This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.

Hayvan çalışmaları Fribourg, İsviçre Veteriner Dairesi Etik Komitesi tarafından onaylandı. protokolü kurumda hayvan bakımı ve deney üzerinde yönergeleri takip eder. İzole Arter İnkübasyon için Set-up 1. Hazırlık <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı ve bir karbon tankından% 95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırıldı edilebilir bir organ banyosu sistemi oluşturmak. </li><li> Aşağıdaki bileşimin konsantrasyonu ile gerektiği kadar Krebs-Ringer bikarbonat tamponu hazırlayın: (118 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0.026 mM EDTA ve 11.1 mM D-glukoz). </li><li> Buz üzerinde stok tampon tutun ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile tampon havalandırır. </li><li> organ banyosu sistemi açın, 37 ° C&#39;de sıcaklığı ayarlamak her odasına hazır kullanıma tampon 5 ml ekleyinve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile tampon havalandırmak tutun. </li><li> 30 dakika boyunca Krebs-Ringer tampon maddesi ile bir kez odaları yıkayın. </li><li> Her bölmeye 5 ml Krebs-Ringer tamponu ilave edin ve buharlaşmayı önlemek için bölme kapsamaktadır. </li></ol> Fare aorta 2. izolasyonu <ol><li> fareler kurban ila 150 mg / kg konsantrasyonunda intraperitonal% 0.9 NaCI içinde çözülmüştür pentobarbital enjekte edilir. </li><li> cerrahi gemide supinely fare Lay. </li><li> sanitizasyon ve nem amacıyla% 70 etanol ile göğüs bölgesinde kürk püskürtün. </li><li> kaburga çevresinde keserek açık göğüs boşluğu, kalp ve akciğerler maruz ve akciğerleri kaldırmak için. </li><li> Bir kağıt mendille hafifçe göğüs boşluğunda kan kaldırın. </li><li> Bir forseps ile yavaşça kalp kavrayın ve cerrahi makas ile aorta ve omurga arasındaki perivasküler yağ dokusunun kesim tarafından aorta ayırmak. </li><li> Hemen whol batırmakbuzla soğutulmuş (4 ° C) Krebs-Ringer tampon maddesi içinde e dokular. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu altında kalp ve aort arkı çıkarın ve tamponda torakal aort segmenti tutun. </li><li> cerrahi makas ve forsepsle bir mikroskop altında perivasküler, yapışan dokulardan aort teşrih. </li><li> Bir forseps ile aort uç kenarından tutun ve yavaşça bir 26 G × 1 / 2&quot; şırınga ile Krebs-Ringer tampon kızarma vasküler lümen kanı temizler. </li><li> 3 mm uzunluğundaki bölümler halinde temizlenmiş aort halkaları kesin. Not: endotel tabakasına zarar vermeyen bu aşamada dikkat ediniz. </li></ol> 3. DHE ve DAF-2DA Boyama <ol><li> 37 ° C&#39;de Krebs-Ringer tampon ile doldurulmuş bir organ banyosu odaları için forseps ile temizlenmiş aort segmentleri transfer% 95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırıldı. forseps ile aort halkaları Touch sadece adventisyal tarafı ve b kelepçe yok: NotLood gemiler. </li><li> 30 dakika boyunca organ banyosu odasında arterleri dengelenmesi. </li><li> nihai konsantrasyon 1 uM, organ banyosuna asetilkolin (Ach) ekleyin ve 10 dakika boyunca damar inkübe edin. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde önceden ısıtılmış Krebs-Ringer tampon maddesi ile (1.000 × stoktan seyreltilmiş, her boyanın 5 uM) DHE / DAF-2DA çözeltisi 1 ml hazırlayın. Işık maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile ependorf tüp sarın. </li><li> Stimülasyon sonrasında 37 ° C&#39;de, bir mikrosantrifüj tüpü içinde DHE / DAF-2DA çözeltisine organ banyosu arasında aortik halkaları transferi% 95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırılmıştır ve 30 dakika boyunca aort halkaları inkübe edin. Not: Bu adımda itibaren, karanlıkta hep aorta tutun. </li><li> Çamaşır yıkama için Krebs-Ringer tampon maddesi ile yeni mikrosantrifüj tüpüne aort halkaları aktarın ve 1 dakika içinde üç kere yıkama gibi tekrar edin. </li><li> 30 için sabitleme için% 4 paraformaldehid çözüm aort halkaları aktarınMin. </li><li> Hazırlama 1 mi 4 &#39;, fosfat tamponlu tuz (PBS), bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tampon (1.000 × stoktan seyreltilmiş 300 nM), 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi. 3 dakika boyunca aorta counterstain. </li><li> 1 dakika boyunca yıkama için PBS tamponuyla yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aorta aktarın. yıkamanın üç kez tekrarlayın. Not: Aort halkaları kelepçe veya endotel tabakası zarar vermemeye dikkat edin. </li></ol> Montaj 4. En Face <ol><li> slayt montaj orta bir damla ekleyin. </li><li> Haddelenmiş-up aorta düz yapabilir ve cam slayt aşağı bakacak şekilde endotel ile montaj ortamında yüz tr monte, mikroskop altında mikrocerrahi makas ile uzunlamasına aort halkaları kesin. ileri ve geri aorta hareket etmiyor. </li><li> kapak kayma ile slayt Kapak ve oje ile slayt mühür. </li><li> Işık koruma altına hava kurutulduktan sonra, korkunç görüntülenmesi için slaytlar kullanınctly veya saat içinde önümüzdeki birkaç gün için -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 5. Konfokal Mikroskopik Görüntüleme <ol><li> floresan sinyalleri algılamak için bir konfokal mikroskop kullanın. Makinenin açın ve büyütme, tarama hızı, çözünürlük, Z-yığını gibi görüntüleme ayarlarını optimize eder. <ol><li> Bu protokol için, bir 1024 × 1024 piksel, 200 Hz tarama hızı, çözünürlük ve 0.25 mikron Z adım boyutu kullanın. oysa 514 nm jeotermal gelen floresan heyecanlandırmak ve 605 nm emisyon de tespit, 488 nm argon lazer ile DAF-2DA gelen floresan heyecanlandırmak ve 515 nm&#39;de algılar. </li></ol></li><li> DAPI sinyali ultraviyole ışınları ile temizlenene kadar örnek üzerinde odaklanmak için 10X büyütme kullanın ve sonra 40X büyütme amacını ayarlayın. </li><li> Kontrol panelindeki Z konumunu ayarlayarak endotel tabakasının aralığını tanımlar. DAPI lekeli çekirdekleri sinyalleri endotel tabakasında oval veya yuvarlak noktalar vardır. </li><li> üst taramaendotel sinyal ve kayıt görüntülerin tam kalınlığı boyunca numunenin (lümen sınırında endotel tabakası). Her numune taramak için en az 3 farklı alanları seçin. </li></ol> Görüntüler 6. Analizi <ol><li> konfokal mikroskop tarafından taranan verileri açmak için yazılımı kullanın. analiz için alan başına art arda üç görüntüleri seçin ve numune en az 3 farklı alanlarda değerlendirmek. seçilen görüntüleri dışa ve JPEG dosyaları olarak kaydedebilirsiniz. </li><li> Görüntü işleme yazılımı ile boyanarak DAF-2DA jeotermal ve DAPI görüntüleri ölçmek. DAPI boyama gelen görüntü için, &#39;Eklentiler&#39; seçeneğini → DAPI pozitif çekirdeğin sayısını saymak için → &#39;Hücre Sayaç&#39; Analiz &#39;. <ol><li> DAF-2DA ve DHE boyaması gelen görüntüler için, sinyallerin yoğunluğunu analiz etmek → &#39;Tedbir&#39; &#39;Analiz&#39; seçin ve göreli sinyal yoğunluğu olarak &#39;Mean&#39; değerini alır. DAF-2DA oranına olarak mevcut sonra sonuçlarDAPI pozitif çekirdekleri veya DAPI için jeotermal enerjiden oranı. Her numune için, her görüntü ve alanın ortalama değerini alır. </li></ol></li><li> katlık değişime almak için kontrol grubunun ortalama her numunenin sonucunu bölün. İstatistiksel analiz Dunnett veya Bonferroni post-testi ile eşleştirilmemiş Student t testi ve ANOVA ile yapıldı. Ortalama ± SEM olarak veri verin. P &lt;0.05 14 anlamlı olarak ortalama değerleri arasındaki farkları göz önünde bulundurun. </li></ol>

<ol>
	<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase:+the+emerging+therapeutic+target+for+vascular+oxidative+stress+and+inflammation.">Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation.</a> Front Immunol. 4, 149 (2013).</li><li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthases:+regulation+and+function.">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li><li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+endothelial+dysfunction+in+atherosclerosis.">Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis.</a> Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).</li><li>Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+endothelial+dysfunction+by+modulating+NOS+uncoupling:+new+insights+into+its+pathogenesis+and+therapeutic+possibilities.">Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).</li><li>Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nitrate,+nitrite,+and+[15N]nitrate+in+biological+fluids.">Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids.</a> Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).</li><li>Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+nitric+oxide+from+L-arginine+in+the+central+nervous+system:+a+transduction+mechanism+for+stimulation+of+the+soluble+guanylate+cyclase.">Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).</li><li>Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+bioassay+method+for+detection+of+EDRF+with+RFL-6+rat+lung+fibroblasts.">A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).</li><li>Guo, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+C-type+natriuretic+peptide+on+spontaneous+contraction+in+gastric+antral+circular+smooth+muscle+of+rat.">Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat.</a> Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).</li><li>Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cells+synthesize+nitric+oxide+from+L-arginine.">Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine.</a> Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).</li><li>Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+L-arginine+and+its+significance+for+the+biosynthesis+of+endothelium-derived+relaxing+factor:+cultured+endothelial+cells+recycle+L-citrulline+to+L-arginine.">The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).</li><li>Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nitric+oxide+production+from+a+perfused+organ+by+a+luminol-H2O2+system.">Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system.</a> Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).</li><li>Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+nitric+oxide+generation+in+the+ischemic+heart+using+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).</li><li>Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+measurement+using+electrochemical+methods.">Nitric oxide measurement using electrochemical methods.</a> Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).</li><li>Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+mitogen-activated+protein+kinase+is+involved+in+arginase-II-mediated+eNOS-Uncoupling+in+Obesity.">p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity.</a> Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).</li><li>Nakatsubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+nitric+oxide+production+from+bovine+aortic+endothelial+cells+using+new+fluorescence+indicators:+diaminofluoresceins.">Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins.</a> FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).</li><li>Hink, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+endothelial+dysfunction+in+diabetes+mellitus.">Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus.</a> Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).</li><li>Okuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaredoxin+in+human+coronary+arteries:+its+potential+role+in+antioxidant+protection+against+atherosclerosis.">Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).</li><li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+red+blood+cells+at+work:+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease.">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li><li>Nunez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+nitroglycerin+and+NO-releasing+drugs+on+mitochondrial+oxygen+consumption,+vasoactivity,+and+the+release+of+NO.">Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO.</a> Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+increased+vascular+superoxide+production+in+human+diabetes+mellitus:+role+of+NAD(P)H+oxidase+and+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase.</a> Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).</li><li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signalling:+the+molecular+interface+connecting+metabolic+stress,+aging+and+cardiovascular+diseases.">mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases.</a> Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).</li><li>Yepuri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+crosstalk+between+arginase-II+and+S6K1+in+vascular+endothelial+inflammation+and+aging.">Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging.</a> Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox1+is+involved+in+angiotensin+II-mediated+hypertension:+a+study+in+Nox1-deficient+mice.">Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice.</a> Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

NO ya da O 2 tespiti .- floresan boyalar ile çoğu zaman dokuya cryosections 23 da kültürlü endotelyal hücrelerde pek çok çalışmada kullanılan ve. Burada yüz NO tespiti ve O 2 .-, nispeten basit ve sezgisel etkili sırasıyla DAF-2DA ve jeotermal, ile endotel tabakasında düzeyleri tr, yani sağlam bir yaşam kan damarları, bu yöntemi genişletilmiş. Bir arter medyada elastik lifler, özellikle cryosections aorta belirli NO veya O 2 ile müdahale edebilecek çok güçlü otofloresans sinyalleri vermek beri vasküler cryosections yöntemin ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, alt arka plan gösterir ve daha nicel olduğunu. - endotel hücreleri içinde üretilen sinyaller. Ayrıca, orta kas hücrelerinin NADPH oksidaz ya da diğer enzimler tarafından spesifik O 2 .- üretimi de engel olabilirvasküler cryosections olan yöntemin dezavantajı temsil vasküler bölümünde, endotelyal hücrelerde sinyalleri. Buna karşılık, en yüz boyama yöntemi sağlam bir damar segmentinin endotel tabakasından özellikle sinyalleri algılar ve bu nedenle daha hassas analiz verir. cryosection hazırlanması için bir kriyostat makinesi de pahalı bir yatırımdır. Diğer biyokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin ana sınırlama daha az nicel, ancak numuneler arasındaki göreceli karşılaştırma için iyi bir seçimdir. Ayrıca, pahalı bir konfokal mikroskop ihtiyacı da bu yöntemin bir sınırlamadır. çoklu organ hücre sistemi uygundur ve bu laboratuarda mevcut değilse tüplerde kan damarları, böylece, kolayca, bir su banyosu ve düzenleyici sistem bir karbon gaz tankına bağlı olan tüpler bir sistem oluşturabilir 37 ° C&#39;de tutuldu ve% 95 O2 ve% 5 CO gaz <sub&gt; 2. bir dikkat ödemek zorunda birkaç kritik adımlar vardır. perivasküler doku Kolay montaj için temizlenmiş olduğundan emin olun. yapay sinyaller neden ve floresan sinyalleri ile müdahale edebilir, çünkü damar lümeninde kan pıhtısı, uzak yıkanmalıdır. Kan damarı hazırlama, inkübasyon, yıkama, kesme ve montaj ile ilgili tüm prosedür sırasında, bir kan damarlarının endotelyal tabakanın zarar vermemek için çok dikkatli olmak zorundadır. hazırlık tüm prosedür sırasında kan damarı kuru izin vermeyin. DHE ve DAF-2DA böylece aorta her zaman ışığa maruz korunmalıdır boyama aşamasından başlayarak, her ikisi de floresan sondalar bulunmaktadır. Tespitten önce aorta endotel hücreleri canlı olmalıdır adım, bu yüzden aorta her zaman% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile gazlı Krebs-Ringer tampon tutulmalıdır. Numunelerin görüntüleri, hazırlandıktan sonra mümkün olan en kısa şekilde alınmalıdır. floresan ışığı yaymaknce sinyal bile sonuçların doğruluğunu etkileyebilir montaj orta korunması, bir kaç gün içinde zayıf hale gelecektir. yöntem çok kalın damar duvarı ile kan damarları için geçerli olmayabilir. İki boyalar birlikte kan damarlarının eklendi Bu yöntem, sağlam kan damarlarının endotel tabakasında eşzamanlı NO hayal gücü ve O 2 .- üretilmesini sağlar. Bir de izole kan damarları in vitro NO ve O 2 .- üretim ilaçların farmakolojik etkilerini değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. Bu amaç için, temizlenen aort genellikle bir kontrol ve bir ilaç tedavisi içindir ve DAF-2DA ve DHE adım boyamadan önce ilacın dengelemeden sonra inkübasyon tamponu ilave edilmelidir, iki parçaya kesilmiştir. Bu yöntem, izole edilmiş kan v vazomotor yanıtlarının analizi ile, örneğin, başka bir yöntemi ile birlikte kullanılırsa, bu, özellikle yararlıdıressels, endotelyal hücrelerin bir fizyolojik fonksiyonu kontrol edilebilir. Bu yöntem, bir hastalık modellerinin sağlam kan damarları ve altında yatan mekanizmaların herhangi bir endotel (dis) fonksiyonunu analizi için de uygun olacaktır. Özetle, biz aynı anda bir floresan konfokal mikroskop ile sağlam kan damarlarının endotel tabakasında NO ve O 2 .- üretimini saptamak için basit bir protokol sundu. Biz bu yöntemi başarıyla obezite fare modelinde nasıl çalıştığını gösteriyor. Bu yöntem çok damar hastalığı koşullarında endotelyal NO soruşturma ve O 2 .- üretiminde yararlı bir tekniktir.

Vasküler endotelyal hücreler vazoaktif faktörlerin 1 serbest vasküler fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü korumak. Bu faktörler arasında, endotelyal NO sentazı (eNOS) ile L-arginin üretilen endotel kaynaklı nitrik oksit (NO), kardiyovasküler fizyoloji 2 en önemli ve en iyi karakterize edilen bir faktördür. NO dolayısıyla vasküler hastalık geliştirme 3 karşı koruma, endotel altı boşluğu içine trombosit agregasyonunu ve inflamatuar hücre yapışması ve infiltrasyonunu inhibe düz kas gevşemesi neden olur ve hücre çoğalmasını inhibe eder. Vb yaşlanma, hipertansiyon, diyabet, hiperlipidemi, aşağıdakileri içeren bir çok fizyolojik ve patolojik koşullar altında, karakterize endotel disfonksiyonu hiçbir biyolojik azalma ve O 2 .- üretimi mevcuttur ve ateroskleroz 2 patogenezi teşvik artmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar eNOS ayrılması bir olduğunu göstermekÇeşitli yukarıda belirtilen koşullar 1,4 altında eNOS enzim O 2 ürettiği endotel disfonksiyonu, .- yerine NO için önemli bir mekanizma. Bu nedenle, endotelyal fonksiyon analizi, özellikle endotelyal NO üretimini ve O 2 .- nesil kardiyovasküler hastalıklar ve komplikasyonları hakkında deneysel araştırmalar için çok önemlidir. analiz eden ve biyolojik örneklerdeki NO üretimini ölçmek için geliştirilmiş bir çok yöntem yaklaşım vardır. Ve NO - 3 - nedeniyle kolaylıkla NO 2 oksitlenir NO derece kararsız olmaları 3 sn 6 arasında bir yarı ömürle, hiçbir doğrudan ölçülmesi çok zordur. / NO - 3 - NO 2 nedenle saptanması sıvısı örneklerinde hücrelere veya dokulara 5 salınan NO indeksi olarak kullanılmıştır. Prosedür, nispeten kolay olmakla birlikte, bu yöntem, ancak, EA/ HAYIR 3 - - çözeltide bulunan sily istikrarlı NO 2 yüksek arka etkilenir. NO siklik guanozin monofosfat (cGMP) 6 üretilmesi için çözünebilir guanilat siklazı uyaran için hücresel cGMP düzeyi de hiçbir serbest 7 tahmin etmek için belirlenmiştir. Yine, bu dolaylı tahmini ve C-tipi natriüretik peptidin (CNP) gibi endotel kaynaklı faktörler de parçacık guanilat siklazın 8 aktivasyonu yoluyla cGMP düzeylerini artırmak olabilir, çünkü spesifik olmayabilir. NO yan ürün 9, L-sitrulin, üretiminin ölçülmesi, bu nedenle, aynı zamanda, NO üretimini tahmin etmek için dolaylı bir yöntem olarak kullanılabilir bir şekilde L-sitrulin üretimi ile L-arginin ile elde edilir. Bu yöntemin en önemli dezavantajı radyoaktif olduğunu ve biyoaktif NO düzeylerini ölçmek olmadığını vardır, O 2 NO hızla inaktive olabilir bıraktığından beri .-; Öte yandan, L-sitrulin l- için geri dönüştürülebilir10 arginin. Bu kimyasal aydınlatma 11, elektron spin rezonansı, 12 veya elektrokimyasal porphyrinic sensör 13 gibi diğer kimyasal yöntemler bazı araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. Bu yöntemler, genellikle tespit prosedürleri işletim kolay değildir ve özel ekipman gerektirir. Birçok çalışma ile veya endotel fonksiyonunu değerlendirmek ve dolaylı olarak endotel kökenli NO aracılı vasküler relaksasyon ölçmek endotel olmadan izole kan damarları ile organ banyosu deneyleri uygulamak söz aynı zamanda. çoğunlukla fizyolojik duruma yakın, ama olmasına rağmen Ancak, bu yöntem, kesinlikle söylemek NO işlevi ölçmez, oldukça bir üretim eNOS fonksiyonunun net etkilerini yansıtan genel olarak endotel aracılı vazomotor yanıtları değerlendiren diğer endotel kökenli gevşetici faktörleri ve endotel kaynaklı sözleşme faktörleri, O 2 .- üretimi, ve düz kas hücrelerinin de yanıtlarıBu faktörler. ENOS işlevi veya NO üretiminin özel bir analiz genellikle 3 gereklidir. Bizimki de dahil olmak üzere pek çok araştırma grupları YOK 14-19 hücre içi üretimini saptamak için floresan boya yöntemi kullanılan son yıllarda var. Bu yöntemde, hücre geçirgen floresan göstergesi diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA), in vitro ya da ex vivo hücre ve dokuları canlı kuru NO ve NOS fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. prensibi canlı hücrelerde, DAF-2DA floresan olmayan 4,5-diaminofluorescein hücre içi esteraz suretiyle sitinin asetili alınır edilir bu o zaman ile reaksiyona sokularak DAF-2 triazol (DAF-2T) floresan dönüştürülmüştür (DAF-2) . DAF-2T floresan flöresanlı bir mikroskop veya flöresanlı konfokal mikroskop 14 altında gözlemlenebilir. Hücre içi floresan yoğunluğu dolayısıyla hücrelerde hücre içi NO üretimini veya sağlam kan vesse bir endotelyumuna yansıtırl. Böyle dihydroethidium (jeotermal) gibi belirli bir floresan boya ile birlikte, bir anda hücrelerde ya da kan damarlarında 14 hücre içi NO ve O 2 .- nesil değerlendirir. Benzer şekilde, DHE hücre geçirgen O 2 ile oksitlenir bileşik .- hücrelerin içinde ve daha sonra nükleik asitler ile intercalates floresan mikroskop veya floresan konfokal mikroskop ile kantitatif tespit edilebilen parlak kırmızı bir renk yayan oksidatif ürünü aynı zamanda. Bu, esas itibariyle, süperoksit radikalleri tespit hücreler tarafından iyi korunur ve hatta hafif tespit 20 tolere edilebilir DHE, O 2 .- biyolojik örneklerden saptanması için çok belirgin bir boyadır. Bu flöresan boyası yönteminin avantajlarından biri de tespit eder ve doğrudan bir oturma kan damarının sağlam endotel tabakası üzerinde cepheden NO ve / veya O 2 .- görselleştiren olmasıdır. Bu sayfada,Bu floresan boya NO algılamak için yöntem ve O 2 .- biz yüz NO tespiti ve O 2 tr için adapte olması tarif .- yüksek yağ-diyet (YYD) besleme tarafından uyarılan bir obezite fare modeli sağlam aorta içinde. Biz bu yöntemi başarıyla ve güvenilir NO ve O 2 .- düzeylerini ölçmek ve obezite taze izole edilmiş sağlam fare aorta endotel tabakasında eNOS (dis) fonksiyonunu değerlendirmek olabilir göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>dissolve with DMSO to 5&amp;nbsp;mmol/L as 1,000x stock, stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>dissolve with DMSO to 5&amp;nbsp;mmol/L as 1,000x stock, stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>dissolve with water to 300&amp;nbsp;&amp;micro;mol/L as 1,000x stock, stored at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Vector labor. (reactolab)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&amp;#969;&lt;/sub&gt;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Myograph System&amp;nbsp;</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>Model 610M</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DM6000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors&amp;nbsp;</td><td>S&amp;amp;T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical scissors&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>S&amp;amp;T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip round diameter 15&amp;nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>Tips 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tips 200 &amp;#956;l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine chloride</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries

endotelyal NO sentaz (eNOS) üretilen Endotel türetilmiş nitrik oksit (NO), kardiyovasküler fizyoloji en önemli vazoprotektif moleküllerden biridir. ENOS ayrılması süperoksit anyon NO biyoyararlanım ve artış azalmaya yol olarak işlevsiz eNOS gibi (O 2 .-) üretim ve sırayla kardiyovasküler hastalıklar teşvik etmektedir. Bu nedenle, endotel hücreleri NO ve O 2 .- seviyelerinin uygun ölçüm kardiyovasküler hastalıklar ve komplikasyonları hakkında araştırma için hayati önem taşıyor. Çünkü NO ve O 2 .- son derece kararsız doğasından ötürü, herhangi bir önlem ve O 2 .- doğrudan kan damarına zordur. Birçok yöntem HAYIR ölçmek ve O 2 .- üretim için geliştirilmiştir. Ancak, her iki hassas olmayan ya da spesifik olmayan ya da teknik olarak zor ve özel ekipman gerektirmektedir. Burada bir adaptasyon tarifYüz eş zamanlı olarak saptanması ve hücre içi NO ve O 2 görselleştirme tr .- kaynaklı bir obezite fare modeli sağlam aorta sırasıyla, hücre geçirgen diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak floresan boya yöntemi yüksek yağ-diyet beslenme ile. Kontrol yalın fare ile karşılaştırıldığında Biz obezite fare taze izole edilmiş sağlam aorta 2 .- seviyeleri hücre içi NO azalmış ve O zengin oldukları olabilir. Bu yöntem, doğrudan algılama ve görselleştirme NO ve O 2 için kolay bir teknik, .- sağlam kan damarlarında ve yaygın (fizyo) patolojik koşullarda, endotelyal (dis) fonksiyonunun incelenmesi için uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

Obezite iskemik koroner kalp hastalığı için önemli bir risk faktörüdür ve ilişkili NO biyoyararlanımını, aterosklerotik damar hastalığı 21 bir işaretidir endotel azalır. eNOS-ayrılması 22, ateroskleroz ve obezite 14 yaşlanma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik ve patolojik koşullar altında endotel disfonksiyonu için önemli bir mekanizma olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada temsili NO sonucunu ve O 2 .- aorta seviyeleri göstermek için zayıf ve obez fareler karşılaştırın. % 10.6 yağ,% 27.6 protein ve% 57 karbonhidrat, lif% 4.8: Enerji içeriği; 7 haftalıkken başlayarak, erkek fareler (C57BL / 6J) ya normal chow (NC 14 hafta boyunca ücretsiz erişim verildi ) ya da yüksek yağlı diyet (YYD, enerji içeriği:% 55 yağ,% 21 protein ve% 24 karbonhidrat). YYD farelerde 14 hafta vardı sonrakurban ve göğüs aorta disseke ve yapışan dokuların temizlendi. DAF-2DA ve DHE aşamasını lekelenme, eNOS LN G -Nitroarginine metil ester (L-NAME) (1 mM), eNOS aktivitesi 14 engellemek için 1 saat boyunca banyosu bölmesine ilave edildi inhibitör. Temsilci konfokal floresan sonuçları Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Üst panelde mavi renk DAPI ile boyanmış endotel hücreleri çekirdeğini temsil etmektedir. orta panelde, yeşil renk floresan olmayan DAF-2 NO, yeşil sinyal yoğunluğu yüksek ise gelir dönüştürülmüş DAF-2T floresan sinyali, hücrelerde NO daha vardır. Benzer şekilde, alt panelde kırmızı renk O 2 .- tarafından okside jeotermal floresan sinyali, yani daha kırmızı renk gösteren örnek daha fazla O 2 .- hücrelerinde vardır. Konfokal floresan mikroskopi azalma görüldüD farelerinin aort endotel tabakasının NO üretimi sağlar (DAF-2DA boyama) ve artan L-NAME duyarlı O 2 .- nesil (DHE boyama), farelerin bu NC (Şekil 1) 14 beslenir karşılaştırıldığında HFD beslenen eNOS-uncoupling düşündüren obezitede. Sinyalleri sayısal ve çubuk grafikler 14 sunuldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53718/53718fig1.jpg" /> Şekil obezite 1. eNOS-sökme. Yüz NO tespiti ve O 2 tr Konfokal mikroskopik .- sırasıyla DAF-2DA ve DHE boyaması ile. n = 5; *** p &lt;NC vs 0.005; ††† p &lt;YYD grubunda vs 0.005. Ölçek çubuğu = 0.1 mm. (Veriler referans 14 idi) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53718/53718fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries at JoVE.com

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

en-face-detection-nitric-oxide-superoxide-endothelial-layer-intact

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

9.5K Görüntüleme.  University of Fribourg.  Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir. 

Video: En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Tıp

Ultrasound Assessment of Endothelial-Dependent Flow-Mediated Vasodilation of the Brachial Artery in Clinical Research

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The endothelium acts as a barrier, preventing leukocyte adhesion and aggregation, as well as controlling permeability to plasma components. Functionally, the endothelium affects vessel tone.
Endothelial dysfunction is an imbalance between the chemical species which regulate vessel tone, thombroresistance, cellular proliferation and mitosis. It is the first step in atherosclerosis and is associated with coronary artery disease, peripheral artery disease, heart failure, hypertension, and hyperlipidemia.
The first demonstration of endothelial dysfunction involved direct infusion of acetylcholine and quantitative coronary angiography. Acetylcholine binds to muscarinic receptors on the endothelial cell surface, leading to an increase of intracellular calcium and increased nitric oxide (NO) production. In subjects with an intact endothelium, vasodilation was observed while subjects with endothelial damage experienced paradoxical vasoconstriction.
There exists a non-invasive, in vivo method for measuring endothelial function in peripheral arteries using high-resolution B-mode ultrasound. The endothelial function of peripheral arteries is closely related to coronary artery function. This technique measures the percent diameter change in the brachial artery during a period of reactive hyperemia following limb ischemia.
This technique, known as endothelium-dependent, flow-mediated vasodilation (FMD) has value in clinical research settings. However, a number of physiological and technical issues can affect the accuracy of the results and appropriate guidelines for the technique have been published. Despite the guidelines, FMD remains heavily operator dependent and presents a steep learning curve. This article presents a standardized method for measuring FMD in the brachial artery on the upper arm and offers suggestions to reduce intra-operator variability.

Endothelial dysfunction is associated with numerous disease states and is predictive of adverse cardiovascular events in humans. Flow-mediated vasodilation (FMD) is a non-invasive ultrasound method of evaluating endothelial function. Methodological choices and operator experience may affect results. A systematic approach to FMD in human studies is discussed here.

Klinik Araştırmalarda Brakial Arter Ultrason değerlendirilmesi Endotel Bağımlı Akış Dolayımlı Vazodilatasyon

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Biyoloji

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Floresan Görüntüleme ve EPR Kullanılarak Trombositlerde Süperoksit Anyonunun Tespiti

Alternative Methods for the Detection of Superoxide Anion Generation in Platelets

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ability to react with important biological molecules such as proteins, nucleic acids, and lipids. Superoxide anions are important ROS generated by the reduction of molecular oxygen reduction (i.e., acquisition of one electron). Despite their initial implication exclusively in aging, degenerative, and pathogenic processes, their participation in important physiological responses has recently become apparent. In the vascular system, superoxide anions have been shown to modulate the differentiation and function of vascular smooth muscle cells, the proliferation and migration of vascular endothelial cells in angiogenesis, the immune response, and the activation of platelets in hemostasis. The role of superoxide anions is particularly important in the dysregulation of platelets and the cardiovascular complications associated with a plethora of conditions, including cancer, infection, inflammation, diabetes, and obesity. It has, therefore, become extremely relevant in cardiovascular research to be able to effectively measure the generation of superoxide anions by&#160;human platelets,&#160;understand the redox-dependent mechanisms regulating the balance between hemostasis and thrombosis and, eventually,&#160;identify novel pharmacological tools for the modulation of platelet responses leading to thrombosis and cardiovascular complications. This study presents three experimental protocols successfully adopted for the detection of superoxide anions in platelets and the study of the redox-dependent mechanisms regulating hemostasis and thrombosis: 1) dihydroethidium (DHE)-based superoxide anion detection by flow cytometry; 2) DHE-based superoxide anion visualization and analysis by single platelet imaging; and 3) spin probe-based quantification of superoxide anion output in platelets by electron paramagnetic resonance (EPR).

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: ROS Tespiti için Yenilikçi Teknikler ve Trombosit Araştırmaları için Çıkarımlar

The generation of superoxide anion is essential for the stimulation of platelets and, if dysregulated, critical for thrombotic diseases. Here, we present three protocols for the selective detection of superoxide anions and the study of redox-dependent platelet regulation.

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler 

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Klinik Araştırmalarda Brakial Arter Ultrason değerlendirilmesi Endotel Bağımlı Akış Dolayımlı Vazodilatasyon

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Gelişim ve karakterizasyonu