This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.

全ての動物プロトコルを見直し、サウスカロライナ大学の動物実験委員会（保証番号：A3049-01）によって承認されました。 1.低密度胚性神経文化<ol><li> 初代皮質神経細胞培養のための準備 <ol><li>ソリューション： <ol><li> 10 mlのホウ酸緩衝液中のポリ-L-リジン5mgを溶解することによりポリ-L-リシンストック溶液を調製します。 </li><li> 49ミリリットルホウ酸緩衝液中で1ミリリットルポリ-L-リジンストックを希釈して使用液を調製します。 </li><li> 395ミリリットルのdH 2 Oで開始し、その後、全ての成分（ホウ砂の1.24グラムのホウ酸+ 1.9グラム）を加えることによりホウ酸緩衝液、pH 8.4を準備します。 1MのNaOHにより8.4にpHを調整します。 400ミリリットルに調整し、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。 </li><li> 445ミリリットルのdH 2 Oで始まるとすべての他の成分（50ミリリットル10X HBSS証券+ 1.2グラムHEPES）を追加することで、HBSS溶液、pHが7.2を準備します。 1NのHCl、BRIにより7.2にpHを調整しますNGに500ミリリットルとは、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。 </li><li> 10％ウシ胎児血清を含むDMEM / F12：メッキ培地を準備します。ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでフィルタリングします。 </li><li>完全増殖培地を準備します50ミリリットルNeurobasal培地に、サプリメントを追加する（500μlのグルタマックス（100X）+ 500μlのグルコース抗生物質 - 抗真菌溶液（100Xの+ 1ミリリットルのB-27（50X）+500μlの）+100μlの7.5％炭酸水素ナトリウムはボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでフィルタリングします。 </li></ol></li><li>文化の前に二日： <ol><li>ポリ-L-リジンの2ミリリットルワーキング溶液でコート12 35ミリメートルのガラスボトムディッシュを、フードのO / Nの下におきます。 </li></ol></li><li>文化の一日前： <ol><li>皿から空のコーティング剤とのddH 2 Oですすぎ料理はフードの下で時間乾燥することができます。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（全溶液の10％）でメッキ培地（DMEM / F12を準備します。ピペット2ミリリットル培地に各皿、および37°Cの 、5％CO 2でO / Nインキュベートします。 注：培養する場合には、プラスチック培養皿を回避することが重要です。 （直立顕微鏡用）（倒立顕微鏡用）ガラスボトムディッシュの使用またはカバーガラスは、シャープでクリアな画像が得られます。プラスチックボトムディッシュに比べて、ガラスボトムディッシュは、蛍光顕微鏡検査の際に、不要な色合いやまぶしさを避けることができます。 </li></ol></li></ol></li><li> 細胞培養プロトコル： <ol><li> HBSSバッファー（100〜150ミリリットル）を、冷蔵置く100ミリメートルペトリ皿、鉗子、はさみ、50ミリリットルチューブ、およびフードでUV光の下で15 mlチューブ。 </li><li>培養室の外でフードの下、5％セボフルランの致死吸入で妊娠ラットを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノール、10トン胎盤を露出するようにハサミを使用して腹部cavity.Openの途中で尾から子宮をカットアップしながら、鉗子を使用して、下腹部の皮膚に滅菌します。 </li><li> 8-10 E18の胎児を削除します。プラHBSS溶液を含むペトリ皿中のCe 8-10胎児を。 </li><li>鉗子で胎児の頭の後ろを持ち、その後、身体から頭部を切断するはさみを使用しています。 HBSS 5-7ミリリットルで満たされた別のペトリ皿に入れてください。フードに皿を転送します。 </li><li>冷HBSSで2つの追加の100ミリメートルのペトリ皿を埋めます。 </li><li>ピールさておき頭蓋骨は、そしてHBSSで満たされた新しいペトリ皿に脳をスクープ。 </li><li>それに冷HBSSで新しいペトリ皿に脳を転送し、脳から鋭い湾曲鉗子、別々の小脳および脳幹を使用してください。 </li><li>湾曲した鉗子で半球を分離、確保するためにピンセットを使用してください。髄膜を削除します。マークされた15ミリリットルの遠心管に前頭皮質および転送の部分を分離します。 </li><li>新鮮な2ミリリットルHBSSで15ミリリットルチューブを記入し、各15ミリリットルチューブに20μlのトリプシンEDTA（0.5％トリプシンおよび5.3 mMのEDTAで10倍濃縮混合物を。）を追加します。 </li><li> RTで10〜15分間インキュベートします。ゆっくり、数分おきにチューブを旋回セトリングことはできません。 </li><li> Afター10-15分は、古いHBSSを削除し、新しいHBSSで二回リンスするためにガラスピペットを使用しています。 </li><li> （2ミリリットルHBSS中1mg / mlの、2mgのトリプシンインヒビター）トリプシン阻害剤に浸し、よく混ぜ、それは5分放置します。新鮮なHBSSで二回洗浄します。 </li><li>均質になるまで非常にゆっくりと減少し、先端径較正ピペット及び滅菌チップを用いて再度bubbles.Triturateを回避するように非常にゆっくりとゴム球、磨砕脳片で10~15回ガラスピペットを使用して。 </li><li>転送は、事前に準備コーティングした培養皿（50細胞/ mm2の）に所望の密度で細胞を解離しました。 37°Cの 、5％CO 2でO / Nインキュベートします。 </li><li> 24時間後に、新たに作られた完全増殖無血清Neurobasal培地を含むDMEM / F12培地を交換してください。 </li><li>実験前の少なくとも12から14日間、5％CO 2/95％室内空気の加湿インキュベーター中ですべての回で細胞を維持します。新鮮なNeurobasal培地は、古い培地の約50％を交換しておき5-6日細胞を補います。 </li></ol></li></ol> 2.蛍光標識および免疫細胞化学注：初代皮質細胞培養物の免疫蛍光標識を1 mlと作業容積を有するガラス底面35 mmの細胞培養皿で行いました。 <ol><li>リン酸緩衝生理食塩水のpHが7.4（PBS）で2回ガラスボトムディッシュを洗ってください。 </li><li> RTで15分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。 </li><li> PBSで細胞を2回洗浄し、5分間、PBS中の0.1％トリトンX-100で透過性。 </li><li> F-アクチン特異的な染色で、室温で20分間細胞を処理するため、のAlexaFluor 488ファロイジン（1時40分、1ミリリットルPBS中ファロイジン25μlの）。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄し、1〜2時間、室温で10％正常ヤギ血清でブロックします。 </li><li> 2％正常ヤギ血清を含むPBSで4 O℃でO / Nインキュベートする：ニワトリポリクローナル抗MAP2抗体（2,500 1）希釈</li><li>インキュベーション後、PBSで2回すすぎます。 </li><li>二次抗体（AlexaのRを希釈ED 594結合ヤギ抗ニワトリIgG抗体（1：500）2％正常ヤギ血清で、室温で2時間インキュベートします。 </li><li> PBSですすぎ、ヘキスト染料を10μl/皿を追加します。 </li><li>室温で3分間インキュベートし、PBSで二回洗浄します。 注：ステップ3（F-アクチン涙点カウント）のための標識された細胞は、準備が整いました。 </li><li>封入剤として退色防止試薬100μlの細胞サンプルを維持し、長期保存のため、暗所で4°Cのでおきます。 注：ファロイジンは退色防止封入試薬で保存することができる1週間と蛍光まで暗所で4℃でPBS中で比較的安定しています。ファロイジンを長期間にわたって保管して外に拡散を開始することができるので、最適な画像が染色後1-3日から取得されます。 </li></ol> 3. F-アクチン斑点カウント<ol><li>蛍光顕微鏡をオンにして、20倍の対物レンズに切り替えます。オープン顕微鏡ソフトウェア、および1280×960ピクセルの画像サイズでプログラムを設定し、0.11倍ズームで7ミクロン/ピクセル画像の解像度。 </li><li>赤、緑（495nmで）/（613 nm）の蛍光チャネルの下で共同標識F-アクチン/ MAP2ニューロンの画像を取得します。 </li><li> 5グリーン（F-アクチン）/レッド（MAP2）免疫標識/ブルー（ヘキスト）明確に定義された樹状アーバーと個々のニューロンの蛍光画像を選択してください。 </li><li>連続MAP2免疫蛍光と二次樹枝状のセグメント（長さの範囲25から75ミクロン）でF-アクチン豊富な構造を特定します。 </li><li>水平レベルに画像の選択した領域を回転させます。新しいイメージとしてコピーして貼り付けます。 </li><li>各皿のための一貫性の調整を使用して、画像の背景を引きます。 </li><li>明るい緑色のF-アクチン涙点を数え、訓練を受けた独立した観察者によって手動で選択された樹状セグメントの長さをトレースします。スプレッドシートファイルにデータをエクスポートします。 </li><li> MAP2の長さ（L）総F-アクチン標識された涙点（N）を割ることで密度を計算する樹状突起を標識しました。 F-交流の数などのデータを表現しますデンドライトの10ミクロンあたり錫涙点 注：涙点の樹状シャフト内染色の平均強度よりも少なくとも50％のピーク強度とF-アクチンの蛍光（サ ​​イズ≤1.5μm）をそれぞれ選択した樹状セグメントに含まれていました。 </li></ol>

<ol>
	<li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses.">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572 (2012).</li><li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters.">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li><li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation.">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li><li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines.">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li><li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities.">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li><li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin.">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li><li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat+protein+variants:+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury.">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure:+neurorestoration+by+phytoestrogens.">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li><li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration.">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li></ol>

None of the authors have conflicts of interest to declare.

このプロトコルでは、我々は、私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で培養ラット皮質ニューロンを記述する。次に、我々は、樹状変化を検出するファロイジンとMAP2染色を使用します。その後、我々はF-アクチン斑点の変化を定量化するために特別なソフトウェアを使用していました。 F-アクチン斑点の変化を決定するために、個々の神経細胞の全体の神経回路網が明確に表示されている必要があり、これは、単一ニューロンから適切な二次樹枝状のセグメントを選択することができます。低密度めっきは、個々のニューロンを可視化するための両方、ならびにグリア細胞の存在を最小限にするために重要です。アストロサイトはまた、F-アクチンを含み、ニューロンマーカーなしで、F-アクチン陽性の涙点の分析を混乱させる可能性があります。低密度培養物およびNeurobasal培地の使用は、細胞培養物中で星状細胞の増殖を減少させるのに有用です。しかし、Fアクチンのタンパク質であることを警告与えニューロンに特異的ではない、などMAP2などの特定の神経細胞のタンパク質マーカーは、ファロイジンと一緒に使用する必要があります。他のタンパク質の抗体は、培養物中の特定のニューロン集団の同定のためのそのようなTHとしてファロイジン（チロシンヒドロキシラーゼ）と組み合わせて使用​​することができます。 シナプスとシナプスの形態を研究するための一つの一般的な技術は、免疫細胞化学（ICC）です。 ICCは、次のような（シナプスタンパク質のための多くの抗体は、しかし、PSD 95、NMDAR（シナプス後）だけでなく、シナプトフィジン、ファゴットとシナプシンI（シナプス前）11を含む、容易に入手可能であるので、いくつかの構造は、ICCによって検出することができない人気です細い糸状仮足）が、抗体検出（または2つの異なる抗体を用いた二重標識とF-アクチンファロイジン標識の組み合わせ）は、シナプス亜集団と実験的治療への差動応答の特異的かつ複雑な調査を可能にすることができます。 F-アクチン斑点は気難しいかもしれ実験的治療にularly敏感。我々は最近、HIV-1 Tatタンパク質による治療が明白な神経細胞死（48時間）10のための証拠の前にF-アクチン斑点（24時間）の減少を生じたことを報告しました。これは、実験的な治療が増加（メマンチン）または減少（メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの）F-アクチン斑点のいずれかかもしれないことに注意すべきです。我々はまた、F-アクチン斑点損失が特定の実験処理10以下の可逆反応であることを見出しました。このように、F-アクチン涙点の定量化は、急性シナプス変性症だけでなく、シナプスの回復と実験神経修復のプロセスを研究するためだけでなく、を監視するための貴重なツールです。

この研究の主な目的は、ニューロンの樹状突起ネットワークのシナプス完全性の測定（推定）の信頼性の高い方法を開発することです。ここでは、ファロイジン染色および特殊な（NIS-要素）ソフトウェアを使用して、その後の分析と樹状突起の免疫細胞化学（ICC）の検出の組み合わせを用いて、ラット初代培養神経細胞におけるF-アクチン涙点の定量化について説明します。 標識ファロトキシンは、大小両方のフィラメント（F-アクチン）に対して同様の親和性を有するが、いくつかのアクチン抗体1とは異なり、単量体の球状アクチン（G-アクチン）に結合しません。ファロイジンの非特異的結合は、このように細胞イメージングの間に最小限の背景を提供し、ごくわずかです。ファロイジンは、典型的には、ファロイジンによるF-アクチンのはるかに強い標識化を可能にする蛍光顕微鏡用の細胞タンパク質を標識するために使用される抗体よりもはるかに小さいです。このように、神経細胞におけるF-アクチンの局在の詳細な画像をすることができます標識されたファロイジンを使用することによって得られます。 神経細胞の樹状突起のファロイジン（F-アクチン）染色は、成熟した棘、非とげシナプス2と未熟棘を含む樹枝状構造の多様性を表す離散的「ホットスポット」や明るい「斑点」を生成します。未熟棘薄い糸状仮足及びパッチの形態のいくつかの形態を含み、そしてspinogenesis 3の開始を表すことができます。未熟棘と非とげ状のパッチがPSD95 4を欠いています 。のみならず、棘におけるその後の変化だけでなく、追加の樹枝状構造へのF-アクチンの鉛の生産の変化は、このようにsynaptodendritic整合性5-7を調査するための重要なツールファロイジンを作ります。一般的には、ファロイジン陽性（F-アクチン）涙点の数は、アクティブなシナプス（興奮性および抑制）、アクチンダイナミクスとシナプスの安定性8のバランスを反映しています。 特定のトンを研究することは重要であるが、シナプスのYPES（ すなわち 、興奮棘）、治療の標的が未知であるとき、最初の樹枝状構造体の種々の一般的な整合性を推定する必要があります。 F-アクチンは、抑制性シナプスを含む樹状突起棘および他の構造の主要な構成要素であるので、F-アクチン涙点の変更された数は、シナプス変性症を示すことができます。このシナプス変性症は、より具体的な変化についてさらに調査することができます。複数のシナプスのタイプ/構造を検出するための当社の定量方法は、様々な実験処置後の樹状シナプスの変化（増減）の全体​​的な推定値が得られます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass</td>
			<td style="width:155px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:121px;">P35G-1.5-20-C</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">10565-018</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:211px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">15400-054</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P9155</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:211px;">Boric acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B0252</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:211px;">Borax</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B9876</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">35050-061</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">101174Y</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:211px;">HBSS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H4641</td>
			<td style="width:139px;">10X</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">21103-049</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">17504-044</td>
			<td style="width:139px;">50X</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td style="width:155px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">30004CI</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">25080</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Vannas Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500086</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500216</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Iris Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">15914</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:211px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14097</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14095</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:211px;">ProLong Gold</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">P36930</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P6148</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">Cover glass</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">631-0137</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">AlexaFluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A12379</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">26050-070</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">Chicken polyclonal anti-MAP2</td>
			<td style="width:155px;">abcam</td>
			<td style="width:121px;">Ab92434</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A11042</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">R37605</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:211px;">NIS-Elements software package</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:211px;">Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:211px;">0.2 &#956;m Nalgene nylon membrane filter</td>
			<td style="width:155px;">Fishersci</td>
			<td style="width:121px;">151-4020</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of filamentous actin (f-actin) puncta in rat cortical neurons

（F-アクチン）繊維状アクチンタンパク質はspinogenesis、シナプス可塑性、およびシナプスの安定性に大きな役割を果たしています。樹状F-アクチン豊富な構造の変化は、シナプスの完全性と接続性の変化を示唆しています。ここでは、初代ラット皮質ニューロン、F-アクチン斑点のためのファロイジン染色、およびその後の定量化手法を培養するための詳細なプロトコルを提供します。まず、E18ラット胚の前頭皮質は、その後、低密度の細胞培養物中に少なくとも12〜14日間、in vitroで増殖させた神経細胞を解離します。実験的治療に続いて、皮質ニューロンがのAlexaFluor 488ファロイジンで染色され、微小管結合タンパク質2（樹状F-アクチン斑点標識する）（MAP2を、神経細胞や樹状突起の整合性を検証するために）。最後に、特別なソフトウェアがランダムに選択された神経細胞の樹状突起を分析し、定量化するために使用されます。 F-アクチン豊富な構造は、二次樹枝状の枝に識別されます（長さの範囲25-75＆＃181; m）を連続MAP2免疫蛍光を持ちます。ここで紹介するプロトコルは、実験処理に続いて、樹状シナプス構造の変化を調査するための有用な方法となります。

私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で存在する方法で、私たち第1の培養ラット皮質ニューロン、。 図1では 、微分干渉コントラスト（DIC）画像は、日4、6、10、14、21、in vitroで 27に胎児ラット皮質ニューロンの開発における形態学的変化を示しています。樹状突起の長さと数は、培養ラット初代神経細胞の成熟に伴って増加することに注意してください。ニューロンはわずか14日間熟成した後、実験に使用されています。 樹状突起とシナプスの変化を検出するために、我々は樹状突起のMAP2抗体検出とファロイジンFアクチンの標識を兼ね備えています。 F-アクチンのファロイジン標識は（20-30分）非常に急速であるので、視覚的にICCの抗体標識（ 図2に進む前にsynaptodendriticネットワークの整合性を推定するために、それは可能です</stronグラム&gt;）。 MAP2は、無傷の樹状突起を示し、ファロイジン染色の上に重なります。これは、F-アクチン斑点がニューロンの樹状突起上に位置しており、そのようなアストロサイトなどの他の細胞にローカライズされていません確認することができます。 次に、共標識ファロイジン（F-アクチン）/ MAP2、ニューロンの高解像度画像を取得し、ランダムに選択された神経細胞を分析しました。ファイン糸状仮足、背骨の突起、およびF-アクチンパッチは、F-アクチン豊富な構造と考えられていたと私たちの研究（ 図3）に含まれていました。二次デンドライト（MAP2陽性）のセグメントは、Fアクチン涙点密度の分析のために選択しました。 MAP2陽性染色は、F-アクチン涙点のニューロンの局在を確認するために使用されます。コンピュータ支援検出及びファロイジン（F-アクチン）の標識（緑色蛍光チャネル）の計数は、シナプス点は、特殊なソフトウェアの使用を介して行われました。 図4のステップの詳細なプロトコルでステップがあります</stroNG&gt;ソフトウェアパッケージの使用を記載します。私たちは、コンピュータ支援F-アクチンカウントがF-アクチンのマニュアルカウントとし、2訓練を受けた観察者間のF-アクチン斑点数の観察者間の相関が（R 2 = 0.97）が非常に高いことを非常によく相関することを報告しています。 以前、我々は、HIV-1 Tatの9およびHIV-1 Tatの誘発性シナプス変性症10からの回復により誘発されるsynaptodendritic損傷を評価するために、F-アクチン涙点の定量化を使用していました。 図5において、ラットの皮質ニューロンは、HIV-1 Tatの処置の50 nMの後ファロイジンおよびMAP2抗体で同時標識しました。 MAP2染色は少ない樹枝状の枝を明らかにし、HIV-1のTat-治療後のF-アクチンを減少しました。 我々は、Fアクチン斑点が実験処理に応答して増加または減少し得ることを見出しました。 図6に 、培養されたニューロンは、目で処理しました電子非競合NMDA受容体アンタゴニストのメマンチンは、有意Fアクチン陽性の涙点を増加させます。対照的に、メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの組み合わせを用いた治療は、F-アクチン涙点の重大な損失をもたらしました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig1.jpg" /> 図細胞培養1.胎児ラット皮質ニューロン 4の間に胎児ラット皮質ニューロンの微分干渉コントラスト（DIC）画像- 。、in vitroで 27日（20X）。ニューロンは、in vitroで 14日目に成熟表示されます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig2.jpg" /> 図2.ラット皮質ニューロンにおけるファロイジン/ MAP2同時標識。MAPで標識された培養神経細胞2抗体（赤）とファロイジン（緑）。マージされた画像は。ファロイジン染色は、ニューロンの樹状突起（20X）に局在していることを決意を許可する<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig3.jpg" /> 図ラット皮質ニューロンの3 F-アクチンシナプス構造。 （A）左 -ファロイジンで標識F-アクチン陽性の構造（60X）。矢頭は、F-アクチン標識された構造は、マッシュルーム棘（紫）、パッチ状の形態（青）と長い糸状仮足（オレンジ色）が含ま示します。中東 - これらのF-アクチンの構造を実証するマージされた画像は、樹状突起（20X）に局在しています。右-右下のボックスには、分析（20X）のために選択された二次樹枝状の枝を示している（B）ファロイジン（F-アクチン）（緑）/ MAP2の樹状セグメント。<html> （赤）の共同標識皮質ニューロン（20X）F-アクチン斑点のニューロンの起源を確認するために使用されています。緑の画像のみ（ファロイジン/ F-アクチン）がさらに処 ​​理される。（C）ファロイジン/ F-アクチン（緑）涙点計数のために選択した3つの樹状突起セグメントの画像。密度は、N / Lを割ることにより決定されます。 N =斑点、L =樹状セグメントの長さの数。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig4.jpg" /> ソフトウェア・パッケージの図4.デモ：ステップバイステップのインストラクション <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53697fig5.jpg &quot;/&gt; 図5. HIV-1 Tatのは、ラット皮質ニューロンでsynaptodendritic傷害を媒介した。細胞培養は、HIV-1 Tatタンパク質の治療（50nMの）後のF-アクチンとMAP2のための共染色しました。アッパーは、堅牢なF-アクチン、複雑な分岐パターン、および大規模な細かい神経突起を示す未処理のニューロンをpanels-。下パネル - F-アクチンの減少と減少した樹状分枝を有するHIV-1 Tatタンパク質処理したニューロン。 （20X）は、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig6.jpg" /> ラット皮質ニューロンにおける図6. F-アクチン斑点：メタンフェタミン+タット処理対メマンチンによって生成されるさまざまなエフェクト Methamphで処理された未処理の培養神経細胞、メマンチンで処理したニューロン（10μM）、およびニューロンの画像（20X）エタミン（20μM）のTatの10 nMの（10nMの）。メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの処理はFアクチン染色を減少させ、樹枝状分岐の減少に対し、メマンチン処理は、Fアクチン染色を増加させました。メマンチン処理は、未処置対照培養物と比較しF-アクチン涙点密度を増加しました。これとは対照的に、メタンフェタミン+ HIV-1 Tatの治療は大幅に未処理の対照培養物と比較しF-アクチン斑点の密度を、減少しました。 + SEM、* P &lt;0.05を意味する。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

11.9K ビュー.  University of South Carolina. Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

ビデオ: Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

神経科学

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

透過処理神経成長円錐におけるローダミン-アクチンとF -アクチンばら両端にラベルを付ける

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...