This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.

Tüm hayvan protokolleri gözden geçirilmiş ve Güney Carolina Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (güvence numarası: A3049-01) tarafından onaylanmıştır. 1. Düşük yoğunluklu Embriyonik Nöronal Kültür <ol><li> Primer kortikal nöron kültürü için hazırlık <ol><li> Çözümler: <ol><li> 10 ml borat tamponu Poli-L-Lizin 5 mg çözülmesiyle Poli-L-Lisin stok çözelti hazırlayın. </li><li> 49 mi borat tamponu içinde 1 ml poli-L-lizin stok seyreltilmesi ile çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> 395 mi DH 2 O ile başlayan ve daha sonra tüm maddeler (Boraks 1.24 g borik asit + 1.9 g) eklenerek borat tamponu, pH 8.4 hazırlanır. 1 M NaOH ile 8.4 pH ayarlayın. 400 ml ayarlayın ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li><li> 445 ml dH 2 O ile başlayan ve diğer tüm maddeler ekleyerek HBSS çözüm, pH 7.2 hazırlayın (50 ml 10X HBSS Stok + 1.2 g HEPES). 1 N HCI, bri tarafından pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayınng 500 ml ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li><li> % 10 fetal bovin serumu içeren DMEM / F12: Kaplama orta hazırlayın. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li><li> tam büyüme ortamı hazırlayın: 50 ml Neurobasal orta için, takviyeleri ekleyin (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glukoz antibiyotik antimikotik çözüm (100X + 1 ml B-27 (50X) + 500 ul) + 100 ul% 7.5 sodyum Bikarbonat. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre. </li></ol></li><li> İki gün kültür öncesi: <ol><li> 2 Poli-L-Lizin çalışma solüsyonu ve kaput O / N altında tutmak ile kaplayın oniki 35 mm cam alt yemekler. </li></ol></li><li> kültür bir gün önce: <ol><li> GKD 2 O. ile boş kaplama yemekler ajan ve durulama Yemekler kaputun altında bir saat kurumaya bırakın. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (toplam çözeltinin% 10) ile kaplanmış ortamı (DMEM / F12 hazırlayın. Pipet 2 mi ortam içineher yemeğin ve 37 o C,% 5 CO 2 O / N kuluçkaya yatmaktadır. Not: kültürlerken plastik kültür kaplarına önlemek için önemlidir. cam alt (ters Mikroskop) yemekleri ya da (dik mikroskoplar) cam lamelleri kullanılması keskin ve net görüntüler verir. Bir plastik alt tabak ile karşılaştırıldığında, cam alt çanak floresan mikroskopi sırasında istenmeyen tonları veya parlamayı önler. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre kültürü protokolü: <ol><li> HBSS Buffer (100-150 ml), buzdolabında koymak 100 mm petri, forseps, makas, 50 ml tüpler ve kaputu UV ışık altında 15 ml tüpler. </li><li> kültür odası dışında başlık altında% 5 sevofluran öldürücü inhalasyon ile gebe sıçan Euthanize. </li><li> % 70 EtOH, çadır karın cavity.Open plasentayı maruz makas kullanarak rahim ortasında kuyruk yukarıya kesim sırasında forseps kullanarak alt karın derisi ile sterilize edin. </li><li> 8-10 E18 fetus çıkarın. PlaHBSS çözeltisi ihtiva eden petri çanakları 8-10 fetus ce. </li><li> forseps ile fetusun başının arkasını tutun, sonra vücuttan kafasını koparmaya makas kullanın. HBSS 5-7 ml ile dolu başka bir petri yerleştirin. kaput çanak aktarın. </li><li> Soğuk HBSS ile iki ek 100 mm petri doldurun. </li><li> Peel kenara kafatası ve HBSS ile dolu yeni bir petri içine beyin kepçe. </li><li> sonra bunun soğuk HBSS ile yeni bir petri beyin transferi, beyinden gelen keskin kavisli bir forseps, ayrı beyincik ve beyin sapı kullanın. </li><li> kavisli bir forseps ile hemisfer ayırmak, sabitlemek için cımbız kullanın. meninks çıkarın; İşaretli 15 ml santrifüj tüplerine frontal korteks ve transfer parçaları izole. </li><li> Taze 2 mi HBSS ile 15 ml tüp doldurun ve her biri 15 ml&#39;lik bir tüpe 20 ul tripsin EDTA (% 0.5 tripsin ve 5.3 mM EDTA. 10x konsantre edildi) ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkalayın. Yavaşça tüpü birkaç dakikada girdap, yerleşme izin vermez. </li><li> After 10-15 dk, kullanım cam pipet eski HBSS kaldırmak ve yeni HBSS ile iki kez durulayın. </li><li> (2 mi HBSS içinde 1 mg / ml, 2 mg tripsin inhibitörü) tripsin inhibitörü daldırın, iyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. Taze HBSS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yine bir kalibre pipet ve çok yavaş homojen hale gelene kadar azaltılmış ucu çapı ile steril bir ucunu kullanarak bubbles.Triturate önleyecek şekilde çok yavaş çiğnemek beyin parçaları, lastik ampul 10-15 kez cam pipet kullanarak. </li><li> Aktarım istenilen yoğunlukta hücreler çözülmüş kaplanmış kültür kaplarına (50 hücre / mm2) hazırlanmış ön. 37 o C,% 5 CO2 O / N inkübe edin. </li><li> 24 saat sonra, taze tam büyüme serumsuz Neurobasal orta DMEM / F12 ortamı değiştirin. </li><li> Deney için en az 12-14 gün% 5 CO 2/95% odada nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde her zaman hücreleri korumak. Taze Neurobasal orta yaşlı orta yaklaşık% 50 yerine her 5-6 gün hücreleri tamamlar. </li></ol></li></ol> 2. Floresan Etiketleme ve İmmünositokimya Not: Birincil kortikal hücre kültürleri immünofloresan markalama 1 ml&#39;lik bir çalışma hacmine sahip cam alt 35 mm&#39;lik bir hücre kültür tabaklarında gerçekleştirilmiştir. <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) ile iki defa cam alt bulaşık yıkama. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak. </li><li> PBS ile iki kez yıkanır hücreler, 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği. </li><li> F-aktine özel leke ile oda sıcaklığında 20 dakika için hücreleri tedavi, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 1 ml PBS içinde Phalloidin 25 ul). </li><li> PBS ile iki kez hücreleri durulanır ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 normal keçi serumu ile bloke eder. </li><li> % 2 normal keçi serumu ile PBS içinde 4 O ° C&#39;de O / N inkübe: Tavuk poliklonal anti-MAP2 antikoru (2.500 1) ile seyreltilir </li><li> inkübasyondan sonra, iki kez PBS ile durulayın. </li><li> ikincil antikor (Alexa R sulandırmakEd 594-konjuge keçi anti-tavşan IgG&#39;si (1: 500)% 2 normal keçi serumu ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS ile durulayın ve 10 ul / Hoescht boya çanak ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın ve iki kez PBS ile yıkayın. Not: Adım 3 (F-aktin puncta sayma) için artık etiketli hücreler hazır. </li><li> Bir Lamel Kapatma ajan olarak antifade reaktif 100 ul ile hücre örneği korumak ve uzun süreli depolama için karanlıkta 4 o C&#39;de tutun. Not: Phalloidin antifade Lamel reaktifleri ile korunabilir 1 hafta ve floresan kadar karanlıkta 4 ° C&#39;de PBS içinde nispeten kararlıdır. Phalloidin uzatılmış depolama ile difüze başlayabilir Bununla birlikte, uygun resim boyama sonrası 1-3 gün elde edilir. </li></ol> 3. F-aktin puncta Sayma <ol><li> floresan mikroskop açın ve 20 × amacı geçmek. Açık mikroskop yazılımı ve 1280 × 960 piksel görüntü boyutunda program kurmak, ve 0.11 × zum 7 mikron / piksel görüntü çözünürlüğü. </li><li> Kırmızı yeşil (495 nm) / (613 nm) floresan kanal altında eş etiketli F-aktin / map2 nöronların görüntüler elde. </li><li> 5 Yeşil (F-aktin) / Kırmızı (map2) immunolabeled / Mavi (Hoescht) açıkça tanımlanmış dendritik milleri ile bireysel nöronun floresan görüntüleri seçin. </li><li> Sürekli map2 immünofloresan ile ikinci dereceden dendritik segmentte (uzunluk aralığı 25-75 mikron) F-aktin zengin yapıları belirleyin. </li><li> yatay bir seviyeye görüntüleri seçili bölgeyi döndürün. yeni bir resim olarak Kopyala ve yapıştır. </li><li> Her yemeğin tutarlı ayarlamalar kullanarak, görüntülerin arka planını çıkarın. </li><li> Parlak yeşil F-aktin puncta saymak ve elle eğitimli bağımsız gözlemciler tarafından seçilen dendritik parçasının uzunluğunu iz. Bir tablo dosyasına veri verir. </li><li> Map2 dendrit etiketli uzunluğu (L) toplam F-aktin etiketli puncta (N) bölünmesi ile yoğunluğunu hesaplayınız. F-ac sayısı Express verilerinidendrit 10 mikron başına kalay puncta Not: puncta dendritik mili boyanma ortalama yoğunluğu en az 50% bir tepe şiddetine sahip F-aktin floresans (boyut ≤1.5 um), seçilen her bir dendritik bölümüne dahil edilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses.">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572 (2012).</li><li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters.">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li><li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation.">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li><li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines.">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li><li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities.">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li><li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin.">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li><li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat+protein+variants:+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury.">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure:+neurorestoration+by+phytoestrogens.">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li><li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration.">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li></ol>

None of the authors have conflicts of interest to declare.

Bu protokol, bize bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta sıçan kortikal nöronların kültürleme açıklar. Sonra, dendritik değişiklikleri tespit etmek faloidin ve map2 boyama kullanın. Sonra, F-aktin puncta değişiklikleri ölçmek için özel yazılım kullanılır. F-aktin puncta bireysel nöronun tüm nöronal ağ açıkça görünür olmalıdır değişiklikleri belirlemek için, bu tek bir nörondan uygun ikinci dereceden dendritik segmentlerin seçilmesini sağlar. Düşük yoğunluklu kaplama bireysel nöronlar görselleştirmek ve glial hücrelerin varlığını en aza indirmek için, her iki için kritiktir. Astrositler da F-aktin içeren ve bir nöronal marker olmadan, F-aktin pozitif puncta analizini bulandırabilir olabilir. Düşük yoğunluklu kültürleri Neurobasal ortamın kullanılması hücre kültürlerinde astrositik proliferasyonunu azaltmada faydalıdır. Ancak, F-aktin proteini olduğu ihtar verildinöronlar gibi MAP2&#39;nin spesifik nöronal protein işaretleri, özel olmayan, falloidinle birlikte kullanılmalıdır. Diğer protein antikorları aynı zamanda kültür içinde spesifik sinir hücresi popülasyonlarının tanımlanması için örneğin TH olarak Phalloidin (tirosin hidroksilaz) ile bağlantılı olarak kullanılabilir. sinaps ve sinaptik morfoloji eğitim için genel bir tekniktir immünsitokimya (ICC) &#39;dir. Sinaptik proteinler için birçok antikorlar PSD 95 de dahil olmak üzere hali hazırda mevcuttur, çünkü ICC popüler, (post-sinaptik) yanı sıra, sinaptofisin, bassoon ve (pre-sinaptik) sinapsin NMDAR Bununla birlikte, bazı yapıların ICC (örneğin, tespit edilemez 11. ince filopodia), fakat antikor tespiti (veya iki farklı antikorları ile çift etiketleme ile F-aktin Phalloidin etiketleme bir kombinasyonu) sinaptik alt popülasyonları ve deneysel tedaviler diferansiyel yanıtları özel ve karmaşık soruşturma için izin verebilir. F-aktin puncta katılımı ile olabilirDeneysel tedavilere durum daha ziyade hassas. Son zamanlarda, HIV-1 Tat proteini ile tedavi belirgin nöronal ölüm (48 sa) 10 uygun herhangi bir kanıt önce F-aktin puncta (24 saat) bir düşüş yarattığını gösterdi. Bu not deneysel tedaviler olabilir ya artışı (memantin) veya azaltmak (metamfetamin + HIV-1 Tat) F-aktin puncta biridir. Biz de F-aktin puncta kaybı özgü deneysel tedaviler 10 Aşağıdaki tersine çevrilebilir bir tepki olduğunu gördük. Bunun gibi, F-aktin puncta ölçümü akut synaptopathy değil, aynı zamanda sinaptik kurtarma ve deneysel neurorestoration süreçlerini incelemek için sadece izlemek için değerli bir araçtır.

Bu çalışmanın temel amacı, nöronal dendritik ağın sinaptik bütünlüğünün ölçümü (tahmini) güvenilir bir yöntem geliştirmektir. Burada Phalloidin boyama ve uzman (NIS-Elemanları) yazılımı kullanılarak takip eden analizi ile dendritler immunositokimyasal (ICC) taramadan oluşan bir kombinasyon kullanılarak primer fare kültürlenmiş nöronlar F-aktin puncta ölçülmesini açıklar. Etiketli phallotoxins büyük ve küçük ipliklerin (F-aktin) için benzer bir yakınlığa sahip fakat bazı aktin antikor 1 farklı olarak, monomerik küresel aktin (G-aktin) bağlanmaz. Phalloidin bağlayıcı Nonspesifik böylece hücresel görüntüleme sırasında en az bir arka plan sağlayarak, ihmal edilebilir düzeydedir. Phalloidin genellikle Phalloidin F-aktin çok daha yoğun etiketleme sağlar flüoresan mikroskopi için hücresel proteinleri etiketlemek için kullanılacak antikorlar çok daha küçüktür. Böylece, nöronlarda F-aktin lokalizasyonu detaylı görüntüler olabilirişaretlenmiş falloidinle kullanılması yoluyla elde edilmiştir. Phalloidin nöronal dendritler (F-aktin) boyama olgun dikenleri olmayan dikenli sinaps 2 ve olgunlaşmamış dikenler de dahil olmak üzere dendritik yapıların, çeşitli temsil eden ayrık &quot;sıcak noktalar&quot; ya da parlak &quot;puncta&quot; oluşturur. Olgunlaşmamış dikenleri ince filopodia ve yama morfolojisi bazı formları içerir ve spinogenesis 3 başlatılmasını temsil edebilir. Olgunlaşmamış dikenleri olan ve olmayan dikenli yamalar PSD95 4 yoksundur. Sadece dikenler sonraki değişiklikler değil, aynı zamanda ek dendritik yapılara F-aktin kurşun üretiminde değişiklikler, böylece synaptodendritic bütünlüğünü 5-7 araştırmak için önemli bir araç faloidin adrestir. Genel olarak, Phalloidin-pozitif (F-aktin) puncta sayısı bir aktif sinapsların arasında bir denge (eksitatör ve inhibitör), aktin dinamiklerini ve sinaps istikrar 8 yansıtmaktadır. belirli t incelemek önemli olmasına rağmenBir tedavinin hedefi bilinmediğinde sinaps (yani, uyarıcı dikenleri) bir Dosya türleri, ilk dendritik yapıların çeşitli genel bütünlüğünü tahmin etmek için gereklidir. F-aktin önleyici sinaps bir synaptopathy gösterebilir F-aktin puncta bir değiştirilmiş sayısı dahil olmak üzere dendritik dikenler ve diğer yapıların, önemli bir bileşeni olduğu için. Bu synaptopathy daha sonra belirli değişiklikler için daha fazla araştırılması olabilir. Birden fazla sinaptik türleri / yapıların tespiti için bizim miktar yöntemi çeşitli deneysel tedaviler aşağıdaki dendritik sinaptik değişiklikler (artış ve azalışlar) genel bir tahmin verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass</td>
			<td style="width:155px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:121px;">P35G-1.5-20-C</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">10565-018</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:211px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">15400-054</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P9155</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:211px;">Boric acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B0252</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:211px;">Borax</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B9876</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">35050-061</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">101174Y</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:211px;">HBSS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H4641</td>
			<td style="width:139px;">10X</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">21103-049</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">17504-044</td>
			<td style="width:139px;">50X</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td style="width:155px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">30004CI</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">25080</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Vannas Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500086</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500216</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Iris Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">15914</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:211px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14097</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14095</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:211px;">ProLong Gold</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">P36930</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P6148</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">Cover glass</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">631-0137</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">AlexaFluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A12379</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">26050-070</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">Chicken polyclonal anti-MAP2</td>
			<td style="width:155px;">abcam</td>
			<td style="width:121px;">Ab92434</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A11042</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">R37605</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:211px;">NIS-Elements software package</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:211px;">Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:211px;">0.2 &#956;m Nalgene nylon membrane filter</td>
			<td style="width:155px;">Fishersci</td>
			<td style="width:121px;">151-4020</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of filamentous actin (f-actin) puncta in rat cortical neurons

(F-aktin) İpliksi aktin proteini spinogenesis, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitesinde önemli bir rol oynar. dendritik F-aktin zengin yapılardaki değişiklikler sinaptik bütünlük ve bağlantı değişiklikleri göstermektedir. Burada F-aktin puncta ve sonraki ölçümü teknikleri için birincil sıçan kortikal nöronların, Phalloidin boyama kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. İlk olarak, E18 fare embriyonlarının frontal korteks, daha sonra, düşük yoğunluklu, hücre kültürü içine en az 12-14 gün boyunca in vitro yetiştirilen nöronlar ayrışmış. Deneysel tedaviden sonra, kortikal nöronlar AlexaFluor 488 falloidinle boyanır ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (dendritik F-aktin puncta etiket) (MAP2; nöronal hücreleri ve dendritik bütünlüğünü doğrulamak için). Son olarak, özel yazılım analiz ve rastgele seçilen nöronal dendrite ölçmek için kullanılır. F-aktin zengin yapılar ikinci mertebe dendritik dalları (uzunluk aralığı 25-75 ve tespit edilir# 181; sürekli map2 immünofloresan ile m). Burada sunulan protokol deneysel tedaviler sonrasında dendritik sinaps yapılarında değişiklikler araştırmak için faydalı bir yöntem olacaktır.

Mevcut yöntemlerle, biz ilk kültür sıçan bizi bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta, kortikal nöronlar. Şekil 1 &#39;de, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve görüntüler gün 4, 6, 10, in vitro olarak 14, 21 ve 27 fetal sıçan kortikal nöronlar geliştirmek morfolojik değişiklikleri gösterir. uzunluk ve Dentritlerin sayısı kültürlü sıçan primer nöronlar olgunlaşması ile artış olduğunu unutmayın. Nöronlar, sadece 14 gün olgunlaşmasından sonra deneylerde kullanılır. dendritik ve sinaptik değişiklikleri tespit etmek, biz dendritlerinin map2 antikor tespiti ile Phalloidin F-aktin etiketleme birleştirir. F-aktin Phalloidin etiketleme (20-30 dk) çok hızlı olduğundan görsel ICC antikor etiketleme (Şekil 2 geçmeden önce synaptodendritic ağın bütünlüğünü tahmin etmek mümkün değildir </strong&gt;). Map2 bozulmamış dendritler gösterir ve Phalloidin boyama örter. Bu F-aktin puncta nöronal dendritler üzerinde bulunan ve bu tür astrositler gibi diğer hücrelere, lokalize olmayan onay verir. Sonra, eş-etiketli Phalloidin (F-aktin) / map2 nöronların yüksek çözünürlüklü görüntüler elde ve rastgele seçilen nöronlar analiz. Güzel filopodia, omurga çıkıntılar ve F-aktin yamalar F-aktin zengin yapılar olarak kabul edildi ve çalışmalarımız (Şekil 3) alındı. (MAP2 pozitif) ikinci derece dendritler segmentleri F-aktin puncta yoğunlukları analizi için seçildi. Map2 pozitif boyanma F-aktin puncta nöronal lokalizasyonu onaylamak için kullanılır. Bilgisayar destekli algılama ve Phalloidin (F-aktin) etiketli (yeşil floresan kanal) sayma sinaptik puncta özel yazılım kullanımı yoluyla gerçekleştirildi. Şekil 4, adım ayrıntılı protokol ile bir kademe mevcuttur </strong&gt; yazılım paketinin kullanımını anlatan. Biz bilgisayar destekli F-aktin sayım F-aktin elle sayım ile en iyi korelasyon olduğunu ve iki eğitimli gözlemciler arasında F-aktin puncta sayılarında gözlemciler arası korelasyon (r 2 = 0.97) çok yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Daha önce, HIV-1 Tat-kaynaklı synaptopathy 10 HIV-1 Tat 9 ve geri neden synaptodendritic hasarı değerlendirmek için F-aktin puncta ölçülmesini kullanılır. Şekil 5, sıçan kortikal nöronlar eş etiketli, HIV-1 Tat tedavi 50 nM sonra Phalloidin ve MAP2 antikor. MAP2 boyama az dendritik dalları ortaya ve HIV-1 Tat-tedaviden sonra F-aktin azaldı. Bulduğumuz F-aktin puncta deney uygulamaya yanıt olarak artış veya azalma olabileceği gibi. Şekil 6&#39;da, kültürlenmiş nöronlar th ile muamele edildiE rekabetsiz NMDA reseptör antagonisti memantin önemli ölçüde F-aktin pozitif puncta artar. Bunun aksine, metamfetamin + HIV-1 Tat bir kombinasyonu ile tedavi F-aktin puncta önemli bir kayıp ile sonuçlanmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig1.jpg" /> Şekil hücre kültüründe 1. Fetal sıçan kortikal nöronlar 4 arasında fetal sıçan kortikal nöronların Diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri -. Vitro 27 gün (20X). Nöronlar in vitro 14 gün olgun görünüyor. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig2.jpg" /> Sıçan kortikal nöronlarda Şekil 2. Phalloidin / map2 ko-etiketleme. MAP ile etiketlenmiş Kültür nöronlar2 antikoru (kırmızı) ve Phalloidin (yeşil). Birleştirilmiş görüntüleri Phalloidin boyama nöronal dendritler (20X) lokalize belirlenmesi. Izin <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53697/53697fig3.jpg" /> Sıçan kortikal nöronların Şekil 3. F-aktin sinaptik yapılar. (A) Sol - Phalloidin (60X) ile etiketlenmiş F-aktin pozitif yapılar. ok uçları F-aktin etiketli yapılar mantar dikenleri (mor), yama benzeri morfoloji (mavi) ve uzun filopodia (turuncu) içerir gösterir. Orta - Bu F-aktin yapıları gösteren Birleştirilmiş görüntü dendritler (20X) lokalize edilmiştir. Sağ - Sağ alt Kutu analizi (20X) için seçilen ikinci dereceden dendritik şube gösterir (B) Phalloidin (F-aktin) (Yeşil) / map2 dendritik segmentleri.<html> (Kırmızı) eş-etiketli kortikal nöronlar (20X) F-aktin puncta nöronal kaynağını doğrulamak için kullanılır. Yeşil yalnızca resim (Phalloidin / F-aktin) ayrıca işlenir. Puncta sayımı için seçilmiş en çok üç dendritik segment (C) Phalloidin / F-aktin (yeşil) ve görüntüler. Yoğunlukları N / L bölünmesi ile tespit edilir. N = puncta, L = dendritik segmentin uzunluğu sayısıdır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53697/53697fig4.jpg" /> Yazılım paketinin 4. Gösteri Şekil:. Adım adım yönergeler <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /53697fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5. HIV-1 Tat sıçan kortikal nöronlarda synaptodendritic yaralanma aracılı. Hücre kültürleri, HIV-1 Tat proteini tedavisi (50nM) sonra F-aktin ve map2 eş boyandı. Üst Sağlam F-aktin, karmaşık dallanma desenleri ve geniş ince nöronal süreçleri gösteren işlenmemiş nöronlar paneller. Alt paneller - F-aktin azalmış ve azalmış dendritik dallanma HIV-1 Tat proteini tedavi nöronlar. (20X) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53697/53697fig6.jpg" /> Şekil 6. F-aktin sıçan kortikal nöronlarında puncta. Metamfetamin + Tat tedavi genel Memantin tarafından üretilen farklı etkileri tedavi edilmemiş kültürlenmiş nöronların Görüntü (20X) memantin (10 uM) ile muamele nöronlar ve sinir Methamph ile işlemden geçirildietamine (20 uM) Tat (10 nM) + 10 nM. Metamfetamin + HIV-1 Tat Tedavi F-aktin boyama azalmış ve dendritik dallanma gerilemiştir Memantin tedavisi, F-aktin boyama arttı. Memantin tedavisi, muamele edilmemiş kontrol kültürlerine göre F-aktin puncta yoğunluğu artmıştır. Bunun aksine, metamfetamin + HIV-1 Tat tedaviler önemli ölçüde muamele edilmemiş kontrol kültürlerine göre F-aktin puncta yoğunluğu azalmıştır. + SEM, * p &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons at JoVE.com

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

12.0K Görüntüleme.  University of South Carolina. Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Video: Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Nörobilim

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...