Die Arbeit in diesem Manuskript wurde aus den Mitteln Institut für Radioonkologie und Huntsman Cancer Institute und dem National Institute of Health Zuschuss (R01-CA188520) bis SB unterstützt. Ich danke Danielle Johnson und Steven Bennett in meinem Labor zur Demonstration des Protokolls und erklärt seine Vorteile. Ich danke Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) für kritische Anmerkungen zum Manuskript.

1. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) folgenden BrdU Labeling <ol><li> Kultur NIH3T3-Zellen in Gegenwart entweder von DMSO oder HDAC1,2-selektive Inhibitoren, wie zuvor. 6 beschrieben </li><li> Nach der Behandlung mit DMSO oder HDAC1,2 selektive Inhibitoren, fügen BrdU zu den Zellen in einem sterilen Gewebekulturhaube. Inkubieren 2 x 10 6 NIH3T3-Zellen in 10 ml NIH3T3 Medien mit 20 &amp; mgr; M Endkonzentration von Bromdesoxyuridin (BrdU) für 60 Minuten in einem sterilen 37 ° C Gewebekulturinkubator plattiert. </li><li> Vernetzungsintrazellulären Proteinen, DNA durch Zugabe von Formaldehyd direkt in das Kulturmedium in einer Endkonzentration von 1%. Inkubieren 2 x 10 6 NIH3T3-Zellen mit Formaldehyd bei RT für 10 min auf einem Schüttler. </li><li> Quenche die Vernetzung durch die Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM. Inkubation bei RT für 5 min auf einem Schüttler. </li><li> Die Datenträgern und sammle die Zellen in PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Spin cells bei 956 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Zweimaliges Waschen des Zellpellets mit eiskaltem PBS. Entfernen PBS aus dem Röhrchen. Bewahren Sie die vernetzte Zellpellet ohne PBS (der Überstand) bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Vorbereitung des Lysats aus dem vernetzten Zellpellet durch Zugabe von 500 ul FA140-Puffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 und 0,1% Natriumdesoxycholat) mit Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt. </li><li> Scheren die Chromatin durch Beschallung der Proben fünfmal bei 35% Leistung und mit einer 15 Sek Puls, 0,9 sec an und 0,1 s aus Einstellung. Halten die Röhrchen auf Eis nach jeder Runde der Beschallung zu einer Erwärmung der Proben zu vermeiden. <ol><li> Überprüfen Sie die Scher auf einem DNA-Gel als die Schereffizienz wird zwischen verschiedenen Beschaller variieren. Beschallung überprüfen, Reverse Vernetzung durch Zugabe von NaCl auf eine Konzentration von 0,16 M und führen Sie die Schritte 1.17.1. - 1.22. Run eluiert 10 ul DNA auf einem 1,5% Agarose-Gel, um zu überprüfen, ob die Scher istzwischen 300 - 700 bp mit einer durchschnittlichen Intensität von 500 bp. </li></ol></li><li> Folgende Beschallung Zentrifuge Proben für 10 min bei 17.949 × g bei 4 ° C und den Überstand in ein neues Röhrchen. <ol><li> Zuführen Proteinschätzung unter Verwendung des kommerziellen Protein-Assay-Kit nach Herstellerprotokoll. Verwenden Sie die gleiche Menge Lysat für die Chip-Steuerung und experimentellen Proben. Im Allgemeinen verwenden 1 mg Gesamt-Lysat pro Chip Reaktion. </li></ol></li><li> Vorbereitung 50% igen Aufschlämmung von Protein-A-Agarose unter Verwendung FA140 Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail. Hinzufügen von 1/10 Volumen der Protease-Inhibitor-Cocktail. Berechnen des Volumens der Kügelchen benötigt, basierend auf der Anzahl von Proben insgesamt. <ol><li> Wash Protein A-Agarose-Kügelchen mit FA140 Puffer zweimal, um den Speicherpuffer zu entfernen und dasselbe Volumen an FA140 Puffer an die Perlen zu 50% Aufschlämmung herzustellen. </li><li> Auf Proteine, die unspezifisch an die Beads zu entfernen, Zugabe von 50 ul 50% igen Aufschlämmung von Protein-A-Agarose undcubate die Proben bei 4 ° C mit konstanter End-Over-End-Rotation in einem Drehspießmischer für 30 min. </li></ol></li><li> Dreh die Proben bei 956 × g bei 4 ° C für eine Minute. Die überstehende Flüssigkeit und führen Immunpräzipitation entweder durch Zugabe von 8 ul H4K16ac Antikörper oder 5 ul (5 ug) von 1 mg / ml SMARCA5 Antikörper zu dem Überstand. Inkubieren bei 4 ° CO / N mit konstanter End-over-End-Rotation in einem Drehspießmischer. </li><li> Speichern 1/10 des Extraktes für &#39;Eingangskontrolle und der Einstellung als beiseite bei -20 ° C. Die Eingangs muss rückwärts zusammen mit der IP-Proben vernetzt sein. </li><li> Verwenden gleiche Menge an Kaninchen-IgG (5 ul 1 mg / ml) als Negativkontrolle Immunpräzipitation Probe. </li><li> Am nächsten Tag werden 50 &amp; mgr; l 50% Protein A-Agarose-Aufschlämmung in dem Extrakt und Inkubation für 1 h bei 4 ° C unter Rotation. </li><li> Pellet Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 956 × g für 2 min bei 4 ° C, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und wash die Perlen mit den folgenden Puffern sequentiell. In Puffermittel, fügen Sie Protease-Inhibitoren Recht vor Gebrauch. <ol><li> Wäscht mit wenig Salz Immunkomplex-Waschpuffer (FA140; Endkonzentration von 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 und 0,1% Natriumdesoxycholat) zum 5 min bei 4 ° C mit end-over-end-Rotation. </li><li> Wäscht mit High Salt Immunkomplex-Waschpuffer (FA500; Endkonzentration von 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 und 0,1% Natriumdesoxycholat) zum 5 min bei 4 ° C mit end-over-end-Rotation. </li><li> Mit LiCl Immunkomplex-Waschpuffer (Endkonzentration 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 und 0,5% Natriumdesoxycholat) für 5 min bei 4 ° C mit end-over-end-Rotation zu waschen. </li></ol></li><li> Folgende Waschschritte, wie oben beschrieben, 200 &amp; mgr; l Elutionslösung (Endkonzentration von 1% SDS und 100 mM Natriumbicarbonat) und INCUBATe bei RT für 15 Minuten mit End-over-End-Rotation bei RT. </li><li> Drehen Sie die Proben bei 956 × g bei RT und übertragen Sie das Eluat in ein neues 1,5-ml-Tube. Wiederholen Sie Schritt 1.15 mit zusätzlichen 200 &amp; mgr; l Elutionslösung. </li><li> Zu 400 ul des Eluats, fügen NaCl auf eine Konzentration von 0,16 M und gut mischen. <ol><li> Darüber hinaus fügen Sie 400 ul Elutionslösung bis 10 &amp; mgr; l-Eingang, die Aufhebung wurde (Schritt 1.11) und fügen NaCl auf eine Konzentration von 0,16 M zu vernetzen Eingangsabtastwerten und umzukehren. Reverse Vernetzung der Proben durch Inkubation in 65 ° C Wasserbad für 5 Stunden. </li></ol></li><li> 1 ml 100% EtOH zu dem Umkehrnetzten Eluat. Gut mischen und Inkubation bei -80 ° C für 2-3 Stunden oder bei -20 ° CO / N. Drehen Sie die Proben bei 17.949 · g für 15 Minuten und entsorgen Ethanol. </li><li> Zugabe von 800 ul 70% Ethanol, um das Pellet zu waschen. Schleudern bei 17.949 xg für 15 min bei 4 ° C und entsorgen Ethanol. Spin kurz um das restliche Ethanol zu entfernen. Der Luft trocknen die Proben bei 37 ° C für 10 min, um restliche Ethanol zu entfernen. </li><li> Man löst DNA in 90 ul RNase und DNase frei Wasser und fügen Sie 2 ul 10 mg / ml RNase bei einer 0,2 mg / ml Endkonzentration. Inkubieren bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. </li><li> Zugabe von 10 ul 10fach Proteinase K-Puffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA, pH 8,0, 5% SDS). Gut mischen und fügen 1 ul Proteinase K Inkubation bei 42 ° C für 1 Stunde. </li><li> Reinige Eingang und Chip-DNA unter Verwendung von kommerziellen PCR-Reinigungs-Kits nach Herstellerprotokoll und Eluieren der DNA in 50 ul Wasser. DNA bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 2. Slot-Blot-Analyse von Chip-DNA <ol><li> Messung der Ausbeute von Eingangs- und ChIP DNA in 50 ul Wasser eluiert, wie in Schritt 1.22 unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 280 nm gemäß dem Protokoll des Herstellers beschrieben. </li><li> Nehmen gleiche Volumina (50 ul) von Eingabe- oder immunpräzipitierten DNA, die innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises sind. <ol><li> Zum Beispiel, wenn EingangsDNA-Ausbeute beträgt 1,5 ng / &amp; mgr; l, dann nehmen Sie 30 ul (oder 45 ng Gesamt-DNA) und stellen Sie Volumen auf 50 ul mit Wasser. Für Faktor-Chip, nehmen Sie die gesamte 50 ul Eluat aus Schritt 2.1 und fahren Sie mit Schritt 2.3. </li></ol></li><li> Denaturierung 50 ul Eingang oder immunpräzipitierten DNA durch Zugabe von 2,5 Volumina 0,4 N NaOH, Vortexen und Zentrifuge 956 × g für 10 sec, und Inkubation bei RT für 30 min. </li><li> Neutralisierung der denaturierten DNA durch Zugabe von 175 ul 1 M Tris-HCl, pH 6,8, Vortex-Zentrifuge 956 × g für 10 sec und legen Sie die Proben auf Eis. </li><li> Vorbereitung einer Reihenverdünnung von Eingangs- und immunpräzipitierten DNA für die Slot-Blot-Test, wie nachstehend beschrieben. <ol><li> Folgen Schritte 2,3-2,4 um eine Gesamtprobenvolumen von 350 ul zu erhalten (das heißt, 50 &amp; mgr; Input / ChIP DNA, 125 &amp; mgr; l 0,4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCl, pH 6,8). Hinweis: Für das Beispiel oben angegeben, werden 45 ng Eingangs DNA am Ende als 0.129 ng / ul. </li><li> Für die Eingabe DNA, zu kennzeichnen drei Rohrs wie 100, 50 und 25 und 100 ul, 50 ul und 25 ul des denaturierten und neutralisierte DNA Probe. Machen Sie das Endvolumen auf 100 ul mit Nuklease-freies Wasser. Für Chip DNA, Etiketten drei Rohre 200, 100 und 50 und 200 ul, 100 ul und 50 ul des denaturierten und neutralisierte DNA Probe. Machen Endvolumen auf 200 ul mit Nuclease freies Wasser. </li></ol></li><li> Schneiden Sie die Membran auf die Größe des Slot-Blot-Apparatur. Vorbefeuchtende die Membran und Löscharbeiten in 20x SSC vor und vor der Zugabe von DNA. Fügt sie in die Slot Blot Vorrichtung gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Pipettieren von DNA aus Schritt 2.5.2 in die entsprechenden Slots. Vakuum ziehen langsam, um die DNA auf die Zeta-Probe-Membran zu ziehen. Stoppen Vakuum nach alle Proben durch die Apparatur geleitet. <ol><li> Demontieren Sie das Gerät sofort zu immobilisieren, die DNA auf die Membran unter Verwendung eines UV-Vernetzer. Haben Sie die DNA-Seite nach oben in der UV-Vernetzer und verwenden Sie die Au-tocrosslink Einstellung im Vernetzer. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Detect BrdU auf der Slot-Blot, indem Western-Blot. <ol><li> Blockieren der Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch in PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST) für 1 h bei RT, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an die Membran zu verhindern. </li><li> Hinzufügen primären anti-BrdU-Antikörper (1: 500 Verdünnung) in 1% fettfreier Trockenmilch in PBST verdünnt und Inkubieren des Blots mit dem primären Antikörper während 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Nach der primären Antikörper-Inkubation Waschen der Membran mit PBST dreimal. </li><li> Hinzufügen HRP-konjugiertem anti-Maus Sekundär-Antikörper auf dem Blot (1: 5000 Verdünnung) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Std. Nach dem sekundären Antikörper Inkubation die Membran mit PBST dreimal. HINWEIS: genügend Volumen der Antikörper an die Membran während der primären und sekundären Antikörper-Inkubationen vollständig bedecken. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die ECL-Mix und es dem Blot ac hinzufügenchend dem Protokoll des Herstellers. Inkubieren der Membran mit ECL Mischung für 5 min bei RT. <ol><li> Legen Sie die Membran in einer Röntgenkassette, setzen die Membran an dem Röntgenfilm und die Entwicklung der Blot unter Verwendung des Protokolls des Herstellers. </li><li> Zu quantifizieren, die für die Eingabe und Mit Chip DNA nach dem Scannen der Blots unter Verwendung der Bild J Software gemäß dem Protokoll des Herstellers erhaltene Signal. Zur Quantifizierung Verwenden des Signals, das innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises, um die Genauigkeit der Messung zu gewährleisten. </li></ol></li></ol>

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	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. 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I have no competing financial interests.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll ist eine relativ schnelle Methode, um das Vorhandensein von Proteinen oder deren posttranslational modifizierte Formen auf neu repliziert oder im Entstehen begriffenen DNA zu demonstrieren. Zusätzlich ermöglicht diese Technik eine um die Assoziations Dissoziationskinetik eines Proteins oder seiner modifizierten Form mit naszierenden DNA zu messen. Diese Technik ist komplementär zu der eleganten iPOND Technik 13. Im iPOND Technologie wird neu synthetisierte DNA mit Essig Desoxyuridin (EDU) markiert. Ein Biotin-Konjugat wird dann auf EdU mit der Klick-Chemie aufgenommen. Biotin-markierten Entstehen begriffenen DNA wird dann mit Streptavidin-Kügelchen und Co-Reinigung von Proteinen mittels Western Blot nachgewiesen immunpräzipitiert. Auf der anderen Seite, im BrdU-chip-Slot-westliche Technik, ein Protein oder seiner modifizierten Form mit naszierenden DNA verknüpft ist unter Verwendung von Protein-spezifischen oder modifizierter Form spezifische Antikörper und der Menge an BrdU-markierten naszierenden DNA, um das gebundene immun Protein then quantitativ unter Verwendung eines Anti-BrdU-Antikörper bestimmt durch Slot-Western-Blot. Es gibt kritische Schritte in diesem Protokoll, das besondere Aufmerksamkeit erfordert. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass der Antikörper von Interesse funktioniert gut in Standard-Chip Assays mit einem hohen Wirkungsgrad. Es ist wichtig, um die Wirksamkeit eines Antikörpers in der Chip-Assays durch quantitative PCR vor der Durchführung der BrdU-CHIP-Slot-West-Assay zu testen. Um für die Quantifizierung des BrdU-CHIP-Slot-westliche Technik genau zu sein, sollte ein serieller Verdünnung der BrdU-markierten DNA auf Slot-Blot und Western-Analyse unter Verwendung des Anti-BrdU-Antikörper eingesetzt werden, sollten zunächst, um durchgeführt werden kann Bestimmung des linearen Bereichs des Nachweises. Bestimmung der DNA-Konzentration von Chip und Input-DNA ermöglicht es, sicherzustellen, dass die Menge an BrdU-markierter DNA ist innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises in Western Blots. Zum Beispiel haben wir festgestellt 50 ng bis 12,5 ng Eingangs DNA in seinder lineare Bereich in unserer Pilotversuch. Auch, wenn die Konzentration der Chip-Proben sehr hoch ist, ist es zwingend notwendig, um die Chip-DNA vor der Durchführung Schlitz zu verdünnen. Der Nachteil dieser Technik ist die Auflösung, die abhängig von der Effizienz der Chromatin Scherung. Das Abscheren von Chromatin durch Beschallung bestimmt die Nähe eines bestimmten Proteins oder seiner modifizierten Form in die neu synthetisierte DNA. In der Vergangenheit war die Untersuchung von Veränderungen der Chromatinstruktur und chromatinmodifizierende Enzyme während der DNA-Replikation in Säugetierzellen blieb eine schwierige Frage aufgrund der Nichtverfügbarkeit geeigneter Techniken adressieren. Da Hdac1,2-null-Zellen Arrest in der G1-Phase, war es schwierig, Funktionen zur Hdac1,2 in S-Phase zu untersuchen. In unserer Studie während der DNA-Replikation zeigten wir Funktionen für diese beiden HDACs mit einer Kombination aus First-in-Class-selektive Inhibitoren, ihre Aktivitäten in S-Phase und dem Roman BrdU-chip-S hemmenlot-Western-Technik. In Zukunft könnte diese Technik auch verwendet werden, um die Dynamik der die DNA-Reparatur und DNA-Reparatur-Proteine ​​im Stillstand Gabel in Verbindung mit der Untersuchung der Histon-Modifikationen und Chromatin-modifizierendes Enzym an der Gabelung zu untersuchen. Darüber hinaus ist diese Technik nicht auf die Maus NIH3T3 Zellen. Dieses Verfahren kann erfolgreich in anderen Zelllinien, um zu untersuchen, wie andere Inhibitoren von Enzymen oder Proteinen beeinflussen DNA-Replikation und Replikation spannungsinduzierte Chromatin Änderungen an der Replikationsgabel eingesetzt werden.

Defekten DNA-Reparatur und / oder die DNA-Replikation sind eine Hauptursache von Genominstabilität, die Zelltod auslösen können. Eine einzige nicht reparierten Doppelstrangbruch reicht aus, um den Zelltod 1 verursachen. Chromatinorganisation vorübergehend sowohl während der Replikation Veränderung und Reparatur 2,3, und die Nicht epigenetische Information zu erhalten während dieser Prozesse werden in einer Bedrohung führen, um die Integrität Genom. Verlust von HDAC3 oder HDAC1,2 Funktion behindert S-Phasen-Progression, die DNA-Replikation und Reparatur, die zu genotoxischen Stress (DNA-Schaden) und Zelltod 4-9. Es ist daher eine praktische Strategie zur selektiven HDAC-Inhibitoren zu verwenden, um die Replikation, Reparatur und Chromatin in Krebszellen zu stören und DNA-Schäden, die wiederum das Wachstum zu stoppen und Zelltod selektiv in schnell wachsenden Krebszellen verursachen. Während der DNA-Replikation, wird Chromatin schnell zerlegt und wieder zusammengebaut folgende DNA-Vervielfältigung. Neu synthesized Histon H4 an K5 und K12 Reste (H4K5K12ac) und im Anschluss an die Abscheidung auf Chromatin acetyliert sind, werden sie schnell durch Histon-Deacetylasen (HDACs) 10,11 deacetyliert. Versagen der Zellen, entstehende Chromatin Integrität durch Histondeacetylierung pflegen können, um Gabelzusammenbruchs, die wiederum in der DNA-Schädigung und Zelltod führen führen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass selektive Hemmung der Histon-Acetylierung erhöht HDAC1,2 (H4K5ac, H4K12ac und H4K16ac) und hemmt SMARCA5 Chromatin remodeler aktiv am Entstehen begriffenen Chromatin, die mit reduzierten Replikationsgabel Progression korreliert, erhöhte Gabel Zusammenbruch und erhöhte Replikation Stress-induzierten DNA-Schäden 6 . Somit kann HDAC-Hemmer naszierenden Chromatinstruktur zu verändern, um DNA-Schädigung und Tod sehr schnell in Krebszellen schnell auslösen, da diese Zellen Zyklus und geben viele Male durch die S-Phase. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie HDACs dienen, Histonacetylierung und Protein bindi regulierenng an DNA-Replikation in Säugetierzellen zu erhalten. Zur quantitativen Messung der Menge an Histon-Acetylierung und SMARCA5 Chromatin remodeler mit naszierenden DNA während der DNA-Replikation verbunden ist, entwickelten wir eine modifizierte ChIP Assay genannt BrdU-chip-Slot-westliche Technik. Folgende Chromatinimmunpräzipitation (Chip) eines gewünschten Proteins oder Histonmodifikation die Menge an naszierenden DNA (markiert mit Thymidin-Analogon, BrdU) in die Chipprobe kann unter Verwendung von Western-Analyse von BrdU-markierten ChIP DNA nachgewiesen werden unter Verwendung eines Schlitzes übertragen auf eine Membran Blot-Apparatur. Mit dieser Technik haben wir gezeigt, dass H4K16ac (eine Marke in Chromatin Verpackungen beteiligt) und die ISWI Familienmitglied SMARCA5 (SWI / SNF bezogene Matrix-assoziierten Aktin-abhängige Regel von Chromatin) Chromatin remodeler sind mit im Entstehen begriffenen DNA in die S-Phase Zellen assoziiert 6. Wir fanden auch, dass die im Entstehen begriffenen H4K16ac Markierung durch HDAC1,2 während der DNA-Replikation 6 deacetyliert. H4K16ac hemmtChromatin remodeler Aktivität des ISWI Familienmitglied SMARCA5 12. Daher mit der BrdU-CHIP-Slot-westliche Technik konnten wir die Funktionen für HDAC1,2 bei der Regulierung der Chromatin-Remodeling während der DNA-Replikation zu verbinden. Daher ist die BrdU-chip-Slot-Western Blot Technik ein leistungsfähiges Konzept für die Assoziation und Dissoziation Dynamik von Proteinen oder deren post-translationale Modifikationen, die im Entstehen begriffenen DNA gebunden sind, quantitativ zu messen.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

Histondeacetylasen 1 und 2 (HDAC1,2) lokalisieren zu den Stellen der DNA-Replikation. In der früheren Studie, unter Verwendung eines selektiven Inhibitors und eines genetischen Zuschlagssystem zeigten wir neuartige Funktionen HDAC1,2 in Replikationsgabel Progression und naszierenden Chromatin Wartung in Säugerzellen. Zusätzlich verwendeten wir eine BrdU-chip-Slot-westliche Technik, die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) von Brom-Desoxyuridin (BrdU) -markierten DNA kombiniert mit Slot-Blot und Western-Analysen zur quantitativen Messung von Proteinen oder Histon-Modifikation mit naszierenden DNA verbunden. Sich aktiv teilenden Zellen wurden mit HDAC1,2 selektiver Inhibitor behandelt oder mit siRNAs gegen HDAC1 und HDAC2 transfiziert und dann wurde neu synthetisierte DNA mit dem Thymidin analoge Bromdesoxyuridin (BrdU) gekennzeichnet. Die BrdU-Markierung wurde zu einem Zeitpunkt durch den Verlust von HDAC1,2 Funktionen gemacht, wenn es keinen signifikanten Zellzyklusarrest oder Apoptose. Nach lAbeling von Zellen mit BrdU, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) der Histon-Acetylierung Marken oder das Chromatin-remodeler wurde mit spezifischen Antikörpern durchgeführt wird. BrdU-markierte DNA-Eingang und der immunpräzipitiert (oder Mit Chip) DNA wurde dann auf eine Membran mit der Slot Blot Technik aufgetragen und immobilisiert durch UV. Die Menge an naszierenden DNA in jedem Schlitz wurde dann mit Hilfe der Western-Analyse mit einem anti-BrdU-Antikörpers bewertet. Die Wirkung des Verlustes HDAC1,2 Funktionen auf der Ebene der neu synthetisierten DNA-assoziierten Histonacetylierung Markierungen und Chromatin remodeler wurde dann durch Normalisieren der BrdU-Chip-Signal von der behandelten Proben mit den Kontrollproben erhalten wurde, bestimmt.

Um die Spezifität der HDAC1,2-selektive Inhibitoren zu bestimmen, wurden Hdac1,2 FL / FL und HDAC3 FL / FL-Fibrosarkom-Zellen verwendet. Adenovirus enthaltenden Cre-Rekombinase (Ad-Cre) wurde verwendet, um Hdac1,2 und HDAC3 in diesen Zellen zu löschen. Nach der Ad-Cre Infektion Hdac1,2 FL / FL Zellen, eine stabile Zunahme H4K5ac beobachtet. Behandlung Hdac1,2 Knockout-Zellen mit 233 oder 898 nicht in keiner weiteren Steigerung H4K5ac bestätigt, dass 233 und 898 hemmen Hdac1,2 und nicht HDAC3 in diesen Zellen führt. Demgegenüber Zugabe von 233 oder 898 bis HDAC3 Knockout-Zellen führte zu einem signifikanten Anstieg in H4K5ac Vergleich zu dem Anstieg in HDAC3 Knockout-Zellen beobachtet aufgrund eines additiven Effekt auf H4K5ac Werten aufgrund der Hemmung der Hdac1,2 und 3. Somit 233 und 898 sind HDAC1, 2-selektive Inhibitoren. Diese Ergebnisse sind inAbbildung 1. So überprüfen Sie die BrdU-chip-Slot-Technik, BrdU-Puls-Chase-Analyse wurde durchgeführt, um zu der Kinetik der PCNA Belastung für die entstehende DNA in HeLa-Zellen zu suchen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass PCNA Verbindung mit im Entstehen begriffenen DNA erfolgt schnell innerhalb von 15 Minuten und verschwindet nach einer 30-minütigen Verfolgungsjagd im Einvernehmen mit bisher veröffentlichten Ergebnisse 13. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. BrdU-H4K16ac ChIP-Slot-West-Technik wurde verwendet, um die Menge der H4K16ac mit naszierenden DNA in Abwesenheit von HDAC1,2 Funktion verbunden zu bestimmen. Im Vergleich zum Kaninchen-IgG-Kontrolle (3A und 3B) wurde eine stabile Anreicherung H4K16ac mit naszierenden DNA assoziiert beobachtet. Der Anstieg der im Entstehen begriffenen DNA-assoziierten H4K16ac folgende Hemmung der HDAC1,2 Aktivitäten oder Knockdown von Hdac1,2 ist in 3C gezeigt </strong&gt;, 3D und 3E. Die Höhe der SMARCA5 Chromatin remodeler am Entstehen begriffenen DNA wurde mit BrdU-SMARCA5 ChIP-Slot-westliche Technik bestimmt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass SMARCA5 assoziiert mit naszierenden DNA in Säugetierzellen. Weiterhin hat HDAC1,2 Hemmung oder Knockdown Hdac1,2 die Menge an naszierenden DNA-assoziierten SMARCA5 Chromatin remodeler nicht ändern, wie in Abbildung 4 dargestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Bestätigung der Spezifität der HDAC1,2-selektive Inhibitoren. Western-Analyse von Ganzzelllysaten folgenden Ad-Cre-Infektion und die Behandlung mit 898 oder von HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL oder HDAC3 FL / FL Fibrosarkomzellen vorbereitet233. Die Zellen wurden mit 3 &amp; mgr; M oder 898 233 24 h nach einer 48 Stunden Ad-Cre Infektion behandelt. Diese Zahl wird von unseren bisherigen Veröffentlichungen 6 abgeleitet werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig2.jpg" /> Abbildung 2 Dynamik der PCNA-Vereinigung mit naszierenden DNA in HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit Bromdesoxyuridin (BrdU) für 30 min markiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, um nicht eingebauten BrdU und in Medien kultiviert angegebenen Zeiträume (Chase) zu entfernen, ohne BrdU. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) wurde mit anti-wuchernden cell nuclear antigen (PCNA) Antikörpers durchgeführt. BrdU markierte DNA in DNA-Eingang und die mit PCNA assoziiert sind, vorhanden in Slot-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-Brd beurteiltU-Antikörper, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese Zahl wird von unseren bisherigen Veröffentlichungen 6 abgeleitet werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig3.jpg" /> Abbildung 3. Der Verlust der Histone Deacetylase 1 und 2 Erhöht H4K16ac auf Nascent DNA. (AB) Bromodeoxyuridine (BrdU) Puls Jagd wurde in HeLa und NIH3T3-Zellen durchgeführt, um Vereinigung von H4K16ac mit naszierenden DNA zu den angegebenen Zeitpunkten zu bestimmen. (CD) NIH3T3-Zellen wurden entweder mit DMSO oder HDAC1,2 selektiver Inhibitor (898 oder 233) für 24 h behandelt. (E) NIH3T3-Zellen wurden entweder mit nicht-Targeting (NT) oder Hdac1,2 (H12) siRNA transfiziert. Zellen, die aus (C - E) wurden mit BrdU markiert undzum Chip mit anti-H4K16ac gefolgt von Slot-Blot. Die Membran wurde mit anti-BrdU-Antikörper sondiert. Die Zahlen zeigen, die dem Bild J Quantifizierung der mittleren BrdU-Signal mit hohem und mittlerem Volumen von ChIP DNA entdeckte. Diese Zahl wird von unseren bisherigen Veröffentlichungen 6 abgeleitet werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig4.jpg" /> Abbildung 4. SMARCA5 Associates mit Nascent DNA. Die Menge des im Entstehen begriffenen SMARCA5 am Chromatin folgenden Verlust von HDAC1,2 Funktion gezeigt. NIH3T3-Zellen wurden entweder mit einem HDAC1,2 selektiver Inhibitor (898) behandelt werden oder mit nicht-Targeting (NT) oder Hdac1,2 (H12) siRNA transfiziert. Zellen wurden mit BrdU nach den vorstehend erwähnten Behandlungen und Chip mit anti-Kaninchen-IgG oder SMARCA5 (negative c markiertenontrol) durchgeführt. Steigenden Volumina von Chip-DNA wurde auf dem Slot Blot gesichtet und die Membran wurde mit anti-BrdU-Antikörper sondiert. Diese Zahl wird von unseren bisherigen Veröffentlichungen 6 abgeleitet werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53647/53647fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Aufrufe.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

Serie: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Forschung

Genetik

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Biochemie

Messung von ubiquitylierten, SUMOylierten und ADP-ribosylierten DNA-Protein-Vernetzungen

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autor im Rampenlicht: Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Biologie

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging