This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali presso la University of South Carolina (numero garanzia: A3049-01). 1. a bassa densità neuronale embrionale Cultura <ol><li> La preparazione per la cultura neuroni corticali primarie <ol><li> soluzioni: <ol><li> Preparare soluzione stock Poly-L-lisina sciogliendo 5 mg di poli-L-lisina in 10 ml di tampone borato. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro diluendo 1 ml Poly-L-lisina Archivio in 49 ml tampone borato. </li><li> Preparare borato Buffer, pH 8.4 partendo da 395 ml di dH 2 O e quindi l&#39;aggiunta di tutti gli ingredienti (1,24 g di acido borico + 1,9 g di borace). Regolare il pH a 8,4 con 1 M NaOH. Regolare a 400 ml e filtrare con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li><li> Preparare la soluzione HBSS, pH 7,2 iniziando con 445 ml di dH 2 O e l&#39;aggiunta di tutti gli altri ingredienti (50 ml 10X HBSS archivio + 1,2 g HEPES). Regolare il pH a 7,2 con 1 N HCl, bring a 500 ml e filtrare con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li><li> Preparare mezzo di placcatura: DMEM / F12 con il 10% di siero fetale bovino. Filtro con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li><li> Preparare terreno di coltura completo: a 50 ml di mezzo Neurobasal, aggiungere i supplementi (500 microlitri Glutamax (100X) + 500 ml di glucosio + 1 ml di B-27 (50X) + 500 ml di soluzione di antibiotici contro funghi (100X) + 100 ml 7,5% Bicarbonato di sodio. filtro con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano. </li></ol></li><li> Due giorni prima della cultura: <ol><li> Coat dodici 35 mm piatti con fondo di vetro con 2 ml di soluzione di lavoro Poli-L-lisina, e tenere sotto il cofano O / N. </li></ol></li><li> Un giorno prima della cultura: <ol><li> Vuoto agente di rivestimento dai piatti e risciacquare con DDH 2 O. Lasciare asciugare i piatti per un&#39;ora sotto il cofano. </li><li> Preparare mezzo di placcatura (DMEM / F12 con siero fetale bovino 10% (10% di soluzione totale). Pipettare 2 ml di mezzo inogni piatto, e incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO 2. Nota: È importante evitare piatti di plastica coltura durante la coltura. L&#39;utilizzo di piatti con fondo di vetro (per microscopi invertiti) o vetrini (per microscopi verticali) produce immagini chiare e nitide. Rispetto ad un piatto di plastica-basso, il piatto fondo di vetro consente di evitare riflessi indesiderati o abbagliamento durante la microscopia a fluorescenza. </li></ol></li></ol></li><li> Protocollo Colture cellulari: <ol><li> Messo in frigorifero HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm di Petri piatti, pinze, forbici, provette da 50 ml e 15 ml tubi sotto la luce UV a cappuccio. </li><li> Euthanize ratto in gravidanza con l&#39;inalazione letale di 5% sevoflurano sotto il cofano al di fuori della stanza della cultura. </li><li> Sterilizzare con il 70% EtOH, tenda la pelle del basso addome con pinze durante il taglio della coda fino a metà del addominale cavity.Open l&#39;utero con le forbici per esporre la placenta. </li><li> Rimuovere 8-10 feti E18. PlaCe 8-10 feti in capsule di Petri contenenti soluzione HBSS. </li><li> Tenere la parte posteriore della testa del feto con una pinza, quindi utilizzare le forbici per tagliare la testa dal corpo. Mettere in un altro capsula di Petri riempite con 5-7 ml di HBSS. Trasferimento piatto a cappuccio. </li><li> Riempire due ulteriori capsula di Petri 100 mm con HBSS freddo. </li><li> Peel parte del cranio, il cervello e scoop in una nuova capsula di Petri riempite con HBSS. </li><li> Utilizzare pinze curve taglienti, cervelletto e tronco cerebrale separata dal cervello, poi il trasferimento cervello a una nuova capsula di Petri con HBSS freddo in esso. </li><li> Utilizzare le pinzette per fissare, separare gli emisferi con una pinza curve. Rimuovere meningi; isolare corteccia frontale e pezzi di trasferimento in provette da 15 ml centrifuga segnati. </li><li> Riempire il tubo da 15 ml con il fresco 2 ml HBSS e aggiungere 20 microlitri tripsina EDTA (10x miscela concentrata con 0,5% tripsina e EDTA 5,3 mm.) Ad ogni provetta 15 ml. </li><li> Incubare 10-15 minuti a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente tubo ogni pochi minuti, non consentono di stabilirsi. </li><li> After 10-15 minuti, l&#39;uso pipetta di vetro per rimuovere vecchia HBSS e lavare due volte con HBSS nuova. </li><li> Immergere in inibitore della tripsina (1 mg / ml, 2 mg di inibitore della tripsina in 2 ml HBSS), mescolare bene e lasciate riposare 5 minuti. Lavare due volte con HBSS fresco. </li><li> Uso pipetta di vetro con bulbo di gomma, pezzi cerebrali Triturare 10-15 volte molto lentamente in modo da evitare bubbles.Triturate nuovamente utilizzando una pipetta calibrata e una punta sterile con una punta di diametro ridotto molto lentamente fino ad omogeneità. </li><li> Trasferimento dissociato cellule a densità desiderata di pre-preparati piatti della cultura rivestiti (50 cellule / mm2). Incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO2. </li><li> Dopo 24 ore, sostituire medio DMEM / F12 con il mezzo privo di siero Neurobasal completa crescita appena fatto. </li><li> Mantenere le cellule in ogni momento in un CO 2/95% incubatore umidificato aria ambiente 5% per almeno 12-14 giorni prima della sperimentazione. Supplemento cellule ogni 5-6 giorni con terreno fresco Neurobasal sostituzione circa il 50% del vecchio mezzo. </li></ol></li></ol> 2. fluorescenti etichettatura e Immunocitochimica Nota: L&#39;etichettatura immunofluorescenza di colture cellulari primarie corticali stata effettuata in vetro piatti di coltura cellulare fondo 35 mm con un volume di lavoro di 1 ml. <ol><li> Lavare il piatto fondo di vetro due volte con tampone fosfato salina pH 7.4 (PBS). </li><li> Fissare cellule con 4% paraformaldeide per 15 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS e permeabilize con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min. </li><li> Trattare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente con una macchia specifica F-actina, AlexaFluor 488 falloidina (1:40, 25 ml di falloidina in 1 ml di PBS). </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS e bloccare con il 10% di siero normale di capra a temperatura ambiente per 1-2 ore. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo pollo policlonale anti-MAP2 (1: 2.500) in PBS con il 2% di siero normale di capra e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare in PBS due volte. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario (Alexa REd 594 coniugato capra anti-IgG di pollo (1: 500) con il 2% di siero normale di capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare con PBS e aggiungere 10 ml / piatto di colorante Hoescht. </li><li> Incubare 3 minuti a temperatura ambiente e lavare con PBS due volte. Nota: Le cellule marcate ora pronto per il passaggio 3 (F-actina conteggio puncta). </li><li> Conserva campione di cellule con 100 ml di antifade reattivo come agente coprioggetto e mantenerlo a 4 ° C al buio per la conservazione a lungo termine. Nota: falloidina è relativamente stabile in PBS a 4 ° C al buio fino a 1 settimana e la fluorescenza può essere conservato con antifade reagenti copertura dei vetrini. Tuttavia, per ottenere immagini ottimali da 1-3 giorni dopo la colorazione da falloidina può iniziare a diffondere con stoccaggio prolungato. </li></ol> 3. F-actina Puncta conteggio <ol><li> Accendere microscopio a fluorescenza e passare a 20 × obiettivo. Aprire il software microscopio, e impostare il programma a 1280 × 960 pixel di dimensioni dell&#39;immagine, e 0,1risoluzione dell&#39;immagine / pixel 7 micron a 1 ×. </li><li> Acquisire le immagini di co-marcato F-actina / neuroni MAP2 in verde (495 nm) / rosso (613 nm) canali fluorescenti. </li><li> Scegli 5 Green (F-actina) / Red (MAP2) immunolabeled / blu (Hoescht) immagini fluorescenti di singolo neurone con pergole dendritiche chiaramente definiti. </li><li> Identificare i F-actina strutture ricche di secondo ordine segmento dendritiche (intervallo di lunghezza 25-75 micron), con continui immunofluorescenza MAP2. </li><li> Ruotare la regione selezionata di immagini a un livello orizzontale. Copia e incolla come nuova immagine. </li><li> Sottrarre il fondo delle immagini, utilizzando un aggiustamenti coerenti per ogni piatto. </li><li> Contare il brillante puncta F-actina verde e tracciare la lunghezza del segmento dendritiche selezionato manualmente da osservatori indipendenti addestrati. Esportare i dati in un file foglio di calcolo. </li><li> Calcolare la densità dividendo totale F-actina puncta marcato (N) per la lunghezza (L) della MAP2 etichettato dendriti. i dati espressi come numero di F-acpuncta latta per 10 micron di dendriti Nota: Puncta (dimensioni ≤1.5 micron) della fluorescenza F-actina con una intensità di picco di almeno 50% rispetto all&#39;intensità media della colorazione nel pozzo dendritica sono stati inclusi in ciascun segmento dendritica selezionato. </li></ol>

<ol>
	<li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses.">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572 (2012).</li><li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters.">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li><li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation.">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li><li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines.">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li><li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities.">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li><li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin.">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li><li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat+protein+variants:+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury.">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure:+neurorestoration+by+phytoestrogens.">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li><li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration.">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li></ol>

None of the authors have conflicts of interest to declare.

In questo protocollo, si descrive la coltura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare dendriti dei singoli neuroni. Avanti, usiamo falloidina e MAP2 colorazione per rilevare i cambiamenti dendritiche. Poi, abbiamo utilizzato un software specializzato per quantificare i cambiamenti in puncta F-actina. Per determinare le variazioni di puncta F-actina tutta la rete neuronale di un singolo neurone deve essere chiaramente visibile, permette la selezione di opportuni segmenti dendritiche del secondo ordine da un singolo neurone. placcatura a bassa densità è critica per entrambi visualizzarne singoli neuroni così da ridurre al minimo la presenza di cellule gliali. Gli astrociti contengono anche F-actina e senza un marcatore neuronale, potrebbe confondere l&#39;analisi di puncta positivo F-actina. culture bassa densità e l&#39;uso del mezzo Neurobasal sono utili nel ridurre la proliferazione astrocitari nelle colture cellulari. Tuttavia, dato l&#39;avvertenza che la proteina F-actina ènon specifiche per i neuroni, marcatori proteici neuronali specifici, come MAP2, dovrebbe essere usato insieme con falloidina. Altri anticorpi proteine ​​possono essere utilizzati anche in combinazione con falloidina, come TH (tirosina idrossilasi) per l&#39;identificazione di specifiche popolazioni neuronali in coltura. Una tecnica generale per studiare le sinapsi e la morfologia sinaptica è immunocitochimica (ICC). ICC è popolare poiché molti anticorpi per le proteine ​​sinaptiche sono prontamente disponibili compreso PSD 95, NMDAR (post-sinaptica) nonché synaptophysin, fagotto e sinapsina I (pre-sinaptica) 11. Tuttavia, alcune strutture non può essere rilevato da ICC (ad esempio sottile filopodi), ma una combinazione di etichettatura falloidina F-actina con rilevamento di anticorpi (o doppia marcatura con due anticorpi differenti) possono consentire un&#39;indagine specifica e complessa di sottopopolazioni sinaptiche e le risposte differenziali ai trattamenti sperimentali. puncta F-actina può essere particlare sensibili ai trattamenti sperimentali. Abbiamo recentemente riportato che il trattamento con HIV-1 proteina Tat ha prodotto una diminuzione della puncta F-actina (24 ore) prima di qualsiasi prova di morte neuronale palese (48 ore) 10. E &#39;da notare che i trattamenti sperimentali possono sia aumentare (memantina) o diminuire (metanfetamina + HIV-1 Tat) F-actina puncta. Abbiamo anche trovato che la perdita puncta F-actina è una risposta reversibili dopo specifici trattamenti sperimentali 10. Come tale, F-actina puncta quantificazione è uno strumento prezioso per monitorare non solo synaptopathy acuta, ma anche per lo studio di recupero sinaptica e processi neurorestoration sperimentali.

L&#39;obiettivo primario di questo studio è quello di sviluppare un metodo affidabile di misura (stima) di integrità sinaptica della rete dendritica neuronale. Qui si descrive la quantificazione di puncta F-actina in primari di ratto neuroni in coltura utilizzando una combinazione di falloidina colorazione e rilevamento immunocitochimica (ICC) di dendriti con successiva analisi utilizzando software specializzati (NIS-Elements). Phallotoxins etichettati hanno un&#39;affinità simile per grandi e piccoli filamenti (F-actina), ma non si legano al monomero globulare actina (G-actina), a differenza di alcuni anticorpi actina 1. Legame non specifico di falloidina è trascurabile, fornendo in tal modo sfondo minima durante l&#39;imaging cellulare. Falloidina è molto più piccolo di anticorpi che viene in genere utilizzato per etichettare proteine ​​cellulari per microscopia a fluorescenza, che consente molto più intenso etichettatura di F-actina by falloidina. Così, immagini dettagliate di localizzazione F-actina nei neuroni possono essereottenuto attraverso l&#39;uso di etichetta falloidina. Falloidina (F-actina) colorazione dei dendriti neuronali genera discreti &quot;punti caldi&quot; o &quot;puncta&quot; luminosa, che rappresentano una varietà di strutture dendritiche, tra cui spine mature, le sinapsi non spinosi 2 e spine immature. Spine immature includono filopodi sottili e alcune forme di patch di morfologia, e possono rappresentare l&#39;avvio di spinogenesis 3. Spine immature e patch non spinosi mancano PSD95 4. Cambiamenti nella produzione di piombo F-actina alle successive variazioni non solo spine ma anche strutture dendritiche aggiuntivi, rendendo così falloidina uno strumento importante per indagare l&#39;integrità synaptodendritic 5-7. In generale, il numero di falloidina-positivi (F-actina) puncta riflettono un equilibrio tra le sinapsi attive (eccitatori e inibitori), le dinamiche di actina e la stabilità sinapsi 8. Anche se è importante studiare specifica tipi di sinapsi (cioè, spine eccitatorie), quando la destinazione di un trattamento non è nota, è necessario stimare prima l&#39;integrità generale di una varietà di strutture dendritiche. Dal momento che F-actina è una componente importante di spine dendritiche e altre strutture, tra cui sinapsi inibitorie, un numero alterato di puncta F-actina può indicare una synaptopathy. Questo synaptopathy può quindi essere studiata ulteriormente per le modifiche più specifiche. Il nostro metodo di quantificazione per il rilevamento di più sinaptici tipi / strutture produce una stima complessiva del dendritiche alterazioni sinaptiche (aumenti e le diminuzioni) a seguito di vari trattamenti sperimentali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass</td>
			<td style="width:155px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:121px;">P35G-1.5-20-C</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">10565-018</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:211px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">15400-054</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P9155</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:211px;">Boric acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B0252</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:211px;">Borax</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B9876</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">35050-061</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">101174Y</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:211px;">HBSS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H4641</td>
			<td style="width:139px;">10X</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">21103-049</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:211px;">B-27 supplement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">17504-044</td>
			<td style="width:139px;">50X</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td style="width:155px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">30004CI</td>
			<td style="width:139px;">100X</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">25080</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Vannas Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500086</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">500216</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Iris Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">15914</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:211px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14097</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:155px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:121px;">14095</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:211px;">ProLong Gold</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">P36930</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:211px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P6148</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:211px;">Cover glass</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">631-0137</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:211px;">AlexaFluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A12379</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">26050-070</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">Chicken polyclonal anti-MAP2</td>
			<td style="width:155px;">abcam</td>
			<td style="width:121px;">Ab92434</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">A11042</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:211px;">NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">R37605</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:211px;">NIS-Elements software package</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:211px;">Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:211px;">0.2 &#956;m Nalgene nylon membrane filter</td>
			<td style="width:155px;">Fishersci</td>
			<td style="width:121px;">151-4020</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of filamentous actin (f-actin) puncta in rat cortical neurons

Filamentosa proteine ​​actina (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesis, plasticità sinaptica, e la stabilità sinaptica. Cambiamenti nelle strutture ricche dendritiche F-actina suggeriscono alterazioni nella integrità sinaptica e la connettività. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di ratto primario neuroni corticali, Colorazione falloidina per puncta F-actina, e successive tecniche di quantificazione. Innanzitutto, la corteccia frontale di embrioni di ratto E18 sono dissociato in coltura cellulare a bassa densità, allora i neuroni coltivati ​​in vitro per almeno 12-14 giorni. Dopo il trattamento sperimentale, i neuroni corticali sono macchiati con AlexaFluor 488 falloidina (per etichettare il puncta F-actina dendritiche) e map2 (MAP2, per convalidare le cellule neuronali e l&#39;integrità dendritiche). Infine, il software specializzato è utilizzato per analizzare e quantificare dendriti neuronali selezionati in modo casuale. F-actina strutture ricche sono identificati sul secondo ordine rami dendritiche (range 25-75 lunghezza &amp;# 181; m) con continui immunofluorescenza MAP2. Il protocollo presentato qui sarà un metodo utile per studiare i cambiamenti nelle strutture sinapsi dendritiche successivi trattamenti sperimentali.

Nelle attuali metodi, in primo luogo abbiamo la cultura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare i dendriti dei singoli neuroni. Nella figura 1, il contrasto di interferenza differenziale (DIC) immagini mostrano le variazioni morfologiche nello sviluppo fetale di ratto neuroni corticali nei giorni 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Si noti che la lunghezza e il numero di dendriti aumentano con la maturazione dei neuroni di ratto primari in coltura. I neuroni sono utilizzati in esperimenti solo dopo 14 giorni di maturazione. Per rilevare i cambiamenti dendritiche e sinaptici, uniamo l&#39;etichettatura falloidina F-actina con la rilevazione di anticorpi MAP2 dei dendriti. Poiché etichettatura falloidina di F-actina è molto rapida (20-30 min), è possibile stimare visivamente l&#39;integrità della rete synaptodendritic prima di procedere con etichettatura anticorpi ICC (Figura 2 </strong&gt;). MAP2 indica i dendriti intatte e sovrappone la colorazione falloidina. Questo permette la conferma che il puncta F-actina sono situate dendriti neuronali e non localizzato ad altre cellule, come astrociti. Successivamente, abbiamo acquisire immagini ad alta risoluzione di co-marcato falloidina (F-actina) / MAP2 neuroni e analizzato i neuroni selezionati in modo casuale. Bene filopodi, sporgenze della colonna vertebrale, e le patch F-actina sono stati considerati strutture ricche F-actina e sono stati inclusi nei nostri studi (Figura 3). Segmenti del secondo ordine dendriti (MAP2 positivi) sono stati selezionati per l&#39;analisi di densità puncta F-actina. MAP2 colorazione positiva viene utilizzato per confermare la localizzazione neuronale del puncta F-actina. il rilevamento e il conteggio di falloidina (F-actina) marcato (canale fluorescenza verde) assistita da computer puncta sinaptica è stata effettuata attraverso l&#39;utilizzo di software specializzati. C&#39;è un passo per passo dettagliato protocollo in figura 4 </strong&gt; descrive l&#39;uso del pacchetto software. Abbiamo riportato che il conteggio F-actina assistita da computer correla molto bene con conteggio manuale di F-actina e che la correlazione inter-osservatore conteggi puncta F-actina tra due osservatori qualificati è molto elevata (r 2 = 0,97). In precedenza, abbiamo utilizzato la quantificazione di puncta F-actina per valutare lesioni synaptodendritic indotta da HIV-1 Tat 9 e il recupero da synaptopathy HIV-1 Tat-indotta 10. Nella Figura 5, neuroni corticali di ratto sono stati co-etichettati con falloidina e MAP2 anticorpi dopo 50 Nm di trattamento per l&#39;HIV-1 Tat. MAP2 colorazione rivelato un minor numero di rami dendritici e diminuita F-actina seguente HIV-1 Tat-trattamento. Abbiamo scoperto che puncta F-actina può aumentare o diminuire in risposta a trattamenti sperimentali. Nella Figura 6, neuroni in coltura sono stati trattati con the non competitiva NMDA antagonista del recettore memantina, aumentando in modo significativo puncta positivo F-actina. Al contrario, il trattamento con una combinazione di metamfetamina + HIV-1 Tat ha comportato una significativa perdita di puncta F-actina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig1.jpg" /> Figura 1. fetali neuroni corticali di ratto in coltura cellulare contrasto interferenziale (DIC) immagini differenziali di ratto fetale i neuroni corticali tra 4 -. 27 giorni in vitro (20x). I neuroni sembrano maturi a 14 giorni in vitro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig2.jpg" /> Figura 2. falloidina / MAP2 co-etichettatura nei neuroni corticali di ratto. Neuroni coltivati ​​etichettati con MAP2 anticorpi (rosso) e falloidina (verde). Fusione di immagini consentono la determinazione che la colorazione falloidina è localizzato a dendriti neuronali (20x). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig3.jpg" /> Figura 3. F-actina strutture sinaptiche dei neuroni corticali di ratto. (A) sinistra - strutture positivi F-actina etichettati con falloidina (60X). Le frecce indicano le strutture etichettati F-actina includono spine a fungo (viola), patch-come morfologia (blu) e lungo filopodi (arancione). Medio - immagine fusa che dimostrano queste strutture F-actina sono localizzate a dendriti (20x). Destra - Box in basso a destra indica il ramo dendritiche secondo ordine selezionato per l&#39;analisi (20X) (B) segmenti dendritiche di falloidina (F-actina) (verde) / MAP2.<html> (Red) co-marcato i neuroni corticali (20x) vengono utilizzati per verificare l&#39;origine neuronale di puncta F-actina. L&#39;unica immagine verde (falloidina / F-actina) viene ulteriormente elaborato. (C) falloidina / F-actina (verde) le immagini di tre segmenti dendritiche selezionati per il conteggio puncta. Densità è determinato dividendo N / L. N = numero di puncta, L = lunghezza del segmento dendritiche. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig4.jpg" /> Figura 4. Dimostrazione di pacchetto software:. Istruzioni passo per passo <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /53697fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. HIV-1 Tat mediato lesioni synaptodendritic nei neuroni corticali di ratto. Le colture cellulari sono stati co-colorate per F-actina e MAP2 dopo il trattamento della proteina Tat di HIV-1 (50 Nm). Superiore panels- neuroni non trattati mostrano robusto F-actina, modelli di ramificazione complessi e vasti processi neuronali sottili. pannelli inferiori - i neuroni trattati proteina Tat di HIV-1 con ridotta F-actina e diminuzione ramificazioni dendritiche. (20X) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig6.jpg" /> Figura 6. puncta F-actina nei neuroni corticali di ratto:. Effetti diversi prodotti da Memantina rispetto al trattamento metamfetamina + Tat Immagini (20x) di neuroni in coltura non trattati, i neuroni trattati con Memantina (10 micron), e neuroni trattati con MethamphEtamine (20 micron) +10 nM di Tat (10nM). trattamento con memantina ha aumentato la colorazione F-actina, mentre il trattamento metamfetamina + HIV-1 Tat diminuita colorazione F-actina e diminuita ramificazioni dendritiche. trattamento con memantina ha aumentato significativamente la densità puncta F-actina, rispetto a colture di controllo non trattati. Al contrario, i trattamenti metamfetamina + HIV-1 Tat è diminuito in modo significativo la densità puncta F-actina, rispetto a colture di controllo non trattati. Media + SEM, * p &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53697/53697fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

12.0K Views.  University of South Carolina. Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Video: Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Ricerca

Neuroscienze

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

L&#39;etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Determinazione della mitocondriale Oxygen Species potenziale di membrana e reattiva in neuroni corticali di ratto dal vivo

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...