Bu yazıda iş Radyasyon Onkolojisi Bölümü ve Huntsman Kanser Enstitüsü ve SB Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü (R01-CA188520) fon tarafından desteklenmiştir. Ben protokol gösteren ve avantajlarını açıklayan benim laboratuvar Danielle Johnson ve Steven Bennett teşekkür ederiz. Ben yazının eleştirel yorumlar için Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Kanser Enstitüsü) müteşekkirim.

BrdU Etiketleme aşağıdaki 1. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) <ol><li> DMSO veya HDAC1,2 seçici önleyicileri, ya mevcudiyetinde kültür NIH3T3 hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi, 6. </li><li> DMSO veya HDAC1,2 seçici inhibitörler ile işlendikten sonra, steril doku kültürü kaputu hücrelere BrdU ekleyin. Steril 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde 60 dakika için bromodeoksiüridin bir 20 uM nihai konsantrasyon (BrdU) ile 10 mi NIH3T3 ortamda kaplanmıştır 2 x 10 6, NIH3T3 hücreleri inkübe edin. </li><li> % 1 bir son konsantrasyonda kültür ortamına doğrudan formaldehid eklenerek DNA çapraz bağ hücre içi proteinlerdir. Bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında formaldehid ile 2 x 10 6 NIH3T3 hücreleri inkübe edin. </li><li> 125 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar glisinin eklenmesi ile çapraz bağlanma Quench. Bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Ortamı çıkarın ve 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne PBS içinde hücreleri toplamak. Spin cel4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 956 x g&#39;de ls. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez hücre pelletini yıkayın. Tüp PBS çıkarın. Kullanılana kadar -80 ° C&#39;de PBS (süpernatant) olmadan çapraz bağlanmış hücre pelletini saklayın. </li><li> 500 ul FA140 tamponu eklenerek çapraz bağlanmış hücre topağından lizat hazırlanması (50 HEPES KOH mM pH 7.5, NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat) proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiştir. </li><li> Numuneleri% 35 güçte ve 15 sn darbesi ile beş kez, 0.9 sn ve 0,1 sn kapalı ayarı sonicating ile kromatin Kayma. Numunelerin ısınmasını önlemek için sonication her turdan sonra buz üzerinde tüpler tutun. <ol><li> Farklı sonicators arasında değişecektir kesme verimliliği gibi bir DNA jel üzerinde kesme kontrol edin. Sonikasyon kontrol etmek için, 0.16 M &#39;lik bir konsantrasyon NaCI eklenerek çapraz bağ ve ters adımları 1.17.1 gerçekleştirin. - 1.22. Run kesme olup olmadığını kontrol etmek için% 1.5 agaroz jel üzerinde 10 ul DNA yıkandı500 bp ortalama bir yoğunlukta bp 700-300 arasında. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 17.949 x g&#39;de 10 dakika süre ile sonikasyon santrifüj örnekleri takip eder ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. <ol><li> Imalatçının protokolüne göre, ticari protein tahlil kiti kullanılarak protein tahmin gerçekleştirin. Deney ve kontrol örneklerinin ChIP için lizatın eşit miktarda kullanın. Genellikle, ChIP reaksiyon başına toplam lizatın 1 mg kullanın. </li></ol></li><li> Proteaz inhibitörü kokteyli içeren FA140 tamponu kullanılarak protein A-agaroz% 50 bulamaç hazırlanır. Proteaz inhibitör kokteyli 1/10 hacim. Toplam numune sayısına göre gerekli boncuk hacmini hesaplayın. <ol><li> FA140 tamponu ile yıkayın Protein A-agaroz taneleri iki depolama tamponunu çıkarın ve% 50 bulamaç yapmak için tanelere FA140 tamponuna eşit hacmi ekleyin. </li><li> , Spesifik olmayan boncuklara bağlanan proteinler kaldırmak Protein A-agaroz ve% 50 bulamaç 50 ul için30 dakika boyunca bir mikser içinde rotisserie sabit ucu-üzerinde uca döndürülerek 4 ° C&#39;de örnekleri cubate. </li></ol></li><li> Bir dakika boyunca 4 ° C&#39;de 956 x g&#39;de örnekleri dönerler. Süpernatant toplayın ve 8 ul H4K16ac antikor veya süpernatana 1 mg / ml SMARCA5 antikorun 5 ul (5 ug) ya da eklenmesi ile imüno gerçekleştirin. Bir et lokantası mikserde sabit uç-over-end rotasyon ile 4 ° CO / N inkübe edin. </li><li> &#39;Giriş&#39; kontrol için ekstraktı 1 / 10th kaydedin ve kenara -20 ° C&#39;de ayarlayın. Giriş IP örnekleri ile birlikte çapraz bağlanmış ters olması gerekmektedir. </li><li> Negatif kontrol numunesi olarak immüno-tavşan IgG eşit miktarda (1 mg / ml 5 ul) kullanın. </li><li> Ertesi gün, ekstraktı% 50 protein A-agaroz bulamacın 50 ul ve rotasyon ile 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 956 x g&#39;de santrifüj ile agaroz boncuklar Pelet, dikkatli bir şekilde süpernatan ve wa kaldırmaardışık olarak, aşağıdaki tampon maddeleri ile boncuk sh. Tampon hazırlıkları ise, sağ kullanımdan önce proteaz inhibitörleri ekleyin. <ol><li> Düşük Tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA140 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> Yüksek tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA500 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 500 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> LiCİ İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ucu-üzerinde uç rotasyon ile 4 ° C &#39;de 5 dakika süre ile (Tris-Cl pH 8.0, LiCI 250 mM,% 0.5 NP-40 ve% 0.5 sodyum deoksikolat, 10 mM nihai konsantrasyon) ile yıkayın. </li></ol></li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi yıkama sonrasında, 200 ul yıkama çözeltisi ve incubat (% 1 SDS ve 100 mM sodyum bikarbonat nihai konsantrasyon) ekleyinoda sıcaklığında ucu-üzerinde uç rotasyon ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ör. </li><li> Oda sıcaklığında 956 xg&#39;de örnekleri Spin ve yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe eluat aktarın. Ek 200 ul yıkama solüsyonu ile adımı yineleyin 1.15. </li><li> Taşıma ürününden 400 ul için, 0.16 M &#39;lik bir konsantrasyon NaCI ekleyin ve iyice karıştırın. <ol><li> Buna ek olarak, bir kenara bırakıldı 10 ul girişi (adım 1,11) 400 ul yıkama çözeltisi eklenmekte ve hem de çapraz giriş örnekleri ters 0.16 M&#39;lik bir konsantrasyona kadar NaCl ilave edin. 5 saat boyunca 65 ° C su banyosu içinde inkübe edilerek örnekleri çapraz bağlanması ters. </li></ol></li><li> Ters-çapraz bağlanmış, ayrılmış malzeme% 100 EtOH 1 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 2 için -80 ° C&#39;de inkübe - 3 saat ya da -20 ° CO / N oranında. 15 dakika boyunca 17.949 x g&#39;de örnekleri Spin ve etanol atın. </li><li> Pelet yıkamak için 800 ul% 70 etanol ekleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17.949 x g&#39;de Spin ve etanol atın. Herhangi bir kalıntı etanol çıkarmak için kısaca Spin. 1 için 37 ° C &#39;de numuneler hava-kurutun0 dakika geriye kalan etanolü atmak üzere. </li><li> 90 ul RNase DNA ve DNaz serbest su içinde çözülür ve 0.2 mg / ml nihai konsantrasyonda 2 ul 10 mg / ml RNase ekleyin. 30 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 ul 10x Proteinaz K tamponu (100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 5 SDS) eklenir. İyice karıştırın ve 1 saat süre ile 42 ° C &#39;de 1 ul Proteinaz K inkübe ekleyin. </li><li> Imalatçının protokolüne göre, ticari PCR saflaştırma kiti kullanılarak giriş ve yonga DNA saflaştınlır ve 50 ul su içinde elüt DNA. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklayın DNA arasında değişir. </li></ol> 2. Yuva yonga DNA bölgesinin Leke Analizi <ol><li> 280 değerinde bir spektrofotometre kullanılarak mil üreticinin protokolüne göre aşama 1,22 tarif edildiği gibi 50 ul su içinde elüt giriş ve yonga DNA verimini ölçün. </li><li> Algılama lineer aralığında olan giriş eşit hacimlerde (50 | il) veya immünopresipitasyon DNA al. <ol><li> Örneğin, eğer girişDNA verimi 1.5 ng / ml, daha sonra (toplam DNA ng veya 45) 30 ul almak ve su ile 50 ul hacmi hale getirilmesidir. Faktör ChIP için Adım 2.1 tamamını 50 ul eluat alıp 2.3 adıma geçin. </li></ol></li><li> 0.4 N NaOH, kısa bir süre vorteks ve 10 saniye boyunca 956 x g&#39;de santrifüj 2.5 hacmi eklenerek 50 ul giriş veya immünopresipitasyon DNA&#39;yı denatüre ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 10 sn için 956 x g&#39;de 1 M Tris-HCl, 175 ul, pH 6.8, girdap, santrifüj eklenerek denatüre DNA nötralize ve buz üzerinde örnekleri yer. </li><li> Aşağıda tarif edildiği gibi Slot Blot analizi için bir giriş seri dilüsyonu ve immünopresipitasyon DNA hazırlayın. <ol><li> Adımları 2.3 takip - 350 ul toplam numune hacmi elde etmek için 2.4 (örneğin, 50 ul giriş / yonga DNA, 125 ul 0.4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCI, pH 6.8). Not: Yukarıda belirtilen örnek için, giriş DNA 45 ng 0.129 ng / ml olarak sona erecek. </li><li> Giriş DNA, üç tüp etikets, 100, 50 ve 25 ve 100 ul, 50 ul ve denatüre edilmiş DNA, ve nötralize örnek 25 ul olarak. Nükleaz içermeyen su ile 100 ul son hacim sağlayın. ChIP DNA, etiket 200, 100 ve 50 ve 200 ul ekleyin üç tüp, 100 ul ve denatüre ve nötralize DNA örneği 50 ul. Nukleaz ücretsiz su ile 200 ul son hacim yapın. </li></ol></li><li> Slot Blot düzeneğinin büyüklüğüne zar kesilir. Önce 20x SSC içinde membran ve kurutma kağıtları Öncesi ıslak ve DNA eklemeden önce. Üreticinin protokolüne uygun olarak slot blot cihazının içine monte edin. </li><li> Uygun yuvalara adım 2.5.2 den Pipetleyin DNA. Zeta-prob zar üzerine DNA çekmek için yavaşça vakum uygulayın. Tüm numuneler aparatı sayesinde geçtikten sonra vakum durdurun. <ol><li> Aparat sökün ve hemen UV çapraz bağlayıcı kullanılarak zar üzerine DNA hareketsiz. UV çapraz bağlayıcı DNA tarafı yukarı ve au kullanınçapraz bağlayıcı ayarı tocrosslink. Üreticinin protokolü takip edin. </li></ol></li><li> Batı blotting gerçekleştirerek yuvası leke üzerinde BrdU Algılama. <ol><li> PBS içinde yağsız kuru süt,% 5 zara antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere, oda sıcaklığında 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (PBST) içeren bir membran bloke. </li><li> Birincil anti-BrdU antikoru (1: 500 seyreltme) ilave PBST içinde% 1 yağsız kuru süt içinde seyreltilir ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 3 saat primer antikor ile leke inkübe edin. Primer antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın. </li><li> Blot HRP-konjuge anti-fare ikincil antikor ekleyin (1: 5000 seyreltme) ile, 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. İkincil antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın. NOT: Tamamen birincil ve ikincil antikor inkubasyon sırasında membran kapsayacak antikorların yeterli hacim kullanın. </li></ol></li><li> ECL karışımı hazırlayın ve leke ac eklemeküreticinin protokolüne kordlardan seçilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ECL karışımı ile membran inkübe edin. <ol><li> , Bir X-ışını kasetine membran yerleştirin X-ışını filmine maruz membranı ve üretici protokolü kullanılarak leke gelişir. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, Resim J yazılımı kullanılarak blot tarama sonra giriş ve chiped DNA için elde edilen sinyal, sayısal olarak. Nicelendirilmesi için, ölçüm doğruluğunu sağlamak amacıyla tespit doğrusal aralığı içindedir sinyali kullanılır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability.">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression.">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability.">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li><li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC1,2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li><li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair:+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers.">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li><li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains.">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li><li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+dynamics+at+active,+stalled,+and+collapsed+replication+forks.">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li></ol>

I have no competing financial interests.

Bu yazıda tarif edilen protokol, yeni çoğaltılmış ya da doğan DNA protein veya translasyon sonrası modifiye edilmiş formları varlığını göstermek için nispeten hızlı bir yöntemidir. Buna ek olarak, bu teknik, bir protein ya da doğan DNA ile değiştirilmiş bir biçiminin bağlanma-ayrılma kinetikleri ölçmek için bir olanak sağlamaktadır. Bu teknik zarif iPOND teknolojisi 13 tamamlayıcıdır. IPOND teknolojisinde, yeni sentezlenmiş DNA, etil deoksiüridin (edu) ile etiketlenir. Bir biyotin konjuge sonra tıklama kimyası kullanılarak edu üzerine eklenir. Biotin-etiketli olgunlaşmamış DNA daha sonra western blotting ile tespit edilir streptavidin boncuk ve birlikte temizleyici proteinleri kullanılarak imüno-çökeltilir. Diğer yandan, BrdU-chip-Yuva Batı tekniğinde, oluşmakta olan DNA ile bağlantılı bir protein ya da değiştirilmiş formdaki bir protein-spesifik ya da değiştirilmiş formunun özgü antikor ve bağlı BrdU etiketli oluşmakta olan DNA miktarı ile imüno-çökeltilir Protein then, bir anti-BrdU antikoru kullanılarak slot-Western blot ile kantitatif olarak belirlendi. Özel dikkat gerektiren bu protokol kritik adımlar vardır. Bu ilgili antikor yüksek verimle standart bir çipli deneylerinde iyi çalıştığından emin olmak için önemlidir. Bu BrdU-CHIP-Slot-Batı tahlil yapmadan önce nicel-PCR ile ChIP deneyleri bir antikorun etkinliğini test etmek önemlidir. Doğru olduğu BrdU CHIP Yuvalı Batı tekniğin nicelendirilmesi için, BrdU ile işaretlenmiş DNA bir seri seyreltme, başlangıçta amacıyla yapılmalıdır yuvası blot ve anti-BrdU antikoru kullanılarak Batı analizine uygulanmalıdır algılama doğrusal aralığını belirler. Chip DNA konsantrasyonu belirlenmesi ve Giriş DNA BrdU ile işaretlenmiş DNA miktarı, Western blot saptanması lineer aralığında olmasını sağlamak için bir olanak sağlar. Örneğin, 50 olmak giriş DNA 12.5 ng ng tespitPilot deneyde doğrusal aralık. Çip sample konsantrasyonu çok yüksek ise de, bu yuva yapmadan önce yonga DNA seyreltilmesi zorunludur. Bu tekniğin bir sınırlama kromatin kesme etkinliği bağlıdır çözünürlüğü vardır. Sonikasyon ile kromatin kesme, belirli bir protein veya yeni sentezlenmiş DNA olan modifiye edilmiş bir formu yakınlığını tespit eder. Geçmişte, memeli hücrelerinde DNA replikasyonu sırasında kromatin ve kromatin değiştirici enzimler değişikliklerin Çalışma, uygun teknikleri olmayışı nedeniyle adres için önemli bir sorun olarak kaldı. Ayrıca, G1 fazında Hdac1,2 boş hücreler tutuklanmasından bu yana, bu S-faz içinde Hdac1,2 işlevlerini incelemek için zordu. Çalışmamızda, S-faz ve yeni BrdU-ChIP-S içinde faaliyetlerini engellemek için ilk sınıfının seçici inhibitörlerinin bir arada kullanarak DNA replikasyonu sırasında bu iki HDAC&#39;lerin fonksiyonları gösterdilot-Batı tekniği. Gelecekte, bu teknik, aynı zamanda çatal histon modifikasyonları ve kromatin modifiye enzim okuyan ek olarak durmuş çatal DNA hasar cevabı ve DNA onarım proteinlerin dinamiklerini incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik, fare NIH3T3 hücrelerinin ile sınırlı değildir. Bu teknik, başarılı bir enzim ya da proteinlerin diğer inhibitörleri, çoğaltma çatal DNA replikasyonunu ve çoğaltma stres ile indüklenen kromatin değişiklikleri etkiler araştırmak amacıyla diğer hücre çizgileri de kullanılabilir.

Kusurlu DNA onarım ve / veya DNA replikasyon hücre ölümünü tetikleyebilir genom istikrarsızlık, önemli bir nedeni vardır. Tek onarılmamış çift iplikli sonu hücre ölümüne neden 1 için yeterlidir. Kromatin organizasyonu geçici, hem çoğaltma sırasında değişmiş ve 2,3 onarmak ve bu süreçlerin bütünlüğünü genom için bir tehdit neden olacaktır sırasında epigenetik bilgileri korumak için başarısızlık olduğunu. HDAC3 veya HDAC1,2 fonksiyon kaybı genotoksik strese (DNA hasarının) ve hücre ölümüne yol açan 4-9 S-faz ilerlemesi, DNA replikasyonu ve onarımı engellemektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde replikasyon, onarım ve kromatin bozabilir ve bu da büyümeyi durdurur ve hızlı bir şekilde büyüyen bir kanser hücrelerinde seçici hücre ölümünü teşvik DNA hasarına neden seçici HDAC inhibitörlerinin kullanımı pratik bir stratejidir. DNA replikasyonu sırasında, kromatin hızla sökülüp ve daha sonra DNA çoğaltılması takip yeniden birleştirilen. Yeni synthesized histon H4 kromatinden üzerine K5 ve K12 kalıntılarının (H4K5K12ac) ve aşağıdaki birikimi asetillenebilir edilir hızla histon deasetilazların (HDAC&#39;ler) 10,11 tarafından deasetile edilir. Histon deasetilasyonu ile oluşmakta olan kromatin bütünlüğünü korumak için hücrelerin hatası da, DNA hasarı ve hücre ölümüne neden olabilir çatal çöküşü, yol açabilir. Biz son zamanlarda HDAC1,2 selektif inhibisyonu artırır histon asetilasyonu (H4K5ac, H4K12ac ve H4K16ac) ve azaltılmış çoğaltma çatal ilerlemesi ile ilişkilidir doğmakta kromatin üzerinde SMARCA5 kromatin remodeler aktivitesini inhibe olduğunu gösterdi çatal çöküşü artmış ve çoğaltma strese bağlı DNA hasarı 6 arttı . Bu nedenle, HDAC inhibitörü tedavisi hızla bu hücrelerin döngüsü olarak, kanser hücrelerinde çok hızlı bir şekilde, DNA hasarı ve ölümü tetikleyebilir ve S-fazı yoluyla birçok kez geçmek için oluşmakta olan kromatin yapısını değiştirebilir. Bu HDAC&#39;ler histon asetilasyonunu ve protein Bindi düzenleyen nasıl işlediğini anlamak önemlidirng memeli hücrelerinde DNA replikasyonu korumak için. Kantitatif histon asetilasyonu ve DNA replikasyonu sırasında doğmakta olan DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını ölçmek için, bir modifiye ChIP tahlil BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği denilen geliştirmiştir. Bir yarık kullanılarak zar üzerine arzu edilen bir protein ya da histon modifikasyonu kromatin, immüno-çökeltme (chip) takiben, henüz olgunlaşmamış DNA miktarı BrdU etiketli yonga DNA batı analizi kullanılarak tespit edilebilir çips numunesi olarak (timidin analoğu BrdU ile işaretlenmiş) transfer Leke aygıt. Bu tekniği kullanarak, H4K16ac (kromatin paket yer alan bir marka) ve ISWI aile üyesi SMARCA5 (kromatin SWI / SNF ilişkili matris ile ilişkili aktin bağımlı regülatör) kromatin remodeler S-fazı hücrelerinde doğmakta olan DNA ile ilişkili olduğunu göstermiştir 6. Biz de doğmakta olan H4K16ac işareti DNA replikasyonu sırasında 6 HDAC1,2 tarafından deasetile olduğunu gördük. H4K16ac inhibeISWI aile üyesi SMARCA5 12 kromatin remodeler aktivitesi. Bu nedenle, BrdU-CHIP-Slot-Batı tekniği kullanılarak, DNA replikasyonu sırasında kromatin remodeling düzenlenmesinde HDAC1,2 işlevlerini bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, BrdU-çip-Slot Blot tekniği kantitatif oluşmakta olan DNA&#39;ya bağlanan proteinlerin ya da bunların post-translasyonel modifikasyonlar, birleşme ve ayrılma dinamiklerini ölçmek için güçlü bir yaklaşım.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

Histon deasetilaz 1 ve 2 (HDAC1,2) DNA replikasyonunun bölgelerine yerleşemez. Önceki bir çalışmada, seçici bir inhibitörü ve genetik demonte sistemi kullanılmasıyla, çoğalma çatala ilerlemesi ve memeli hücrelerinde doğmakta olan kromatin bakım HDAC1,2 için yeni fonksiyonlar göstermiştir. Ayrıca, yuva leke ile brom-deoksiüridin (BrdU) -etiketli DNA kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve Batı nicel doğmakta olan DNA ile ilişkili proteinler veya histon modifikasyonu ölçmek için analizler bir BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği kullanılmıştır. Aktif bölünen hücreler HDAC1,2 selektif inhibitörü ile tedavi edilebilen veya HDAC1 ve HDAC2 karşı siRNA&#39;lar transfekte edilmiş ve daha sonra, yeni sentezlenmiş DNA, timidin analog bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir edildi. Önemli bir hücre döngüsü tutuklama veya apoptozis varken BrdU etiketleme nedeniyle HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybına bağlı olarak bir zaman noktasında yapılmıştır. Aşağıdakı lBrdU histon asetilasyonu bakışı, Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) veya kromatin remodeler hücrelerin Abeling spesifik antikorlar ile gerçekleştirildi. BrdU etiketli giriş DNA çökeltilmiş (veya chiped) DNA daha sonra slot blot tekniği kullanılarak bir membran üzerine noktalar ve UV kullanılarak immobilize edildi. Her yuvaya doğmakta olan DNA miktarı, kantitatif bir anti-BrdU antikoru ile Western analizi kullanılarak değerlendirildi. Yeni sentezlenen DNA ile ilişkili histon asetilasyonu işaretleri ve kromatin Remodeler seviyeleri üzerindeki HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybı etkisinin daha sonra kontrol numunelerine ile muamele edilmiş örneklerde elde edilen BrdU-yongası sinyali normalize ederek belirlenir.

HDAC1,2 seçici önleyicileri özgüllüğünü belirlemek için, Hdac1,2 FL / FL ve HDAC3 FL / FL fibrosarkom hücreleri kullanıldı. Adenovirüs içeren Cre rekombinaz (Cre Ad-) bu hücrelerde Hdac1,2 ve HDAC3 silmek için kullanılmıştır. Hdac1,2 FL / FL ardından Ad-Cre enfeksiyonu Hücreler, H4K5ac sağlam bir artış gözlenmiştir. 233 ya da 898 ile Hdac1,2 knockout hücre tedavisi 233 ve 898, bu hücrelerde Hdac1,2 olup HDAC3 önlediğini teyit H4K5ac herhangi daha bir artış yoktu. Bunun aksine, HDAC3 nakavt hücrelere 233 ya da 898 eklenmesi Dolayısıyla bağlı Hdac1,2 inhibisyonu ve 3 sonucu H4K5ac düzeyde bir katkı maddesi etkisinden HDAC3 nakavt hücrelerde görülen artış ile karşılaştırıldığında H4K5ac önemli bir artış ile sonuçlanmıştır 233 ve 898 HDAC1, 2 selektif inhibitörleri bulunmaktadır. Bu sonuçlar gösterilmektedirŞekil 1. HeLa hücrelerinde doğmakta olan DNA üzerindeki PCNA yükleme kinetik bakmak için BrdU ChIP-Slot tekniği, BrdU-darbe kovalamaca analizi yapılmıştır doğrulamak için. Bizim sonuçlarımız doğmakta olan DNA ile PCNA dernek 15 dakika içinde hızla ortaya çıkar ve daha önce yayınlanan sonuçlarla 13 ile anlaşarak 30 dakika kovalamaca sonra kaybolur gösterdi. Bu sonuçlar, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. BrdU-H4K16ac ChIP-Slot Batı tekniği HDAC1,2 fonksiyonunun yokluğunda doğmakta olan DNA ile ilişkili H4K16ac miktarını belirlemek için kullanılmıştır. Tavşan IgG kontrol (Şekiller 3A ve 3B) ile karşılaştırıldığında doğmakta olan DNA ile ilişkili H4K16ac bir sağlam bir zenginleşme gözlendi. HDAC1,2 faaliyetleri veya Hdac1,2 demonte inhibisyonu, aşağıdaki yeni oluşan DNA ile ilişkili H4K16ac artış Şekil 3C &#39;de gösterilmiştir </strong&gt; 3D ve 3E. Oluşmakta olan DNA üzerinde SMARCA5 kromatin Remodeler seviyesi BrdU-SMARCA5 ChIP Yuvalı Batı tekniği kullanılarak saptanmıştır. Sonuçlarımız, memeli hücrelerinde doğmakta olan DNA ile bu SMARCA5 ortakları göstermiştir. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, ek, HDAC1,2 inhibisyon veya Hdac1,2 demonte olgunlaşmamış DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını değişmedi. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig1.jpg" /> HDAC1,2 selektif inhibitörlerinin spesifiteye Şekil 1. teyidi. 898 ya da Ad-Cre enfeksiyonu ve tedaviden sonra HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL ve HDAC3 FL / FL fibrosarkoma hücrelerinden hazırlanan bütün hücre lizatlarının Batı analizi233. Hücreler 3 uM 898 ya da 48 saat Ad-Cre enfeksiyon sonrası 233 24 için saat ile muamele edilmiştir. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53647/53647fig2.jpg" /> Şekil HeLa hücrelerinde yeni oluşan DNA PCNA Association 2. Dinamik. HeLa hücreleri 30 dakika boyunca bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir. Hücreler daha sonra zaman belirtilen süreler (Chase) için BrdU olmayan unincorporated BrdU ve ortamında kültürlenmiştir çıkarmak için yıkandı. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) anti-proliferasyon hücre çekirdeği antijeni (PCNA) antikoru ile gerçekleştirilmiştir. Giriş DNA ve PCNA ile ilişkili mevcut BrdU etiketli DNA, bir anti-brd kullanılarak slot blot analizinde değerlendirildiŞekil 2&#39;de görüldüğü gibi U antikor. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53647/53647fig3.jpg" /> Histone Deacetylase 1 ve yeni oluşan DNA. (AB) bromodeoksiüridin (BrdU) darbe peşinde 2 artırır H4K16ac Şekil 3. kaybı, belirtilen zaman noktalarında oluşmakta olan DNA ile H4K16ac ilişkisini belirlemek için, HeLa ve, NIH3T3 hücrelerinde uygulandı. (CD) NIH3T3 hücreleri DMSO veya 24 saat boyunca, bir HDAC1,2-seçici bir inhibitör (898 veya 233) ile tedavi edildi. (E) NIH3T3 hücreleri, ya olmayan hedefleme (NT) veya Hdac1,2 (H12) siRNA ile transfekte edilmiştir. (C - E) alınan hücreler BrdU ile etiketlenir ve kullanılanAnti-H4K16ac ile ChIP için yuva lekeleme ile izledi. Membran, anti-BrdU antikoru ile problanmıştır. Sayılar benekli ChIP DNA yüksek ve orta hacimli ortalama BrdU sinyalinin Resim J kantitatif göstermek. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53647/53647fig4.jpg" /> Şekil 4. Nascent DNA SMARCA5 Associates. HDAC1,2 fonksiyon kaybı aşağıdaki olgunlaşmamış kromatin üzerinde SMARCA5 miktarı gösterilir. NIH3T3 hücreleri, ya bir HDAC1,2 selektif inhibitörü (898) ile muamele edilir ya da (NT) olmayan hedefleme ya Hdac1,2 (H12) siRNA ile transfekte edilmiştir. Hücreler, anti-SMARCA5 veya tavşan IgG&#39;si ile yukarıda belirtilen tedavilerde ve yonga, aşağıdaki BrdU (negatif c ile etiketlenmişontrol) gerçekleştirildi. Yonga DNA artan miktarlar delikli benek tespit edildi ve zar, anti-BrdU antikoru ile problanmıştır. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique at JoVE.com

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Görüntüleme.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

Video: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Genetik

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Biyokimya

Her Yerde Bulunan, SUMOile Edilmiş ve ADP-Ribosile Edilmiş DNA-Protein Çapraz Bağlarının Ölçülmesi

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Yazar Spotlight: DNA Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Biyoloji

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde