この作品は、神経疾患および脳卒中（NIH / NINDS）MGCにR01-NS074387、R01-NS057711とR21-NS091555を付与する/国立研究所国立衛生研究所によってサポートされていました。 NIH / NINDSはPRLにR01-NS061107、R01-NS076991、R01-NS082311とR21-NS084275を付与。リアのハッピーハート、ミシガン大学総合がんセンターからの助成金は、MGCとPRLに授与。脳神経外科、医学のミシガン学校の大学の学部; NIH助成2UL1-TR000433でサポートされている臨床的および保健研究、ミシガン研究所。 NIH / NCI（国立癌研究所）助成金T32-CA009676に​​よってサポートされているミシガン大学のがん生物学のトレーニンググラント。臨床およびNIH / NINDSグラントT32-NS007222によってサポートされる基本的な神経科学におけるミシガントレーニングの大学。およびNIH / NIGMS（一般医科学研究所）でサポートされているミシガン医学者研修プログラムの大学は、T32-GM007863を付与します。作者博士はカリンMuraszkoと脳神経外科から受信した学術的リーダーシップと支援に感謝再び。 M.ダールグレン、D. Tomford、と優れた行政支援のためのS.ナポリへ。優れた技術支援のためのM. Dzamanへ。そして、ツァイス3D走査型電子顕微鏡の購入に向けての暖かい支援に感謝フィルF.ジェンキンスへ。また、脳単核細胞の単離のための密度遠心メディア媒介戦略の修正版が描かれたハーバード・メディカル・スクールのKuchrooの研究室を認めます。

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著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、初期のマウスの脳の腫瘍微小環境を浸透させてきたPBMCの単離およびフローサイトメトリー分析のための堅牢で再現性のある方法について説明します。神経膠腫細胞懸濁液を定位マウス脳の線条体に移植された実験者によって指定された濃度で生成されます。次いで、マウスを実験的設計によって指定された所定の時点で安楽死させ、それらの脳を採取し、蛍光標識一次抗体の組み合わせで免疫標識された神経膠腫浸潤性のPBMCを単離するために処理されます。免疫標識細胞は、フローサイトメトリーによって定量化されます。ここで紹介するデモは、初期の時点に焦点を当てているが、神経膠腫浸潤PBMCをマウスの瀕死までの任意の時点後の腫瘍生着までで評価することができます。異なる抗体の組み合わせの任意の数の関心iの免疫細胞を検査するために使用することができるような方法は、高度にモジュール化されT細胞、B細胞、NK細胞、単球、およびマクロファージncluding。プロトコルはメスC57BL / 6Jマウス生後8〜10週での使用に最適化されていることに注意してください。この年齢範囲外のマウスは、ここに提示されたデータの代表ではないと同等の時点で細胞数につながる可能性がある、循環PBMCの割合が変化していてもよいです。特徴付け実験は、代替の腫瘍モデルを使用する場合にも必要とされ得るか、B6バックグラウンド上以外のマウスを伴う株は、それらのPBMCプロフィール（Jaxpheno6;マウスPhenomeデータベース;ジャクソンラボラトリー）で異なり得ることに使用されている場合。ジェンダーと環境条件はまた、PBMCの頻度およびパーセントの間で格差のソースすることができます。 この方法は、GAの拒絶に関与する細胞型のGr-1 + / +のCD11bの検出骨髄細胞およびNK1.1 + NK細胞を有効にする4つの細胞表面抗体の組み合わせを用いて実証されていますL-1欠損神経膠腫。細胞内GZMB抗体を含めることは、さらに、NK細胞のサブセットにおける細胞毒性の可能性を検出することができます。代表的な結果をいずれかが原因のshRNA媒介遺伝子ノックダウンのレベルが低下しているGAL-1の正常なレベルで発現するか、同系のC57BL / 6Jマウスで早期GL26-Citを神経膠腫への免疫細胞の浸潤のために提供されます。デモでは、神経膠腫浸潤PBMCを再現性よく単離して、すぐに24時間後に腫瘍生着として定量化することができることを示すことによって技術の感度と再現性を示します。 。別に腫瘍浸潤GR-1 の高 /のCD11b +骨髄性細胞の集団を明らかにするから、デモも、同一現在定義されていないGR-1 INT ​​/のCD11b +細胞の集団を明らかにする。追加の実験は、さらに、この細胞集団の文字を解読するために必要です。我々はまた、我々は、CD45の容易に識別人口を観察していないことに注意してください<suP&gt; int型/ GR-1 - / CD11bの高い /NK1.1 -以前に他人23,24によって記載されているようにミクログリア細胞と一致しています。この結果の簡単な説明は、ここで使用される特定の分離プロトコルは70分の37密度遠心分離メディア・インターフェースでそれらの蓄積を排除することです。これは、70分の37密度遠心分離界面から採取した細胞は、神経膠腫細胞自体を含むように表示されないことを指摘することも重要です。これは事実によって明らかであるSSC-Aに100-200Kの間に表示されるとの100K GL26-Citの神経膠腫細胞、FSC-このデモで使用されるものと同等のPMT電圧を使用して（データは示さず）FSC-には存在しません対SSC-Aプロット（ 図5Aを参照してください。ステップ1）。 抗GR-1抗体は25、それぞれ、多形及び単核骨髄細胞に特異的であるLy6GとLy6C細胞表面タンパク質の両方を認識する。抗GR-1不格好なやつの使用IESは、このように、これら2つの細胞集団間の区別を排除します。私たちの研究室での予備的な結果は今GAL-1欠損神経膠腫の微小環境を浸透させる初期のGR-1 + / +細胞のCD11bのより正確な記述に光を当てるし始めています。 （：1A8クローン）および抗Ly6C（クローン：AL-21）抗Ly6G組み込んだ実験抗CCR2抗体と一緒に抗体が今GR-1 の高 /のCD11b +細胞が初期のGAL-1欠損腫瘍微小環境を浸透させることを示していますさらなる実験は、この結果を確認するために必要とされるが、 高 Ly6C / CCR2 高い炎症性単球と一致している（データは示さず）。 セルにそれが神経膠腫浸潤のPBMCを単離することに関与して繰り返しの遠心分離および再懸濁工程中に発生する可能性があります失うために、それは、細胞数を観察している可能性があり、実際に何が無傷の脳内に実際に存在していることが低くなっています。しかしEとの間には、違いが70分の37密度遠心分離メディアインターフェイスの同等のボリュームが抽出された場合、各サンプルの全体積をフローサイトメーターによって分析されている場合xperimentalグループが保持する必要があります。これらの手順に従わないはサンプル間の不公平な比較になりますし、公平な分析を排除します。脳の腫瘍微小環境に入るPBMCの正確な数を定量化することができないことは、このプロトコルに制限固有のものではありません。このような免疫組織細胞計数戦略などの代替の方法は、潜在的に偽につながる、また立体数とバックグラウンド染色のレベルが異なっていてもよい組織切片の顕微鏡写真上の同等の画像閾値化の要件に基づいて、総細胞数の外挿による誤差する場合があります陰性または偽陽性シグナル。それにもかかわらず、別の分析方法間の時間経過分析の比較は、同様の全体的な形状の時間依存免疫流入曲線を明らかにする必要があります。アン免疫組織化学的方法への追加の欠点は、ホルマリン固定された脳組織切片の文脈における等価な抗原エピトープに結合するために、フローサイトメトリーのために検証され、特定の抗体のできないことです。 その方法に慣れていない人のための制限として機能することができるこのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。そのようなステップは、それを損傷することなく、頭蓋から脳を採取あります。私たちは前に適切な実験を実行するための技術を数回練習することをお勧めします。脳が最終的に摩砕されますので、脳の表層に若干の損傷は神経膠腫浸潤PBMCの正確な定量に取るに足らないと思われます。経験の浅い研究者が最初に困難見つけることが第二段階は、密度遠心分離メディア勾配の注入です。の上に37％の密度遠心分離媒体を2mlを覆う一方でクリーンな界面を形成する実験者の能力70％の層は、PBMCの再現性の分離に不可欠です。この手順は、最初に挑戦的な証明することができるが、それは非常にPBMCを富化し、劇的にフローサイトメトリーで分析する全脳組織の場合にそうでない場合、サンプル分析に必要な時間を減少させます。 PBMCの濃縮はまた、このように.fcsファイルサイズを削減し、希少な脳浸潤免疫細胞集団を解決するために支援し、フローサイトメーターにより取得されたイベントの合計数を減らすことができます。きれいな密度遠心分離インタフェースを確立する上で最良の結果を得るために、私たちは、滑らかなプランジャー作用を有するP-1000マイクロピペットを用いて37％の密度遠心分離媒体を注ぐお勧めします。 15ミリリットルの遠心管は約20〜30°ベンチトップ上の角度。 mlのマーキング70％密度遠心分離媒体層の表面上の管3-5の側にマイクロピペットの先端を休ま。それとして37％の密度遠心分離媒体の明白な外向きの運動量を最小にするために着実にゆっくりと注ぐextruデ基礎となる70％の密度遠心分離媒体を乱さないようにするためにマイクロピペットチップから。最後に、脳の組織構造は、必ずしも神経膠腫浸潤のPBMCの単離の過程で破壊されるという事実は、追加のマウスは、組織学的データと一致した時点を得るために必要とされることを意味します。 通常のげっ歯類の脳への発癌性のプラスミドDNAの注入を介して生成された新しい神経膠腫モデルは26-32近年開発されてきました。これらの「内因性」の腫瘍モデルは、定位的にex vivoで癌細胞を移植するとより密接に臨床神経膠腫の組織学的特徴を模倣することによって引き起こされる潜在的なアーチファクトを回避します。本明細書に記載される方法は、これらの多くの臨床的に関連するモデル系を特徴付ける免疫浸潤事象の研究に適しています。新生仔マウスにおける免疫流入の研究はまた、新生児の覚書の密度が、この方法を用いて行うことができますE脳は、脳組織の消化にわたって防止するために、酵素消化工程の最適化を必要とすることが成人のそれよりも小さいです。技術のさらなる用途は、そのような実験的アレルギー性​​脳脊髄炎（EAE）などの悪性腫瘍やウイルス感染に対する免疫応答とは別に、炎症性脳疾患の代替クラスの調査を含みます。

神経膠腫は、中枢神経系（CNS）内に形質転換されたグリアから生じる神経上皮脳腫瘍のクラスです。すべての神経膠腫の、世界保健機関（WHO）グレードIVの神経膠腫、またはグリア芽腫（GBM）は、1最も一般的で致命的です。 GBMは、現在の標準のケアテモゾロミド2と放射線プラス付随およびアジュバント化学療法に続いて可能な限り腫瘍切除で構成さに非常に難治性です。これらの致命的な癌は5年3後の疾患の生存患者のわずか5％の初期診断時からの生存の唯一の15〜18ヶ月の悲惨な予後を運びます。 血液脳関門（BBB）の存在は、脳内の4細胞（APC）のプロフェッショナル抗原提示の欠如、および真正なリンパ管構造の以前に同定されていない存在は、免疫特権としてGBMの概念をもたらしました。しかし、今、多くの研究笙これらの脳癌は確かに、単球、マクロファージ、および骨髄由来抑制細胞（のMDSC）5を含む 、原点に主に骨髄ある末梢の免疫細胞の動員を生み出すことワットGBMはまた、6,7-プロ腫瘍形成になるための脳常駐ミクログリアの活性に影響を与えます。そのようなCD8 + T細胞8とCD56 +ナチュラルキラー細胞9などのリンパ系細胞はまた、腫瘍微小環境内に存在しているが、はるかに少ない数で、思ったことは、（、腫瘍関連マクロファージに神経膠腫由来因子によって扇動免疫抑制機能のためであるとするTAM）10。 CD4 + T細胞は、GBMにも存在するが、この集団の多くはまた、CD25とのFoxP3、免疫調節性T（TのREG）細胞11のメーカーを表しています。 GBMの全体的な免疫抑制状態は、免疫学的脱出し、腫瘍の進行12のプロモーションで最高潮に達します。 13-19を開発するために、脳腫瘍immunosuppressonのメカニズムを克服するために取り組んできました。この作品の集大成が今新たに診断されたGBM（：NCT01811992 ClinicalTrials.gov識別子）を持つ患者のために組み合わせた細胞傷害性および免疫刺激治療を評価するために設計された臨床試験につながっています。 私たちの最新作は、マウスGL26およびラットCNS-1 GBM細胞は、βガラクトシド結合レクチンガレクチン-1（GAL-1）20を大量に生産することにより、抗腫瘍NK細胞免疫監視をブロックすることを示しています。これは、shRNAを媒介遺伝子ノックダウンを用いた神経膠腫細胞におけるGAL-1の発現を抑制することにより実証された。 インビトロ experimenTSは、GAL-1欠損神経膠腫細胞は、培養中に正常に増殖していることを示した、まだ同系C57BL / 6JまたはRAG1に頭蓋内移植後すぐに急速な拒絶を受けた- / -マウスでは、このように、このフォームで、TまたはB細胞の独立性を確立します腫瘍拒絶。抗アシアロGM 1抗血清またはモノクローナルNK1.1抗体とNK細胞の免疫枯渇は、GAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応におけるNK細胞の役割を確立し、頭蓋内GAL-1欠損神経膠腫の成長の完全な回復につながりました。現在、GR-1 + / CD11bのの免疫枯渇+骨髄細胞は、このように、NK媒介ギャルの補助で骨髄細胞のための不可欠な補助的な役割を明らかにし、NK細胞の存在にもかかわらず、GAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応を予防するのに十分であることを示しています-1欠損腫瘍溶解（未発表データ）。この予想外の結果は、末梢血単核細胞（PBMC）の単離と解析のための包括的なプロトコルを開発するために私たちをリードしてきました私たちはより良いGAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応を述免疫浸潤イベントを特徴づ​​けることができるようにすぐに頭蓋内移植後の脳の腫瘍の微小環境を浸透させます。 この方法は、GL26-Citを呼ばれる構成的に発現mCitrine蛍光タンパク質は、蛍光顕微鏡21による直接の腫瘍細胞の可視化を可能にするマウスGL26神経膠腫細胞を用いて、ここに示されています。これらの細胞は、定位的に同系のC57BL / 6Jマウスの脳に移植され、前のマウス安楽死に24、48、または72時間増殖させます。神経膠腫浸潤PBMCを、次に抗-CD45を用いて単離し、免疫標識され、-GR-1、-CD11bおよびグランザイムBの細胞内免疫標識と一緒-NK1.1細胞表面抗体（GZMB）。抗体のこの特定の組み合わせは、腫瘍浸潤のGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11bおよびNK1.1 + NK細胞、細胞型、我々は、Bを持っているの同定を可能にしますEENは、GAL-1欠損腫瘍拒絶に関与します。 GAL-1欠損GL26-のCIT神経膠腫の免疫浸潤プロファイルは、GL26-CIT-gal1iとしてここでいう、その後非が含まれているGAL-1 GL26-CIT-NTと呼ばれるの正常なレベルで発現する神経膠腫のものと比較します対照shRNAのヘアピンをターゲットに。プロトコルは、同所同系のC57BL / 6Jマウスの線条体にこれらの細胞を生着する方法についての説明が続いて試験管内でどのように文化GL26-Citの神経膠腫細胞上の説明で始まり。その後、フローサイトメトリー分析のための神経膠腫浸潤PBMCの単離及び免疫標識に必要な手順を列挙するために進みます。プロトコルは、標準的なデータ分析とグラフ表示の説明を終わります。 デモでは、両方のGr-1 + / CD11bの+骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞は優先的に48内GAL-1欠損脳の腫瘍微小環境内に蓄積することが明らかになりました腫瘍移植の時間、これらの腫瘍は急速に完全な腫瘍溶解約1週間後の腫瘍生着20を受ける理由を説明するのに役立ちます結果。この方法は、脳への免疫浸潤に関する時間データが要求されるインビボでの異なる実験計画の数に容易に適応可能です。単一の実験者は、分析すべき試料の数に応じて、約4-6時間で神経膠腫浸潤PBMCのフローサイトメトリー分析するために脳の収穫からプロトコルを実行することができます。この方法はまた、特に腫瘍微小環境によって誘導される免疫抑制表現型を識別するよう脳に浸潤するものと比較するために、腫瘍担持マウスでのPBMCの循環プロフィールを特徴づけることを目的とした実験と組み合わせることができます。これと同じような方法の適用は、脳の腫瘍微小環境への末梢免疫細胞の輸送に関与する因子の理解を容易にするはずです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430-054</td>
			<td>with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td>without calcium chloride or Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000U/ml Penicillin; 10,000&#956;g/ml Streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate&#160;</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>GN-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>from Streptomyces alboniger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30030.01</td>
			<td>in DPBS with EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>0.1mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% NaCl injection, USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC: 0409-4888</td>
			<td>10ml vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6ml conical polypropylenemi microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride injection</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>NDC: 52483-6298</td>
			<td>5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Fort Dodge</td>
			<td>NDC: 0409-2051</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride injection</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NDC: 54771-2805</td>
			<td>0.5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride injection</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NDC: 61311-481</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC: 61106-8501</td>
			<td>50mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride injection</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>NDC: 12496-0757</td>
			<td>0.3mg/ml ampuls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml tuberculin syringes&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881501400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x &#189; (0.45mm x 13mm) syringe needles&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clippers</td>
			<td>3M</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-217</td>
			<td>NDC: 52380-1905</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petrolatum ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC: 17033-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol prep pads</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td>non-woven, 4&#34; x 4&#34;, 4-ply&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml conical polypropylene microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Philips Burton</td>
			<td>CS316W</td>
			<td>Coolspot II Variable Spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved dissecting forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri retractors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless precision power drill</td>
			<td>Dremel&#160;</td>
			<td>1100-01</td>
			<td>Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving Cutter</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>105</td>
			<td>1/32&#34; or 0.8 mm bit diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>75</td>
			<td>Hamilton Microliter&#174; Syringes 700 series; 5&#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-06</td>
			<td>33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74950-296</td>
			<td>7.9mm diameter x 50mm length (5/16&#34; diameter x 2&#34; length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L glass screw-cap storage bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395</td>
			<td>Type 1, Class A borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium&#160;</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400</td>
			<td>1,000U/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer Instruments Group</td>
			<td>77200-60</td>
			<td>Master Flex Easy Load II console drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td>
			<td>available from local vendor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A-type, large cylinder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G x 1 &#189;&#34; aluminum hub blunt needles</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>8881202363</td>
			<td>0.9mm x 38.1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>Capacity: 0.152 oz. (4.5L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type I-S)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1639</td>
			<td>from Clostridium histolyticum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>&#62;2,000 Kunitz units per mg dry weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>20157-3</td>
			<td>top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel single edged razor blades&#160;</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone rongeurs</td>
			<td>FST</td>
			<td>16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissection scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7ml glass Dounce tissue grinder</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll Density Centrifugation Media&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-104</td>
			<td>single use; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m sterile nylon mesh cell strainers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td>
			<td>eBiosciences&#160;</td>
			<td>17-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG2a, &#954; (clone: eBM2a) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: eB149/10H5) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>515403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &#954; (Clone: MOPC-21) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103</td>
			<td>conical bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td>conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-956-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>650033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG603</td>
			<td>model: SterilGARD III Advance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells

私たちの研究室では最近、癌細胞はβガラクトシド結合レクチンガレクチンの発現が欠損しレンダリングされた場合に、ナチュラルキラー（NK）細胞はすぐに頭蓋内移植後に同所移植したマウスGL26およびラットCNS-1悪性神経膠腫を根絶することができることを実証しました-1（GAL-1）。より最近の研究は現在、GR-1 + / CD11bの+骨髄系細胞の集団がこの効果に重要であることを示しています。優れたNK細胞と骨髄細胞は、我々は、神経膠腫浸潤末梢血単核細胞（PBMC）の単離および分析のための総合的なプロトコルを開発したGAL-1欠損腫瘍拒絶を付与するために協力するメカニズムを理解するために。この方法は、shRNAのノックダウンを経由してGAL-1欠損レンダリングされたものとGAL-1を発現するGL26の神経膠腫の腫瘍微小環境へのPBMCの浸潤を比較することによって、ここに示されています。プロトコルはどのように文化の説明から始まり、GL26のCEを準備同系のC57BL / 6Jマウスの脳への接種のためにLLS。その後、初期の脳の腫瘍微小環境から神経膠腫浸潤PBMCの単離およびフローサイトメトリー解析に必要な手順について説明します。この方法は、脳への免疫浸潤に関する時間データが要求されるインビボでの実験計画の数に適応可能です。神経膠腫浸潤PBMCを、すぐに独立した実験を通して腫瘍一致した時点から観察同様の細胞数と24時間後に腫瘍生着などの頭蓋内腫瘍から単離することができるような方法は、高感度で再現性の高いです。単一の実験者は、分析されるサンプルの数に応じておよそ4-6時間で神経膠腫浸潤PBMCのフローサイトメトリー分析するために脳から採取方法を実行することができます。代替の神経膠腫モデルおよび/または細胞特異的な検出抗体は、他のいくつかのIMMUNの浸潤を評価するために実験者の裁量で使用することができます手順全体への変更を必要とせずに、目的の電子細胞タイプ。

CD11bの対FSC-W→CD45対数→GR-1対SSC-W→FSC-H対SSC-A→SSC-H対FSC-A→：次のゲーティング戦略は、典型的な実験のために使用されています数対NK1.1。ゲイツ氏はその後GZMB式（図5A）に基づいて層別化されたGR-1 + / CD11bの+骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞上に置きました。 NK1.1 + NK細胞およびGR-1 + / CD11bのSSC-Aは、NK細胞の小さいリンパサイズおよび骨髄細胞の比較的大きなサイズを確認する対FSC-Aへの我々の実験で+骨髄細胞（と同定された細胞をバックゲート図5B）。生データファイル（ すなわち 、FCSファイル）は、FlowJoソフトなどの市販のフローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアにより分析されます。 18 C57BL / 6Jマウスの合計は、この方法を示すために使用されました。ナイン（9）GL26-CIT-NTに移植したと9は同じD上のGL26-CIT-gal1iを移植しましたAY細胞（3×10 4）の同等の番号を使用して。各グループからの3匹のマウスは、24、48で安楽死させ、そして72時間後に腫瘍の生着されました。データは、同系のC57BL / 6Jマウスの脳へGL26-CIT-gal1i神経膠腫細胞の生着が急速にCD45 + PBMCを（図6A）の動員を誘発することを示します。デモで使用される特定の抗体カクテルに基づいて、それは、さらに、GR-1 + /のCD11b +骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞は、特に、腫瘍移植の48時間（図内GAL-1欠損腫瘍微小環境に入ることを示すことができます図6Bおよび6C）。これまでNK細胞のそれを上回る神経膠腫浸潤骨髄細胞のしかし総数。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53676/53676fig1.jpg" /> 図1：頭蓋内生着のためGL26-Citを細胞の調製（。）代表10Xの明視野およびGL26-CIT-NT（左画像）とGL26-CIT-gal1i（右画像）培養で増殖させた細胞のエピ蛍光顕微鏡写真。 （B）GL26-CIT-NT（左レーン）とGL26-CIT-gal1i（右レーン）の全細胞溶解物のウエスタンブロット。ガンマチューブリンは、（γ-浴槽。）ローディングコントロールとして示されています。 4℃で5分間、550×gで（最大RCF）で遠心分離した後、約50％コンフルエントT75組織培養フラスコから（C）GL26-Citを細胞ペレット。細胞数および生存率を評価するために、トリパンブルーで1：（D）GL26-Citを細胞（白丸）を含む血球計の明視野図1に希釈しました。細胞は、再現性の腫瘍の成長を確保するために&gt; 90％生存可能である必要があります。 1〜5を標識正方形の細胞数の平均値は、細胞数の推定の精度を高めるために取られるべきです。頭蓋内implaため未補充したDMEM中で3×10 4細胞 /μLで再懸濁し、（E）GL26-Citの細胞ntation。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53676/53676fig2.jpg" /> 図2：C57BL / 6Jマウスの線条体に神経膠腫細胞の生着に必要な定位手術器具や試薬を示す（A）手術室のレイアウト。。 （B）0.5ミリメートル、AP、2.5ミリメートル、ML、および-3.0 mmのブレグマへのDV相対的で適切な針の配置と定位フレームに活かさC57BL / 6Jマウスのビューを閉じます。ブレグマの位置および腫瘍細胞移植のための標的部位を示すマウスの頭蓋骨の（C）背ビュー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3：マウスTranscardial灌流（A）解剖、粉砕、およびマウスの脳組織の酵素消化に必要な試薬。 （B）端子マウスの外科的処置に捧げ層流フードに示す酸素化し、ヘパリン処理したタイロード液でtranscardial灌流マウスに必要な機器・試薬のレイアウト。 （C）適切な楽器とtranscardial灌流のために必要な配置を実証した心臓の模式図。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53676/53676fig4.jpg" /> 図4：神経膠腫浸潤の単離PBMCを早期同所性神経膠腫のインプラントを含むマウスの脳組織の解剖のための（A）戦略。トップパネルは、離れて反対側の半球から同側半球の矢状二分を示しています。下のパネルは、（紫で強調表示）腫瘍移植を含む標的組織を分離するために必要な二つの追加の冠状カットを示しています。酵素消化後（B）の単一細胞の脳組織ペレット（白矢印）、70μmのナイロンメッシュおよび遠心分離による濾過。 （C）は、適切に遠心分離前に密度遠心分離媒体勾配を注ぎました。白い矢印は、二つの密度遠心分離媒体層との間に形成されたクリーンなインターフェイスを示しています。 （D）37％密度遠心分離媒体層の白矢印の上部に形成する脂質層）とPBMCバンドを実証し、遠心分離後の密度遠心分離媒質勾配（第によって概説します2つの層の間の界面での電子破線の黒線）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53676/53676fig5.jpg" /> 図5：フローサイトメトリーゲーティング戦略は、神経膠腫浸潤GR-1 + / CD11bの+骨髄細胞およびNK細胞を識別するために使用される（A）ステップ1：合計密度遠心分離メディア勾配のPBMCのバンドから単離された細胞は、上にゲートされ、免疫標識細胞破片を除外する（FSCレスK 50〜より）。ステップ2と3：ダブレット識別ゲーティングは、細胞凝集物をフィルタリングします。ステップ4：神経膠腫浸潤免疫細胞を同定するためのCD45ゲート。アイソタイプ対照は灰色のシルエットとして示されています。ステップ5：GR-1とのCD11bに基づいて層別化したCD45 +細胞 。 GR-1とCDの両方のアイソタイプ対照<html> 11bは、プロット上に重ね、金の円で囲まれています。赤い円は、GR-1 + / CD11bの+骨髄細胞を示します。ステップ5 &#39;：GZMB式に基づいて層別化のGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11b。前提として、これらの細胞はアイソタイプコントロール（灰色のシルエット）を介して抗GZMB抗体で標識しません。ステップ6：NK1.1の発現に基づいて層別化し、ステップ5で黒い長方形によって概説GR-1 low細胞 。アイソタイプ対照は灰色のシルエットとして示されています。ステップ6 &#39;：NK1.1 高い細胞GZMB式に基づいて層別化。これらの細胞は、確かに、アイソタイプコントロール（灰色のシルエット）上記抗GZMB抗体で標識します。 NK細胞はリンパより小さいサイズを有することを、実証SSC対FSC-AへのGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11bの（B）バックゲートより大きなサイズのGr-1 + / +骨髄のCD11b細胞と比較して。&quot;_blank&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53676/53676fig6.jpg" /> 図6：頭蓋内腫瘍増殖の最初の3日間でGL26-CIT-gal1i腫瘍微小環境対GL26-CIT-NTへのPBMC浸潤の比較（A）総CD45 +免疫細胞。 （B）CD45 + / GR-1 + / +骨髄系細胞のCD11b。 （C）CD45 + /NK1.1 + NK細胞。 GL26-CIT-gal1i神経膠腫から単離されたPBMCからのデータ点を滑らかな線で接続され、時々GL26-CIT-NT神経膠腫から単離されたものは、点線で接続されています。 3匹のマウスの神経膠腫浸潤PBMCを、各時点での腫瘍タイプごとに分析しました。 GL26-CIT-gal1i曲線上の各データポイントに関連付けられている数字はGL26-CI上で、その特定のPBMC型の誘導倍率を表しますT-NT指定時間後に腫瘍移植で（HPI）。データは、平均±標準誤差（SEM）カウント免疫細胞の平均数を表します。統計分析は、分散の2ウェイ分析によって行った。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K ビュー.  University of Michigan. 初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。 

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Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

マウス腹腔細胞の分離

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

免疫・感染学

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)1. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD5, 6. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production6, 7and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells8and CD4 T regulatory cells9.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals10.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro11. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation12. Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

This paper describes a simple technique to induce alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells. The technique can be applied clinically to generate non-alloreactive donor cells. Infusion of these cells could improve immune reconstitution and reduce toxicity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...