Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 인해 immunogold 라벨 (1, 2), 즉 FRIL 기술에 의해 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경의 주요 부활되고있다. FRIL 기술은 다른 immunogold 미세 방법에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 첫째, 단백질은 감도를 증가 항체에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 둘째, 복제의 2 차원 표면 등 시냅스 막으로서 세포막 전문, 큰 부분의 노출 세리의 힘들고 시간 소모적 재구성없이 관심 분자의 공간적 분포 및 물리적 연속성의 검사를 허용알 얇은 섹션. 셋째, 세포막의 양쪽 절반의 이용은 각각의 구성에 대해 표시 할 수 단백질의 수가 제공 적합한 항체를 사용할 수를 증가시킨다. 파쇄시 분할 멤브레인의 소수성 표면은 골절 표면에 잔류 된 단백질 도메인을 구축하고 그리고 탄소, 백금으로 코팅된다. 이것은 이러한 도메인의 항원에 대한 항체의 접근을 방지 할 수 있습니다. 복제의 P-얼굴 인스턴스의 원형질 공간 대향 만 에피토프 반면 단지 항체에 의해 결합 될 수있는 공간 exoplasmic 대향 에피토프 전자 표면에 항체가 검출 될 수있다 (도 2 참조). 한편, FRIL 기법은 특정 제한이 앓고. 골절이 무작위로 발생, 특정 세포 또는 구조를 대상으로 어려울 수 있습니다. 이것은 또한 FRA의 다른 확률이 주어진, 시냅스 컬렉션, 예를 들어 샘플링 바이어스로 이어질 수 있습니다다른 곡률 (샤프트 대 예를 들어, 등뼈)와 구조의 멤브레인을 따라 cturing. 또한, 상기 두면 중 한 막 단백질의 배치를 예측할 수있다. 따라서, P-E-얼굴이나 얼굴 단백질의 분포는 특별히 정량적 연구에 신중 될 세포와 세포 외 도메인에 대한 반응성 항체를 사용하여 검사한다. 유일한 형태 적 특징에 기초 할 때 마지막으로, 시냅스 축삭 단자로서 특정 구조의 복제본의 식별이 어려울 수있다. 그러나, 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 사용하거나 태그 세포막 단백질 또는 추가 도구 바이러스 벡터를 제공하여 채널의 전달은 골절 막의 식별을 용이하게한다. 예를 들어,이 연구는 시냅스 날 공개 μ-오피오이드 수용체의 편도 또는 라벨에 자신의 축삭의 efferents를 식별하기 위해 시상 신경 세포에 ChR2 - YFP의 전달을 이용했다ITC 뉴런의 mbranes. 성공적 FRIL 기술을 수행하기 위해 특별한주의가 조직 정착 관한주의해야한다. 강 조직을 고정 (&gt; 2 % 파라 포름 알데히드)를 교차 골절 고속 라벨링 감도의 감소를 초래할 수있다. 한편, 약한 고착 티슈 운반 제제 (예 : 부분 절단)을 어렵게 만든다. 이 트리밍 된 블록의 두께는 양면 테이프의 두께와 일치하는지 제어하는​​ 것도 중요하다. 시편의 두께는 테이프보다 낮은 경우, 조직의 표면은 두 개의 금속 담체의 표면에 부착 할 수있는, 따라서 고정 된 시편을 파단되지 않는다. 조직이 두꺼운 경우 두 구리 캐리어 샌드위치이 이루어질 때, 그것은 불가피 구조적 왜곡으로 압축 될 것이다. 시험편이 파단되는 온도 (이 프로토콜에서, -115 ° C)도 중요한 역할을복제의 구조. 높은 온도는 이전 또는 증발 동안 조직의 표면에 수증기 축합 생성물로의 더 높은 레이트를 생성 할 수있다. 낮은 온도 (&lt;-125 ° C) 골절 중 물질의 오프 분할의 위험을 증가시킬 수있다. 이 물질은 시료의 표면에 떨어지거나 연결된 숙박 할 수 있습니다. 재료의이 조각은 코팅 된 이미지에 어두운 반점을 생산 대조된다. 낮은 온도에서 파쇄도 특히 돌기 쪽이 작은 미세 구조물 간 골절의 주파수에 영향을 미칠 수있다. 복제의 제조에서 또 다른 중요한 단계는 세제 소화이다. 소화가 완료되지 않으면, 소화 조직은 TEM의 구조 분석을 교란 복제본에 어두운 패치 나타난다. 또한, 소화 조직 배경 라벨링 증가 비특이적으로 결합하는 항체 또는 트랩을 할 수있다. 세제 한편, 사용조직 소화의 자신의 2 차 및 3 차 구조를 변경 복제에 관련된 분자를 변성 수 있습니다. 따라서, 특정 항원 서서히 추가 세척 단계 SDS 농도를 희석 할 필요가있을 수도있다. immunolabeling 들어, 이차 항체에 접합 된 금 입자의 크기가 서로 다른 가능성이 동시에 검출 할 수 있지만, 단지 성적, 심지어 시냅스 특성화와 세포막의 특정 마이크로 도메인에 여러 단백질. 그러나, 입체 장해로 정량 연구는 일반적으로 단지 하나의 분자의 검출에 한정된다. 금 입자의 크기는 또한 라벨 효능에 영향을 미칠 수있다. FRIL에서 라벨의 해석 들어, 인해가요 복잡한 형태로 immunogold 입자는 항원 20-25 nm의 반경을 갖는 반구 내의 어딘가에 위치 할 수 있음을 명심해야한다일차 및 이차 항체 (26)에 의해 에드. 이론과 FRIL 및 관련 기술의 연습에 대한 자세한 내용은, 우리는 다른 방법 론적 기사 (27), (28)에 또한 독자를 참조하십시오. FRIL 기술은 최근 30. 또한, AMPA-RS에 대한 FRIL 기술의 검출 감도는 하나의 기능 AMPA 하나씩 immunogold 입자 높이로 추정 다양한 시냅스 인구 29에서 글루타메이트 수용체 지역화 고해상도 정량 분석에 사용 된 -R 채널 29. 따라서,이 방법은 정량화 및 중앙 시냅스에서 AMPA-RS 및 NMDA-R과의 시냅스 표현의 패턴을 분석하기 위해 전반적으로 매우 유용합니다. 여기, 우리는 PIN / MGN-ITC 시냅스에서의 적용 가능성, 공포 조건화 동안 미국의 정보를 중계 가능성이 중요한 사이트를 보여 주었다. AMPA 수용체 아 단위의 Glu의 고도로 보존 된 세포 외 아미노산 잔기에 대해 발생하는 항체를 사용하여A1-GluA4, 우리는 시냅스 막 전문 분야에 해당하는 IMP 클러스터 내에서 금 입자의 고른 분포를 발견했다. ITC의 등뼈에서 AMPA-RS의 밀도는 PIN / MGN 시상 구 심성의 대상이 축 시냅스에 비해 유의하게 높았다. 모두 척추와 샤프트 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 표시와 시냅스 영역 사이에 양의 상관 관계는 다른 글루타메이트 성 시냅스 (25)에 공통 기능을 검출 하였다. PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 낮은 분산은 대뇌 피질의 시냅스 (25)에서 시상 efferents (7)에 의해 형성된 다른 시냅스와 유사하지만 서로 다른 균일 한 분포를 나타냅니다. 반대로, NMDA-RS의 밀도보다 변수이고 AMPA-RS는 상이한 규제 건의 척추 축 시냅스 차이가 없었다. 미래에, FRIL 기법의 재현성는 중심 시냅스 기저 고분자 조성물을 평가하는 것을 허용하지 않지만 (C)의 검출을 용이하게 할 수있다공포 학습 후 이온 성 글루타메이트 수용체의 숫자와 subsynaptic 분포 hanges, 이러한 입력의 사전 및 시냅스 속성의 전 생체 내 녹음을 보완. 입력의 기원과 시냅스 후 소자의 특성 및 조성 disentangling 것은 중요하지만, 문제가되는 결론적으로,이 방법은 많은 다른 신경 회로에 입력 특정 흥분성 시냅스의 구조 - 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 연구자들에 의해 사용될 수있는 .

나노 미터 크기의 생체막의 기능적 구조의 정의는 투과 전자 현미경에 적합한 immunolabeling 기술 다수의 발달로 최근에는 도전되었다. 그러나, 이러한 기술은, 예를 들면 전후의 매립 immunogold을, 항원 및 / 또는 막 결합 단백질의 양적 제한 평가 불량한 검출 포함 중요한 제한들을 갖는다. 이러한 제한은 셀 다양성과 시냅스 이질성 높은 것을 특징으로하는 신경 조직의 미세 구조의 연구에 특히 중요해진다. 사전 및 시냅스 소자 차동 식 농축, 또는 수용체 전송기 및 이펙터 분자로서 시그널링 단백질의 상호 작용에 의해 결정 구조적 및 기능적 다양성이 이질성 결과. 직접 immunolabe에 대한 새로운 접근 방식세제 용해 동결 골절 복제 (FRIL)의 통합 또는 가교 막 단백질의 링은 원래 20 년전 1 후지모토에 의해 소개되었다. 이 원래의 방법이 있었다, 그러나 몇 가지 제한 사항, 즉, 같은 두뇌와 같은 복잡한 조직에서 개별적으로 매핑 된 셀 라벨 분자의 의미있는 상관 관계를 방해 복제의 심각한 분열. 약 10 년 전, Shigemoto와 카자는 점진적으로 기술이 향상되었습니다. 이것은 또한 크게 갭 접합 (3)의 연구, 특히 기술을 향상 콜로라도 주립 대학의 볼더 연구소, 과학자의 또 다른 그룹의 노력이 병행되었다. 동결 파쇄 프로토콜 및 시스템의 개선뿐만 아니라, (고압) 빠른 냉동의 도입은 지금 하이 연구자들은 상대적으로 큰 크기의 시험편의 단절 복제본을 생성 할 수 있도록한계와 강한 화학 고착에 의해 생성 된 유물없이 대부분의 세포 성분의 GH 품질​​의 이미지. FRIL 기술은 사전 및 시냅스의 평면도의 또 다른 장점으로, 이러한 뇌 복잡한 조직 내의 하나 이상의 매핑 학적에서 (동시에) 단백질 및 미세 침 흡인 세포 검사 식별 세포 동일계 식별에 고 정량의 큰 장점을 제공한다 하나의 복제 요소. 따라서, FRIL 기술은 많은 기술적 장애에도 불구하고, 특히 각각의 시냅스의 구조적 및 기능적 특성의 관계에 대해 매우 중대한 과학적 돌파구로 사용하는 가능성을 보유하고있다. 지난 몇 년 동안, 많은 정보는 분자 구성, 구조에 획득하고 있으며, 시냅스의 생리 기능; 아직 시냅스는 형태 학적 및 분자 매우 다양한 사전 및 시냅스 파에 따라 있습니다임대 뉴런 4. 시냅스 만 종류의 소수에 대한 구조 - 기능 연구가 지금까지 5-7 수행 하였다. 이는 사전 및 시냅스 요소의 특성에 대한 정확한 식별을 방지 기술적 제약에 대부분이었다. 미세 분석은 시냅스 전달의 강도와 소성에 큰 영향을 미치는 신경 전달 물질 수용체 6 별개의 시냅스 접촉에 걸쳐 모두 시냅스 크기와 내용면에서 시냅스 막 전문의 변동성에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 또한, 많은 연구 기관은 시냅스의 종류 발현 이온 성 글루타메이트 수용체의 수는 afferent- 및 목표 의존적 7-10으로 조절되는 것을 나타낸다. 여기에서, 방법은 정의와 시냅스 막 전문의 구조와 수용체의 조성 분석을 허용하는 개략되어D 시냅스 요소 및 기능. 이 방법은 channelrhodopsin2 (ChR2)와 같은 최근 개발 된 감광성 조류 단백질의 연접 식을 활용하고 FRIL 기술의 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic의 시냅스 발현의 패턴을 분석 산 (AMPA-RS) 및 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA-RS) 글루타메이트 수용체. 이는 편도 (ITC)의 인터 셀 대중의 신경 세포에 후방 시상 - 중간 geniculate 핵 (PIN / MGN)에서 발생하는 축색 돌기에 의해 형성된 시냅스에서 시연된다. ITC 뉴런은 기저 amygdaloid 복합 (BLA) (11), (12)을 둘러싼 클러스터 구성 작은 가시 GABA 성 세포이다. ITC 신경 세포가 BLA 주요 신경 세포에서 흥분성 입력을 수신하고 (CEA)를 중심 핵을 대상으로하는 것으로 알려져있다, 따라서 억제 게이트 역할을 정보에 대한 BLA와 CEA 12 ~ 15 사이에 흐른다. 최근에, 우리는 IT 시연BLA와 CEA의 메디 - 지느러미 클러스터에있는 C 뉴런은 두려움 파블로프 청각 공포 조건화 16시 학습에 수정 감각 시상 및 시간 대뇌 피질의 영역에서 직접 수렴 흥분성 입력을받을 수 있습니다. 공포의 조절은 뇌 메커니즘의 관점에서 연관 학습의 가장 좋은 이해 형태 중 하나입니다. 공포 에어컨, 초기 중립 조건 자극 (CS, 예를 들면, 톤)에서 CS-US 협회 초래하는 혐오 무조건 자극 (US, 예를 들면, 가벼운 발 충격)와 짝과 공포 응답 (17), (18)를 조절한다. 흥분성을 연사 및 미국을 대표하는 정보를 전달 시상 및 신피질 영역 모두에서 입력은 각각 편도 (LA)의 측면 핵의 피라미드 뉴런에 수렴 및 소성 (19)를 받아야하는 것으로 알려져 있었다. 우리의 이전 작품은 감각 입력 정보가​​ ITC의 신경 세포에 전달 병렬도 밝혀 <s&gt; 16입니다. 각각의 감각 입력의 기계적인 분자 분석을 향한 첫 번째 단계는 ITC의 신경 세포에 시냅스, 우리는 ChR2는 노란색 형광 단백질 (YFP) 태그로 표현하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)을 사용했다. AAV는 PIN / MGN에 주입하고, 축삭 단자는 ChR2 - YFP의 발현에 의해 확인되었다. 우리는 PIN / MGN 엑손 단말기들에 의해 ITC 뉴런 형성 시냅스 시냅스 AMPA-RS와 NMDA-RS의 밀도를 평가하기 FRIL 기술에 의해 생성 된 양면을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectants</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointments</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Saturated picric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapure water system</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td></tr><tr><td>Perfusion cannula</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>can be replaced by similar items from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;High-pressure&amp;nbsp; Freezing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper carriers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Chamois skin</td><td>Household supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Denatured ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage vessel</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freeze-fracture and Replication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 well plate</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunolabelling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 immunogold 라벨링함으로써 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경 덕분에 큰 부활되고있다. 이러한 방법 중 하나는 세제 용해 동결 골절 복제 Immunolabeling (FRIL)로 알려져있다. optogenetics와 FRIL 기술의 조합은 중앙 시냅스의 구조 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 식별 및 태깅 channelrhodopsin 각각 식 특정 분자 표지로 사전 및 시냅스 후 뉴런 모두를 특성화 할 수있다. glutamat의 시냅스 막 전문의 독특한 외관ergic 정량화 이들 수용체의 intrasynaptic 분포를 분석하기 위해, 상기 시냅스 이온 성 글루타메이트 수용체의 라벨링시에 허용한다. 여기서 우리는 페어 복제 방법을 immunolabel하는 방법을 준비하는 데 필요한 절차를 단계별 설명을 제공합니다. 우리는 또한 잠재적 인 샘플링 편견과 관련된 특히 사람들을 FRIL 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. optogenetics와 결합 할 때 FRIL 기술의 높은 재현성과 다양성은 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로의 시냅스 전달의 다양한 측면의 특성에 대한 매우 강력한 접근 방식을 제공합니다. 여기서는 이러한 접근은 마우스 편도의 인터 세포 질량의 뉴런에서 흥분성 시냅스의 구조 - 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 특히,이 확인 입력에서 이온 성 글루타메이트 수용체의 발현을 조사 하였다하거나시상 후방 intralaminar와 중간 geniculate 핵에서 iginated. 이 시냅스는 두려움 학습을위한 관련 감각 정보를 중계하고 공포 조건화에 플라스틱 변화를 겪는 것으로 나타났다.

FRIL 기술은 미생물 기원 (21) 즉, 세포막 통합 효과적으로 축삭을 따라 anterogradely 전송 채널 optogenetic 액추에이터 식으로 결합 될 때, 정의 된 서브 그룹에서 정량 AMPA-RS와 NMDA-RS의 시냅스 발현을 조사 할 수 있도록 시냅스의. 이 편도에 ITC 뉴런에 (예를 들어, PIN / MGN) 별개의 시상 핵에서 발생하는 축삭을 위해 여기에 표시됩니다. 이 접근법은 ITC 뉴런, 지금까지 상세한 해부학 분자 특성화 난치성이었다 셀 그룹 상 개별 감각 입력 시냅스의 분자 분석을 가능하게한다. 4 주 PIN / MGN에 rAAV-ChR2 - YFP의 정위 주사 후, ChR2 - YFP 양성 축색 돌기 밀도가 LA의 amygdalostriatal 전이 지역 (Astria) 및 내측 paracapsular의 I를 신경 지배<html> 편도선에 TC 클러스터는, 이전의 추적과 완벽하게 일치하는 패턴은 22, 16 연구. 우리는 또한 rAAV-ChR2-YFP-에서 동결 골절 복제의 축삭과 단자의 P-얼굴에 ChR2 - YFP에 대한 immunolabeling 강한 금을 감지 주입 된 마우스 (도 5a), 그러나 비 - 주입 된 쥐에서 복제된다. 복제에서 글루타메이트 시냅스의 시냅스 막 특성화 원형질막 2 (23)의 E-얼굴 intramembrane 입자 (하는 IMP)의 클러스터로서 관찰 될 수 있고, 종종 시냅스 전 혈장 막 (7)의 P-얼굴 수반 (그림 5B-C). PIN / MGN의 축삭 단자에 의해 형성 글루타메이트 성 시냅스의 시냅스 전문화를 식별 할 수 이러한 기능 (그림 5, 6). 우리는 NMDA-RS는 필수 NR1 서브 유닛에 대한 항체를 사용하여 검출 된 반면, 네 개의 서브 유닛 (GluA1-4)를 인식하는 항체와 AMPA-R을 표시. &quot;FO : 유지-together.within 페이지를 =&quot;ntent 1 &quot;은&gt;이 시냅스가 돌기 쪽 또는 ITC 뉴런의 축으로 만들어진 여부를 동일한 복제본에 감지 할 수있는 도구의 부족 때문에, 우리는 μ에 대한 대응 복제의 얼굴을 표지 ITC 뉴런이 수용체 (24)의 postsynaptically 높은 수준의 발현으로 -opioid 수용체. 이것은 최적의 고용 전략을 사용하여 두 개의 복제본 (도 5C-F 및도 6A-D)에서 동일한 시냅스 정보의 확인 요구 (도 4E) . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> 그림 5. Immunogold 입자에 의한 복제에 ChR2 - YFP 및 이온 성 글루타메이트 수용체의 검출. (A) 크로스 골절 축삭 터미널 (하늘색)과 ChR2 - YFP을 검출하는 15 나노 금 입자로 표지의 P-얼굴의 작은 부분. the 터미널 내에있는 경우의 O-F 수많은 시냅스 소포가 관찰 될 수있다 (SV). 원형질막에 한정되는 대부분의 immunolabeling의 특이성 주. ChR2에 대한 라벨링은 PIN / MGN에서 발생 등의 단말기를 식별합니다. 단말은 척추 비대칭 시냅스를 형성한다. 전자의 얼굴에 시냅스 막 전문화 (PSD)는 intramembrane 입자의 특성 클러스터를 보여줍니다 AMPA-R을 공개 5 나노 금 입자로 표지한다. (B) (15 나노 금 입자로 표지)를 ChR2 발현 축삭의 P-얼굴이 수상 돌기, 그들이 NMDA-R을 공개 5 나노 금 입자로 표지 두의 PSD를 보유 중 하나를 경계 표시됩니다. (CD)는 PIN / MGN-ITC 시냅스의 사전 및 시냅스 막의 반대면. (C) 상기 단말기의 P-얼굴 (15 nm의 금 입자로 표지) ChR2 표현 두 돌기 축, 그들 AMPA-RS (5 nm의 금 입자) 표지 두 개의 PSD를 포함하는 하나의 E-면 위에 연장된다. ( <strong&gt; D) 두 개의 수상 돌기의 대응 P-얼굴 μ-아편 유사 수용체 (10 나노 금 입자) 표지 할 것. (EF) 점선으로 설명하는 부분 확대도. 스케일 바 :. 500 nm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> PIN을 / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 Immunoparticles은 시냅스 전문 (그림 5E) 내에서 균일 한 분포를 제안, 모든 IMP 클러스터를 통해 발견되었다. 유의하게 높은 (짝 t 테스트 페이지가 &lt;0.018) AMPA-R 라벨의 밀도는 PIN / MGN에서 관찰되었다 ITC의 등뼈에 시냅스 (715 ± 38 금 입자 / μm의 2, N = 32) ITC의 수상 돌기 위에 시냅스에 비해 (590 ± 44 금 입자 / ㎛의 2, N = 32). 전반적으로, PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 비교적 낮은 나타났다분산 (분산 계수, CV = 0.37) 균일 한 분포와 일치. PIN을 / MGN-ITC 시냅스에서 NMDA-RS에 대한 Immunoparticles은 종종 불균일 시냅스 IMP 클러스터 (그림 5B) 내에 분포 관찰되었다. NMDA-R 라벨의 밀도는 (짝 t 테스트 P = 0.39) PIN / MGN은 ITC의 등뼈에 시냅스 사이에 유사했다 (1070 ± 153 금 입자 / μm의 2, N = 8)과 ITC의 수상 돌기 (812 ± 183 금 입자 / μm의 2, N = 9). AMPA-RS에 대한 관찰 내용과는 달리, PIN / MGN-ITC 시냅스에서 NMDA-RS의 밀도 (CV는 = 0.54)이 높은 변수였다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> 확인 된 PIN / MGN-ITC 시냅스에서 그림 6. AMPA-RS 및 NMDA-R과 Immunolabeling. (AB)는 PIN / MGN-ITC의 사전 및 시냅스 막의 반대면단말기의 P-얼굴 ChR2을 표현하는 수지상 척추에 만들어진 시냅스는 (15 나노 금 입자로 표지) 및 수지상 척추 상에 PSD는 AMPA-RS (5 나노 금 입자) 표지 할 것. (CD)에 점선으로 설명하는 부분 확대도. 이 지역은 PSD의 더 잘 볼 수 있도록 약 45 ° 시계 반대 방향으로 회전하고있다. (E) ITC 등뼈와 돌기 시냅스 영역 대 AMPA-R 입자 수의 산점도. 두 구조에서 양의 상관 관계가 관찰되었다. (F) ITC 등뼈와 돌기 시냅스 NMDA 영역에 대해 R-입자 수의 산점도. 유의 한 양의 상관 관계 만 돌기 쪽이 검출되었다. 스케일 바 :. 500 nm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 때문에종종 부분적으로 시냅스 IMP 클러스터에 겹쳐 시냅스 세포막의 P-면, 우리는 시냅스의 30 %의 시냅스 영역을 추정 수 (등뼈는 : 영역을 0.032 ㎛의 제 2 범위의 의미 : 0.007 ㎛의 2 0.063로를 N = 8; 수상 돌기 : 0.047 μm의 2 범위 : 0.024 11 μm의 2 0.166로, N =). 이전 분석 telencephalic 글루타메이트 25 시냅스 이러한 유사한 범위에 있었다. 두 쪽과 수상 돌기에서, 각각의 시냅스에서 AMPA-R과 골드 immunoparticles의 수는 긍정적 인 시냅스 영역과의 상관 관계를 보였다 (스피어, 쪽 : R = 0.88, 수상 돌기 : R = 0.60, p &lt;0.0001) (그림 6E). 하지만 수상 돌기 (R = 0.21, P = 0.29) (그림 6 층에서 : 반대로, NMDA-R과 골드 immunoparticles의 수는 쪽 (R = 0.90, P &lt;0.002 스피어, 등뼈)의 시냅스 영역과 상관 관계가 밝혀졌다 ).

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Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K 조회수.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

연구

신경과학

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Measuring Protein Expression in the Rodent Brain Using Near-Infrared Fluorescence and High-Resolution Scanning 

Source:&#160;<a style='text-decoration:none;' href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59685/using-near-infrared-fluorescence-and-high-resolution-scanning-to-measure-protein-expression-in-the-rodent-brain'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Kimmelmann-Shultz, B.,&#160;et. al.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>&#160;<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain.&#160;J. Vis. Exp.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>&#160;(2019)</a> &#160;This video demonstrates a near-infrared fluorescence and high-resolution scanning method for measuring protein expression in the rodent brain.

Source:&#160;Kimmelmann-Shultz, B.,&#160;et. al.&#160;Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the ...

Neuroimaging

Synaptic & Cellular Imaging

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice(편도체 뇌 절편에서 신경 경로의 시각화 및 매핑)

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

An In Vitro Technique to Study Glutamate Receptor Trafficking in Hippocampal Neurons

Source: Chiu, A. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59982">An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an antibody-feeding approach to study the trafficking of glutamate receptors in primary hippocampal neuronal cultures. This approach allows the observation of receptor populations at both the plasma and internal membranes. Discrimination between these subsets is achieved by labeling the receptors before and after membrane permeabilization, using the same primary antibody but secondary antibodies conjugated to different fluorophores.

해마 뉴런에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 체외 기술

1. Preparation Before Labeling

	Preparation and maintenance of primary hippocampal cultures&#8203;
	
		Prepare primary hippocampal cultures at a density ...

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

쥐의 뇌에서 기울어진 편도체 조각의 생성

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

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