einem CS-US - Verband gepaart und Angstreaktion 17 konditioniert, 18. Erregende Eingänge von beiden Thalamus und Neokortex Bereiche, die Information , die die CS und US tragen, wurden jeweils bekannt auf pyramidalen Neuronen des lateralen Kern der Amygdala (LA) zu konvergieren und 19 Plastizität zu unterziehen. Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass sensorische Informationen auch an ITC Neuronen weitergegeben parallel ist <sbis&gt; 16. Als ein erster Schritt zu einer mechanistischen molekulare Analyse der einzelnen sensorischen Input auf ITC Neuronen Synapsen, verwendeten wir ein Adeno-assoziierten Virus (AAV) ChR2 mit dem gelben fluoreszierenden Protein (YFP) markiert auszudrücken. Die AAV wurde in die PIN / MGn injiziert und die Axonterminalen wurden durch ihre Expression von ChR2-YFP identifiziert. Wir haben beide von der FRIL-Technik erzeugt Flächen, die die Dichte der postsynaptischen AMPA-Rs und NMDA-Rs an Synapsen mit ITC Neuronen, die durch PIN / MGn Axonterminalen gebildet zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectants</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointments</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Saturated picric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapure water system</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td></tr><tr><td>Perfusion cannula</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>can be replaced by similar items from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;High-pressure&amp;nbsp; Freezing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper carriers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Chamois skin</td><td>Household supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Denatured ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage vessel</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freeze-fracture and Replication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 well plate</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunolabelling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie hat seit über 40 Jahren eine wichtige Technik in Ultrastrukturforschung gewesen. das Fehlen einer wirksamen Mittel jedoch die molekulare Zusammensetzung von Membranen zu studieren erzeugt einen deutlichen Rückgang in ihrer Nutzung. Kürzlich hat es die Entwicklung wirksamer Weise eine große Wiederbelebung in Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie durch gewesen integrale Membranproteine ​​durch Immunogoldmarkierung offenbaren. Eines dieser Verfahren wird als Detergens-solubilisierten Gefrierbruch-Replica Immunmarkierung (FRIL) bekannt. Die Kombination der FRIL-Technik mit Optogenetik ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der zentralen Synapsen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen, die durch ihre jeweiligen Expression eines markierten Kanalrhodopsin und spezifische molekulare Marker zu identifizieren und zu charakterisieren. Das unverwechselbare Erscheinungsbild der postsynaptischen Membran Spezialisierung der glutamaterge Synapsen ermöglicht es ferner, auf die Kennzeichnung von ionotropen Glutamatrezeptoren, zu quantifizieren und die intrasynaptischen Verteilung dieser Rezeptoren zu analysieren. Hier geben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich paired Repliken vorzubereiten und wie sie zu immunolabel. Wir werden auch die Einschränkungen und Einschränkungen der FRIL Technik diskutieren, insbesondere solche mit Vorspannungen Potential Abtastung zugeordnet ist. Die hohe Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit der FRIL-Technik, wenn sie mit Optogenetik kombiniert wird, bietet einen sehr leistungsfähigen Ansatz zur Charakterisierung der verschiedenen Aspekte der synaptischen Transmission bei identifiziert neuronaler Schaltkreise im Gehirn. Hier haben wir ein Beispiel geben, wie dieser Ansatz wurde verwendet, Einblicke in Struktur-Funktionsbeziehungen von exzitatorischen Synapsen an Neuronen der interkalierten Zellmassen der Maus Amygdala zu gewinnen. Insbesondere haben wir die Expression von ionotropen Glutamatrezeptoren an identifizierten Eingaben untersucht oderiginated vom Thalamus hinteren intralaminären und medialen geniculate Kerne. Diese Synapsen wurde gezeigt, dass sensorische Informationen, die für Angst Lernen Relais und plastischen Veränderungen auf Angstkonditionierung zu unterziehen.

Die FRIL Technik, wenn mit der Expression von optogenetische Aktoren mikrobiellen Ursprungs 21 kombiniert, das heißt, die Kanäle in der Plasmamembran integriert und wirksam anterograd entlang Axone transportiert, ermöglicht bei einer definierten Untergruppe quantitativ die postsynaptischen Expression von AMPA-Rs und NMDA-Rs zu prüfen , von Synapsen. Dies wird hier für Axone gezeigt aus verschiedenen Thalamuskernen Ursprung (zB PIN / MGn) auf ITC Neuronen in der Amygdala. Dieser Ansatz ermöglicht eine molekulare Analyse der einzelnen Sinnes Synapsen auf ITC Neuronen, einer Gruppe von Zellen, die bisher auf eine detaillierte anatomische und molekulare Charakterisierung refraktären waren. Vier Wochen nach der stereotaktische Injektion des rAAV-ChR2-YFP in die PIN / MGN ChR2-YFP-positive Axone dicht auf den LA innervated, die amygdalostriatal Übergangsbereich (Astria) und die mediale paracapsular I<html> TC - Cluster in der Amygdala, ein Muster vollständig im Einklang mit früheren Studien Tracing 16, 22. Wir haben auch intensiv Gold Immunmarkierung für die ChR2-YFP auf dem P-Gesicht von Axonen und Terminals in Gefrierbruch - Replik von rAAV-ChR2-YFP- erkannt injizierten Mäusen (5A), nicht aber in Nachbildungen von nicht-injizierten Mäusen. Der postsynaptischen Membran Spezialisierung der glutamatergen Synapsen in einem Replikat kann 7 durch die P-Fläche seines präsynaptischen Plasmamembran als ein Cluster von intramembranären Teilchen (IMPs) auf der E-Fläche der Plasmamembran 2, 23, und wird oft begleitet beachten (5B-C). Erlaubt diese Funktionen , um die postsynaptische Spezialisierung der glutamatergen Synapsen durch PIN / MGn Axonterminalen (Abbildung 5 und 6) gebildet , zu identifizieren. Wir markierten AMPA-Rs mit einem Antikörper, der alle vier Untereinheiten (GluA1-4) erkennt, während NMDA-Rs einen Antikörper gegen die essentiellen NR1-Untereinheit detektiert wurden. ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Wegen des Mangels an Werkzeugen auf dem gleichen Replik zu erkennen, ob diese Synapsen mit dendritischen Dornen oder Wellen von ITC Neuronen wurden, gekennzeichnet wir die entsprechende Replik Gesicht für μ -Opioid - Rezeptoren, wie ITC Neuronen exprimieren postsynaptisch hohe Niveaus dieser Rezeptoren 24. Dies erforderte die Identifizierung der gleichen postsynaptischen Profile in den beiden Replikaten (5C-F und 6A-D) eine Strategie verwendet , die Landmarken (4E) beschäftigt . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Abbildung 5. Der Nachweis von ChR2-YFP und Ionotropic Glutamate Receptors auf Replikat von Immunogold Partikel. (A) Ein Quer gebrochen Axonterminal (hellblau) und kleine Teile seiner P-Gesicht , markiert mit 15 nm Goldpartikeln Nachweis ChR2-YFP. Innerhalb des Terminals, wobei die Membran of zahlreiche synaptische Vesikel (sv) beobachtet werden. Notieren Sie sich die Spezifität der Immunmarkierung zu einem großen Teil an der Plasmamembran beschränkt. Kennzeichnung für ChR2 identifiziert das Terminal als von der PIN / MGn. Das Terminal bildet eine asymmetrische Synapse mit einer Wirbelsäule. Der postsynaptischen Membran Spezialisierung (PSD) an der E-Fläche zeigt eine charakteristische Gruppe von intramembranären Teilchen und mit 5 nm Goldpartikel offenbaren AMPA-Rs bezeichnet. (B) Die P-Gesicht eines ChR2-exprimierenden Axon (beschriftet mit 15 nm Goldpartikel) ist an der Grenze gezeigt zwei Dendriten, einer von ihnen besitzen zwei mit 5 nm Goldpartikeln markiert PSDs enthüllt NMDA-Rs. (CD) gegenüberliegenden Flächen der prä- und postsynaptischen Membranen eines PIN / MGn-ITC Synapse. (C) Das P-Gesicht des Terminals drückt ChR2 (beschriftet mit 15 nm Goldpartikel) und erstreckt sich über die E-Gesicht von zwei dendritischen Wellen, einer von ihnen mit zwei PSDs markiert für AMPA-Rs (5 nm Goldpartikel). ( <strong&gt; D) für μ-Opioid - Rezeptoren (10 nm Goldpartikel) Die entsprechende P-Fläche der beiden Dendriten bezeichnet. (EF) vergrößerte Ansichten der Flächen durch die gestrichelte Linie dargestellt. Maßstabsbalken:. 500 nm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Immunoparticles für AMPA-Rs in den PIN / MGn-ITC Synapsen waren über die IMP Cluster gefunden, um eine homogene Verteilung innerhalb der postsynaptischen Spezialisierung (5E) hindeutet. A signifikant höher (ungepaarter t-Test p &lt;0,018) Dichte von AMPA-R Markierung wurde in PIN / MGn beobachtet Synapsen auf ITC Stacheln (715 ± 38 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 32) im Vergleich zu Synapsen auf ITC Dendriten (590 ± 44 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 32). Insgesamt zeigten sich die Dichte von AMPA-Rs im PIN / MGn-ITC Synapsen eine relativ niedrigeVarianz (Variationskoeffizient CV = 0,37), die mit einer homogenen Verteilung. Immunoparticles für NMDA-Rs in den PIN / MGn-ITC Synapsen häufig ungleichmäßig innerhalb postsynaptischen IMP Cluster (5B) verteilt beobachtet wurden. Die Dichte des NMDA-R Markierung war ähnlich (ungepaarter t-Test p = 0,39) zwischen PIN / MGn Synapsen auf ITC Stacheln (1070 ± 153 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 8) und ITC Dendriten (812 ± 183 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 9). Anders als für die AMPA-Rs beobachtet wurde, wurde die Dichte des NMDA-Rs in PIN / MGn-ITC Synapsen sehr variabel (CV = 0,54). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Abbildung 6. AMPA-Rs und NMDA-Rs Immunmarkierung bei Identifizierte PIN / MGn-ITC - Synapse. (AB) gegenüberliegende Flächen der prä- und postsynaptischen Membranen eines PIN / MGn-ITCSynapse machte auf einen dendritischen Dorn in dem die P-Seite des Klemmen ChR2 drückt (mit 15 nm Goldpartikel markiert) und die PSD auf eine dendritische Wirbelsäule für AMPA-Rs (5 nm Goldpartikel) markiert. (CD) vergrößerte Ansichten der Bereiche durch die gestrichelte Linie dargestellt. Diese Bereiche wurden etwa 45 ° gegen den Uhrzeigersinn zu ermöglichen, eine bessere Sicht auf die PSD gedreht. (E) Scatterplots der Anzahl von AMPA-R - Partikel im Vergleich zu synaptischen Bereich in ITC Stacheln und Dendriten. In beiden Strukturen ist eine positive Korrelation beobachtet. (F) Scatterplots der Anzahl von NMDA-R Partikel gegen synaptischen Bereich in ITC Stacheln und Dendriten. Eine signifikante positive Korrelation wurde nur in dendritischen Dornen detektiert. Maßstabsbalken:. 500 nm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> weildie P-Fläche der präsynaptischen Plasmamembran oft teilweise die postsynaptischen IMP Cluster überlagert, wir den synaptischen Bereich von nur 30% der Synapsen schätzen konnte (Stacheln: mittlere Bereich 0,032 &amp; mgr; m 2, Bereich: 0,007 bis 0,063 &amp; mgr; m 2, n = 8; Dendriten: 0,047 &amp; mgr; m 2, Bereich: 0,024 bis 0,166 &amp; mgr; m 2, n = 11). Diese waren in einem ähnlichen Bereich wie zuvor analysiert telencephalic glutamatergen Synapsen 25. In beiden Stacheln und Dendriten, wurde die Zahl der Gold immunoparticles für AMPA-Rs in einzelnen Synapsen positiv mit dem synaptischen Bereich korreliert (Spearman, Stacheln: r = 0,88, Dendriten: r = 0,60, p &lt;0,0001) (6E). Umgekehrt wurde die Zahl der Gold immunoparticles für NMDA-Rs Bezeichnungen mit den synaptischen Bereich in Stacheln (Spearman, Stacheln: r = 0,90, p &lt;0,002) zu korrelieren , aber nicht in Dendriten (r = 0,21, p = 0,29) (Figur 6F ).

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Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Aufrufe.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Serie: Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Forschung

Verhalten

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Neurowissenschaften

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this purpose, an in vivo imaging technique that detects calcium transients in neurons using genetically encoded calcium indicators (GECIs), a miniaturized fluorescence microscope, and a gradient refractive index (GRIN) lens has been developed and successfully applied to many brain structures1,2,3,4,5,6. This imaging technique is particularly powerful because it enables chronic simultaneous imaging of genetically defined cell populations for a long-term period up to several weeks. Although useful, this imaging technique has not been easily applied to brain structures that locate deep within the brain such as amygdala, an essential brain structure for emotional processing and associative fear memory7. There are several factors that make it difficult to apply the imaging technique to the amygdala. For instance, motion artifacts usually occur more frequently during the imaging conducted in the deeper brain regions because a head-mount microscope implanted deep in the brain is relatively unstable. Another problem is that the lateral ventricle is positioned close to the implanted GRIN lens and its movement during respiration may cause highly irregular motion artifacts that cannot be easily corrected, which makes it difficult to form a stable imaging view. Furthermore, because cells in the amygdala are usually quiet at a resting or anesthetized state, it is hard to find and focus the target cells expressing GECI in the amygdala during baseplating procedure for later imaging. This protocol provides a helpful guideline for how to efficiently target cells expressing GECI in the amygdala with head-mount miniaturized microscope for successful in vivo calcium imaging in such a deeper brain region. It is noted that this protocol is based on a particular system (e.g., Inscopix) but not restricted to it.

In vivo microendoscopic calcium imaging is an invaluable tool that enables real-time monitoring of neuronal activities in freely behaving animals. However, applying this technique to the amygdala has been difficult. This protocol aims to provide a useful guideline for successfully targeting amygdala cells with a miniaturized microscope in mice.

Erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung mit einem kopfmontierten Miniaturmikroskop in der Amygdala der frei verhaltenden Maus

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

Visualisierung und Kartierung neuronaler Signalwege in einem Amygdala-Hirnschnitt

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

An In Vitro Technique to Study Glutamate Receptor Trafficking in Hippocampal Neurons

Source: Chiu, A. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59982">An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an antibody-feeding approach to study the trafficking of glutamate receptors in primary hippocampal neuronal cultures. This approach allows the observation of receptor populations at both the plasma and internal membranes. Discrimination between these subsets is achieved by labeling the receptors before and after membrane permeabilization, using the same primary antibody but secondary antibodies conjugated to different fluorophores.

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung des Glutamatrezeptor-Handels in Hippocampus-Neuronen

1. Preparation Before Labeling

	Preparation and maintenance of primary hippocampal cultures&#8203;
	
		Prepare primary hippocampal cultures at a density ...

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

Erzeugung von gekippten Amygdala-Schnitten aus einem Mausgehirn

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

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