We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Exosome izolasyon ve saflaştırma prosedürü genel bir diyagram Şekil 1&#39;de verilmiştir. Tüm kan sağlıklı gönüllü donörlerden ve Emory Üniversitesi&#39;nden Umut Kliniği ve Grady Sağlık Sistemi Bulaşıcı Hastalık Programı katılıyor antiretroviral theraoy almayan HIV pozitif bireylerin elde edilmiştir Atlanta, Georgia. Bu çalışma Emory Üniversitesi Tıp Morehouse Okulu kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm kişilerin yazılı ve bilgilendirilmiş onam formu. Kan Plazma eksozomlann hazırlanması 1. <ol><li> İnsan Kan Toplama ve İşleme <ol><li> (18 mg potasyum EDTA ihtiva eden) EDTA kan toplama tüpleri içinde damar delme ile periferal kanın 10 ml toplamak ve hafifçe karıştırın beş kez ters çevirin. </li><li> Kan hücreleri topaklamak üzere oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, kan toplama tüpleri santrifüjleyin. Steril pipeti kullanınte 25 ml&#39;lik konik tüp plazma kısmını (4-5 ml) aktarmak için. 1 x 10 ml PBS ile plazma seyreltin. Biohazard atıklar için uygun işaretli kapta (aynı zamanda PBMC&#39;de olarak bilinen kırmızı kan hücreleri, beyaz hücreler) kan hücrelerini atın. Not: enfekte edilmemiş verici kan örnekleri durumunda, PBMC, daha fazla kullanım (aşağıdaki prosedür IV.2 bakınız) için ayrılmış olabilir. </li><li> Kısa vadede (2-3 gün) veya daha uzun süreli saklama için -80 o C&#39;de 4 o C&#39;de plazma örnekleri saklayın. NOT: Daha fazla işlemeden önce 4 o C herhangi donmuş plazma örnekleri getirin. </li></ol></li><li> Plazma Exosome Kesir hazırlanması <ol><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin plazma hücre tortularım çıkartmak için. Temiz bir 25 ml&#39;lik ultrasantrifüjdeki tüp temizlenir plazma süpernatant aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Biohazard konteyner pelet atın. </li><li> 2 100,000 xg&#39;de temizlenir plazma santrifüj4 ° C&#39;de saat büyük kesecikler kaldırın. Pipetle dikkatli 100.000 xg Süpernatantı ve biyolojik tehlike atıklar atın. Temiz bir tüp içinde 1X PBS 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yavaşça çıkarmak ve ayrı partiküller dönen, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> PBS 25 ml ilave etmek suretiyle süspansiyon haline 100,000 x g eksozom / virüs pelet yıkayın. Yavaşça, sonra karışımı 4 ° C &#39;de 2 saat boyunca 100,000 x g hızında tekrar santrifüj tüpü, beş kez ters çevirin. Biyolojik tehlikeli atık kabı PBS yıkama solüsyonu atın. </li><li> 1 x PBS, 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yerinden ve pelet çözmek için hafifçe dönen 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. NOT: iyodiksanol gradyan aşamasına kadar 1-2 gün süreyle 4 ° C &#39;de, eksozomlar ve virüs parçacıkları içeren, iyodiksanol gradyan doğrudan ilgili adıma pelet saklamak mümkün değilse. </li></ol></li></ol> Eksozom 2. saflaştırılması <ol><li> % 6 -18% veloc üretBir iki odacıklı degrade eski cihazı kullanılarak iyodiksanol bir Sığ gradiyentleri. <ol><li> PBS içinde seyreltilerek, su içinde% 60 çözelti olarak temin iyodiksanol reaktifi% 6 ve% 18 çözümleri hazırlayın. Pipet 5,5 karıştırıldı odasına 18% çözelti ml ve pipet depolama haznesine% 6 çözeltisi 5.5 mi. , Karıştırıcı açın musluğunu açık ve her gradyan, 14 ml ultra santrifüj tüpüne akmasına izin verir. NOT: hemen kullanın veya kullanmadan önce 4 ° C&#39;de hazırlanan degradeler O / N saklamak ya. </li><li> Dikkatle her 11 ml degrade üst kısmına eksozom / virüs çözümü 1 ml katman. Bir SW40Ti sallanan bir kova rotor kullanılarak 4 ° C &#39;de 2 saat için 250,000 x g&#39;de santrifüjleyin gradyanlar. </li><li> On iki (12), 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Degrade üstünden 1.0 ml çıkarın ve tüp 1. transfer. Sırayla tüpleri 2-12 kalan 1ml kesirler aktarın. NOT: En üstteki kısım böylece 1. alt kısmı, 12. olacaktır. St4 ° C &#39;de gradyan fraksiyonları yardımcı olmaktadır. 4 ° C&#39;de depolanan gradyan üstündeki fraksiyonları 1-3 olmalıdır saflaştırılmış eksozomlar, 3-4 hafta boyunca stabildir. </li></ol></li></ol> 3. Exosome Karakterizasyonu <ol><li> Asetilkolinesteraz (AChE) Aktivite Deneyi <ol><li> 1X PBS, 1 ml asetiltiyoklolin iyodür 28,9 mg karıştırılarak 100 mM substrat stok hazırlayın. 1 ay -20 ° C de saklayınız substrat stoku. </li><li> 1X PBS, 10 ml benzoik asit 39.6mg ve sodyum bikarbonat 15 mg karıştırılarak 10 mM renk göstergesi stok hazırlayın. Iki hafta 4 ° C&#39;de saklayın renk göstergesi hisse senedi. </li><li> (Örneğin, 10 mi 1X PBS + 200 ul substrat + 500 ul renk indikatörü) 5: 2: 100 bir oranda karıştırma 1X PBS, alt-tabaka ve renk göstergesi ile analiz reaktifi hazırlayın. </li><li> Bir 96-yuvalı microtite kuyularına Transferi (III.3 prosedürü ile ilgili, 1-12 etiketli), her 1.5 ml gradyan fraksiyon tüpten 50 ulr plakası. Her degrade numune için yinelenen kuyu hazırlayın. </li><li> İlk PBS içinde 2000 μU / ml AChE stok yaparak bir dizi standardı hazırlayın. Yap on (11) 2-kat, bu stoklar seri dilüsyonları ve bir mikrotiter plakasının bir tek oyuğuna her seyreltme 50 ul, böylece standart # 1 = 2000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, vb # 12 = 0.98 μU / ml kadar. On iki AChE standartları, böylece, 96 oyuklu bir deney plakasının bir tek sıra kaplayacaktır. </li><li> Her bir deney reaktif karışımı 200 ul de ekleyin ve renkli reaksiyon ürününün gelişimi sağlamak için oda sıcaklığında (karanlıkta) 20 dakika inkübe edilir. Bir flüoresan mikro levha okuyucusu kullanarak 450 nm&#39;lik bir dalga boyunda AChE aktivitesi ölçülür. Not: eksozom saflaştırmadan sonra, başlangıç ​​materyali kaldığını yüzdesi bölünmemiş plazma AChE testi ile değerlendirilir. </li></ol></li><li> İmmünoblot Analizi <ol><li> Proced gradyan fraksiyonları 1-12 Ayrı proteinler (100V x 1 saat sonra% 4-20 Tris-HCI prefabrik jel üzerinde SDS-PAGE ile ure 2.1.3). Üreticinin talimatlarına göre bir elektro-lekeleme aktarım hücresi kullanılarak bir nitroselüloz zara jelde proteinleri aktarın. Transferler 350V de 12-16 saat (O / N) için leke izin verin. </li><li> Lekeleme aparatı membranı çıkarın ve 5 dakika boyunca Tris tamponlu tuz (TBS) içinde yıkayın. Oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca (% 0,1 Tween 20 ile TBS) TTBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke edin. </li><li> 12-16 saat (O / N), 4 ° C de çalkalanarak% 5 yağsız süt içinde eksozomlann (CD9, CD45, CD63) veya HIV-1 kapsid proteini (p24) için spesifik primer antikorlar ile membran inkübe edin. Imüno için birincil antikor seyreltileri olarak 1: 2000 -1: 5000. </li><li> 1 ile enkübasyonu takiben, 20 dakika boyunca TTBS içinde blot yıkayın: yaban turpu peroksidazı (HRP) ve 2000 seyreltme, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız süt içinde, anti-IgG (sekonder antikor) ile konjüge edilmiş. Leke TTBS ile 3 kez, yıkama başına 10 dk yıkayınız. </li><li&gt; HRP etiketli proteinler CCD kamera ile bir elektronik görüntüleme sistemi kullanılarak kemilüminesan sinyal Algılama bir kimyasal olarak ışık veren bir sinyal üretmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak luminol alt-tabaka bir reaktif ile leke inkübe edin. </li><li> Adobe Photoshop izlenebilir TIFF dosyaları olarak görüntüleri kaydedin. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak bantların dansitometri analizi yapın. </li></ol></li><li> Sitokin Deneyi <ol><li> Sitokin deneyi öncesinde, asit ayrışma tarafından, insan plazmasının içinde mevcuttur, deterjan muamelesi ile eksozomlar lize immün kompleksleri bozabilir. Tahlil hem başlangıç ​​plazma örnekleri ve arıtılmış eksozom hazırlıkları. <ol><li> Insan plazması, 100 ul için 100 ul 0,33 N HCL ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Asit ile muamele edilmiş plazma nötralize etmek için 100 ul 0,33 N NaOH ekleyin. Bir fi, Triton X-100 nötralize plazma ve saflaştırılmış eksozom her iki numunenin ekleme% 1 nal konsantrasyonu eksozomlann lizizine neden olmak için. </li></ol></li><li> Bu deneyde (floresan bir boncuk esaslı prosedür) için, manyetik boncuk üretici tarafından antikorlar ile önceden kaplanmış kullanır. Anti-insan sitokin antikor kaplı boncuk özel tasarlanmış panelini kullanın; Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. 30 sn için sitokin deney kiti, antikor kaplı manyetik boncuklar Vortex ve deneyde kullanılmak üzere 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 ul boncuk ekleyin. </li><li> 8 noktalı bir standart eğri oluşturmak için, sitokin deneyi kiti için kullanım kılavuzunda tarif edildiği gibi plazma, standart tampon (sitokin deneyi kitin içerdiği her ikisi) standartların bir seyreltme serisi hazırlanır. </li><li> El kitabında açıklandığı gibi, her bir kuyucuğa (kit) 1X yıkama tamponu 150 ul eklenir ve manyetik boncuk yıkayıcı kullanılarak boncuk yıkayın. Her bir kuyunun (kit) 25 ul plazma tahlil tamponu ekleyin. Deneyde kullanılan tüm oyuklara standartlar ve numuneler 25 ul ekle. Plazma 25 ul eklenegatif kontrol oyuklarına örnek tamponu kaplandı. Kapatın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 700 rpm&#39;de sallamak plaka ve 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Her bir oyuğa 1X yıkama tamponu 150 ul ilave edin ve (yukarıdaki aşama 3.3.4 gibi) plakayı yıkayın. Her bir oyuğa, conta içine tespit antikorlarının 25 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm&#39;de plaka sallayın. Yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Her bir oyuğa, conta içine (kit SAPE) streptavidin çözeltisi 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm&#39;de plaka sallayın. 3.3.4 gibi tekrarlayın plaka yıkar. </li><li> Flüoresan sinyal geliştirmesine imkan vermek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 rpm&#39;de bir masa laboratuar karıştırıcısı üzerinde her birine (kit) okuma tamponu 120 ul de ekleyin ve sallayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir levha okuyucu üzerinde plaka okuyun. </li><li> Izolasyon prosedürü sırasında kaybedilen eksozom miktarı için hesap şu denklemi kullanmak için: [(orijinal okuma / plazma hacmi) 66.6 = düzeltilmiş sitokin okuma x]. </li></ol></li></ol> İmmünomodülatuar Potansiyeli 4. Testi <ol><li> Eksozom-tükenmiş Fetal Sığır Serumu, kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Santrifüj 4 ° C &#39;de 20 saat süre ile 100,000 x g&#39;de fetal sığır serumu (FBS), 500 mi eksozomlar ve microvesicles kirletici: pelet. Dikkatle çıkarın ve eksozom tükenmiş FBS süpernatant kaydedin. Biohazard atık pelet atın. </li><li> Roswell Park Memorial Institute 1640 500 ml (1640 RPMI) ortam ile eksozom tükenmiş FBS süpernatant% 20 birleştirin. 0.45 um&#39;lik bir membran filtresinden orta filtre. </li><li> Süzüldü ortama streptomisin (100 U / ml), penisilin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-tamponlu tuzlu su çözeltisi (10 uM) ve IL-2 (20 U / ml) eklenir. </li></ol></li><li> Hücre Kültürü ve Exosome Pozlama <ol><li> Sağlıklı gönüllülerden elde klinik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için eksozomlar Açığa. PBMC&#39;nin Askıyakültür ortamı hazırlanır ve (imalatçının standart bir yönteme göre) hücre / partikül sayacı kullanarak hücreleri sayın. Not: PBMC (1.2 adım a), yukarıda tarif edilen plazma hazırlanması sırasında elde edilir. </li><li> Prosedür 4.1.3 den hazırlanan ortam maddesi kullanılarak, ko-kültür 3,0 x 10 6 toplanan eksozom 1 ug / ml (hücre) üç (3), HIV-1 seropozitif ya da üç (3), HIV-1 seronegatif kişilerin bir toplam (kapak ile) 12-yuvalı kültür plakasının yuvaları içinde 1 ml hacmi. 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile kültür inkübe edin. </li><li> Konkanavalin A ile muamele edilmiş tedavi edilmemiş PBMC kültürleri ve kültürleri hazırlanması (Con A; 5 ug / ml) (4.2.2), yukarıda tarif edildiği gibi, sırasıyla, negatif ve pozitif kontrol hizmet vermektedir. 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca, tüm PBMC kültürleri inkübe edin. </li><li> Alexa Fluor 700-etiketli anti-CD3 (1: 400 seyreltme), allophycocy hemen önce hücrelerin hasat için aşağıdakileri florokrom-eşlenik monoklonal antikorlar dilüsyonları hazırlamak(1: 400), V450-etiketli anti-CD8, Biotin: klorofil protein kompleksi,-etiketli anti-CD4 (400 1) peridinin: anin (APC) / siyanin 7 (Cy7), anti-CD4 (400 1) -etiketli anti-CD45RA (1: 1000) etiketli, fikoeritrin (PE) / anti-CD62L (1: 1000), Cy7-etiketli, PE-Texas Kırmızı-, PE / siyanin 5 (Cy5), anti-CD38 (200 1) -etiketli etiketli anti-streptavidin (1: 2000) ve PE / Cy5 etiketli fare IgG1K izotip kontrol (1: 200). </li><li> 48 saatlik bir bekletme süresinden sonra, PBMC hasat edilir. PBS yıkama PBMC bağımsız florokrom etiketli antikorlar ile 4 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe edilerek hücreler eksozomlar çıkarın ve leke. (21 tarif edildiği gibi) kemokin ifadesinin miktarını belirlemek için akış sitometrisi ile boyanmış PBMC analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10, 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24, 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++T+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J Virol. 79, 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 180, 350-360 (2008).</li><li>O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection.</a> Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).</li><li>Chihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+preferentially+activate+anti-inflammatory+M2-type+macrophages.">HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages.</a> J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.">Vesicle formation during reticulocyte maturation.</a> J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).</li><li>Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+protein+is+secreted+into+vesicles+that+can+fuse+with+target+cells+and+virions.">HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions.</a> Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).</li><li>Muratori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+Secretion+by+T+Cells+Is+Caused+by+HIV+Nef+in+Infected+Cells+and+by+Nef+Transfer+to+Bystander+Cells.">Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells.</a> Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).</li><li>Lenassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Nef+is+Secreted+in+Exosomes+and+Triggers+Apoptosis+in+Bystander+CD4+T+Cells.">HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells.</a> Traffic. 11, 110-122 (2009).</li><li>Raymond, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).</li><li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals.">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media.">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).</li><li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes.">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Kronik immün aktivasyon (CIA) ve CD4 + T hücresi kaybı, HIV-1 enfeksiyonunun iki önemli özellikleridir. Onlar CIA iyi belirleyicisi olmak, patogenezi için belirleyicileri olarak kurulmuştur. Ancak, kronik sistemik immün aktivasyon ve CD4 + T hücre düşüş sürüş altında yatan mekanizmaları hala tam olarak ortaya konamamıştır. Bu ve diğer laboratuar HIV-1 ile enfekte hücrelerden salgılanan eksozomlar iki özelliklerinden önemli bir rol oynadığını sağlam kanıtlar geliştirdik. Hem terkip hem de hücre dışı veziküllerin fonksiyonunda devamlı bir ilgi hücre kültür ortamı ve biyolojik sıvıların 24-26 hem eksozom izolasyonu için çeşitli yöntemlerin yayın yol açmıştır. Eksozom içeriği ve fonksiyonel aktivitesini araştırmak için yeteneğini korurken Bununla birlikte, HIV-1 patojenezinde eksozomlann rolünü araştırmak için bir engel, HIV-1 parçacıklardan eksozom etkili bir ayrıştırma olmuştur. Bir proto geliştirdikiyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı insan plazmasında, HIV-1 parçacıklardan üretilebilir, eksozom saflaştırılması için col. Bu çalışmada kullanılan HIV pozitif donörlerin antiretroviral tedavi ve 206,000 virüs parçacığı / ml 21 arasında ortalama 1500 ile 400,000 virüs parçacığı / mL&#39;ye kadar ihtiva Bu deneyler için kullanılan plazma numuneleri almadı. Böylece, virüs yükü yüksek olduğunda bile, HIV-1 ile enfekte olmuş bireylerin plazmasındaki eksozomlar etkili bir HIV-1 virüs parçacıklarının ayrılabilir olduğunu göstermektedir. Büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki rağmen, eksozomlar yüksek yoğunluklu / indirme fraksiyonlar içinde ayrılmış, viral partiküller, karşılaştırıldığında iyodiksanol gradyanları düşük yoğunluklu üst / fraksiyonlarda ayrılmış. Iyodiksanol gradyan yöntemi ile hazırlanan eksozomlar yüksek düzeyde saflaştırılmış ve hücre dışı proteinleri kirletici ücretsizdir. İzole eksozomlar nüfusun saflığı p24 ELISA ve HIV-1 p24 kapsid proteininin için Western Blot analizi kullanılarak teyit edilmiştiryanı sıra exosomal belirteçleri, AChE, CD9, CD45, CD63 ve Batı analizi gibi. Bu belirteçlerin kullanılması exosome tanımlanması 27 son yayınlanan kılavuzlar ile tutarlıdır. Daha fizyolojik olarak uygun immün aktivasyonu, HIV-1 bulaşmış bireylerden alınan saflaştırılmış eksozomlar, HIV-1 seronegatif kontrollerden eksozomlann önemli ölçüde daha yüksek konsantrasyonlarda sitokinler / kemokinler ihtiva ettiği bulundu. Ayrıca, HTV-1 ile enfekte edilmiş bireylerden alınan eksozomlar saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin yüzeyi üzerinde, aktivasyon markeri, CD38 artmış seviyelerini indüklemek için, bir yetenek sergiledikleri bildirilmiştir, biyolojik olarak aktif idi. Topluca, bu veriler HIV enfeksiyonu sırasında sürekli bağışıklık aktivasyonu sürücü olabilir bir mekanizma öneririz. Sonuçlar biz diferansiyel santrifüj ve iyodiksanol hız gradyanı ayırma değerini gösterir birleştiren bizim exosome arınma süreci kullanarak elde başardıkfiziksel ve fonksiyonel biyo analizler için yüksek ölçüde saflaştınlmış bir eksozom kullanma. Prosedür belli tuzaklar ve sınırlamalar var. Eksozom önemli miktarda AChE aktivite ölçümleri ile hesaplanan başlangıç ​​malzemesinin çoğu zaman, bir çoğu işlemi sırasında kaybolur. Buna ek olarak, prosedür de zaman tüketen ve pahalı ekipmana erişimi gerektirir. Son olarak, gradyan fromer cihazı kullanılarak iyodiksanol geçişlerini nesil tekrarlanabilirliği sağlamak için önemli pratik gerektirir. Gradyan üretimi için alternatif bir yöntem gradyanlar meydana izin vermek için santrifüj tüplerine çözeltilerin dikkatli katmanı ve kuluçka O / N, ardından iyodiksanol çözeltiler kademeli bir dizi hazırlamak için olabilir. Ancak, bu alternatif test değil. Insan plazması, HIV-1 partiküllerden izolasyonu ve eksozom ayrılması için burada açıklanan deneysel protokol ex saflığını sağlamak için etkili bir yöntemdirosomes. Bu yöntemin kullanılması, HIV-1 patogenezinde eksozomlann rolü ile ilgili gelecekte soruşturma için verici yollar yol açmış ve aynı diğer biyolojik prosesler için sorular olarak kullanılabilir.

HIV-1 salgını dünya çapında önemli bir etkiye sahip devam ediyor. 2013 yılı itibariyle, dünya genelinde yaklaşık 35 milyon kişi HIV ile yaşadığı ve bunlardan 2,1 milyon yeni enfekte bireyler 1 idi. Önleme stratejileri ve antiretroviral tedaviye artan erişim HIV genel edinimini azaltmada yararlı olmuştur. Ancak, bireysel popülasyonları halen HIV 1 edinimi yükselir yaşıyoruz. Bu nedenle, bu salgının ele almaya devam çabaları için bir ihtiyaç vardır. HIV hastalığın ilerlemesi güçlü belirleyicileri biri kronik immün aktivasyon (CIA) 2-10 olduğunu. Saptanabilir sitokinler ve T lenfositlerinin yüzeyinde yükseltilmiş ifade belirteçleri sürekli olarak yüksek seviyelerde tarafından tanımlanan, CIA sanılıyor: Ben 11 IFN Tip i) sürekli dendritik hücre üretimi; HIV proteinleri Tat, Nef ve gp120 12 tarafından tahrik edilen, (ii) direkt immün aktivasyon; (iiiGut ilişkili bağışıklık hücreleri 6 bakteriyel proteinlerin) translokasyonu. Ancak, tam mekanizması (ler) altında yatan kronik HIV enfeksiyonu sistemik bağışıklık aktivasyon tam olarak aydınlatılamamıştır beklemektedir. Araştırma grubumuz ve diğerleri HIV patogenezinde 15-18 yılında eksozomlann rol göstermiştir. Bizim grup Nef proteini eksozom 15, enfekte hücrelerden salgılanan olduğunu belirlemiştir ve exosomal Nef (exNef) nanogram seviyeleri 18 HIV bulaşmış kişilerin plazmasında mevcut bulunmaktadır. Bu alternatif olarak, monosit / makrofajlar exNef kaynaklı apoptosise karşı kolay işlenemezdir. ExNef maruz CD4 + T-hücreleri, CXCR4 yolunun 19, 20 bağlıdır aktivasyonu ile indüklenen hücre ölümü sonuçlandı oradan geçmekte göstermiştir, fakat değiştirilmiş hücresel fonksiyonları ve sitokin ekspresyonunu sergilemişlerdir. HIV ile infekte olmuş bireylerin plazmasındaki izole Son zamanlarda, bir grup göstermiştir eksozomlar pro-enflamatuar sitokinlerin çeşitli içerir. Further, saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücreleri üzerinde CD38 ekspresyonunu indüklediği HIV bulaşmış hastalarda plazma türevi eksozom maruz saf periferal kan tek-çekirdekli hücreleri. Bu büyük olasılıkla sistemik inflamasyon ve seyirci hücre aktivasyonu 21 üzerinden viral yayılma katkıda bulunur ve eksozomlar HIV patogenezinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. HIV patogenezinde eksozomlann rolünü araştıran, bir meydan HIV parçacıklar verimli ayrı eksozomlar exosomal içeriği korurken yanı sıra işlevsel immün modülatör yeteneği teknikleri geliştiriyor. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü ve biyolojik sıvılarda 22,23 den eksozomlar izole etmek için tarif edilmiştir. Çünkü küçük boyutları ve düşük yoğunluklu (eksozomlar 1.15 yoğunluğunda yüzer - 1.19 g / ml), ayırıcı ultrasantrifüjleme ve / veya ultrafiltrasyon eksozom izolasyonu 23 için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir.Bununla birlikte, HIV ile infekte olmuş hücre kültürü süpernatanları, hastaların plazma eksozomlar ve HİV-1 virüs partiküllerini içerir. Eksozomlar ve HİV-1 parçacıkların boyutu ve yoğunluğu açısından oldukça benzerdir. Seçenek olarak ise, örneğin CD63, CD45 ve CD81 gibi benzersiz exosomal markerlerin ekspresyonu yararlanarak, eksozomlar immünoafinite yakalama yöntemleri 23 kullanılarak izole edilmiştir. Bu prosedür eksozom virüsü ayırabilirsiniz. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajı, kültür eksozomlann bağışıklık potansiyelinin değerlendirilmesi ile etkileşime girebilir saflaştırılmış eksozom, antikorların sıkı ektir. Bu sınırlamaları için, iyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı HIV Cantin modifiye insan plazması içinde parçacıklar ve arkadaşları 22 eksozomlann saflaştırılması için bir yöntem geliştirdi. Virüs parçacıkları yüksek- içinde ayrılmış oysa eksozomlar, düşük yoğunluk iyodiksanol geçişlerini / üst fraksiyonları ayırmak bulunduyoğunluk / düşük kesirler. Virüs partikülleri p24 ELISA ile belirlenmiştir ve eksozomlar eksozom işaretleri AChE, CD9, CD63, ve CD45 ile tespit edilmiştir. Toplanan üst düşük yoğunluklu parçacıkları HİV-1 p24 kirlenme için negatifti eksozomlar ihtiva etmiştir. Insan plazması HIV parçacıklardan eksozom etkin bir biçimde saflaştırılabilir ve ayırma insan plazması gibi bağışıklık modülatör potansiyelinin incelenmesi ve HIV-1 patojenezinde eksozom tanısal ve prognostik değerinden türetilen bir eksozom içeriği doğru inceleme sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="506">
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:101px;">368589</td>
			<td style="width:127px;">pink top tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Lymphoprep Ficoll reagent</td>
			<td style="width:92px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:101px;">AXS-1114545</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Optiprep iodixanol reagent</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">D1556</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">14ml ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:92px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;">344060</td>
			<td style="width:127px;">ultraclear tubes</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Gradient Former Model 485</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">165-4120</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Acetylthiocholine iodide</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">1480</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Benzoic Acid</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">D8130</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">S5761</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Acetyl Cholinesterase</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">C3389</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">96-well clear microtiter plate</td>
			<td style="width:92px;">Medical Supply Partners</td>
			<td style="width:101px;">TR5003</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">SpectraMax 190 microplate reader</td>
			<td style="width:92px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;">190</td>
			<td style="width:127px;">Fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Criterion Gel Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">165-6001</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Transblot Gel&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">170-3910</td>
			<td rowspan="2" style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Transfer Cell</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Tris-HCl Criterion precast gels</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">567-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Anti-CD45 antibody&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Ab10558</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">CD63 Antibody (H-193)</td>
			<td style="width:92px;">Santa Cruz Biotech, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">SC-15363</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">CD9 Antibody (H-110)</td>
			<td style="width:92px;">Santa Cruz Biotech, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">SC-9148</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Rabbit pAb p24 HIV-1&#160;</td>
			<td style="width:92px;">ImmunoDX, LLC</td>
			<td style="width:101px;">1303</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">G1472430</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Tris Buffered Saline</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">170-6435</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">31460</td>
			<td style="width:127px;">Goat-Anti-Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">31430</td>
			<td style="width:127px;">Goat-Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Western Blotting Luminol Reagent</td>
			<td style="width:92px;">Santa Cruz Biotech, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">SC-2048</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">GE LAS-4010 Imager</td>
			<td style="width:92px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">LAS-4010</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix&#160;</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">Custom immunoassay panel</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">171-000201</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Coulter Z2 Particle Counter</td>
			<td style="width:92px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;">383552</td>
			<td style="width:127px;">Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (UCHT1)</td>
			<td style="width:101px;">300424</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">APC/Cy7-labeled anti-CD4</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (OKT4)</td>
			<td style="width:101px;">317418</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">PerCP-labeled anti-CD4</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (RPA-T8)</td>
			<td style="width:101px;">550631</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">V450-labeled anti-CD8</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (RPA-T8)</td>
			<td style="width:101px;">560347</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">Biotin-labeled anti-CD45RA</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (HI100)</td>
			<td style="width:101px;">555487</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (DREG-56)</td>
			<td style="width:101px;">304822</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE/Cy5-labeled anti-CD38</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (HIT2)</td>
			<td style="width:101px;">303508</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (L243)</td>
			<td style="width:101px;">307618</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:101px;">551487</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (MOPC-21)</td>
			<td style="width:101px;">400116</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (MOPC-173)</td>
			<td style="width:101px;">400229</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

Eksozomlar hücre tipleri çok çeşitli hem yapısal olarak ve uyarım üzerine salınan olan 30 nm ile 100 nm arasında değişen büyüklükte küçük veziküllerdir. Bunlar, biyolojik sıvılarla bir dizi bulunmuştur ve bu proteinler, lipidler ve nükleik asit molekülleri, çeşitli taşıdığı bilinmektedir. Başlangıçta hücresel enkaz için rezervuarların daha az biyolojik süreçleri düzenleyen eksozom ve hastalıkları rolleri giderek takdir edilmektedir olduğu düşünülen. Çeşitli yöntemler, hücresel kültür ortamı ve biyolojik sıvılardan izole etmek için eksozomlar tarif edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyut ve düşük yoğunluk, ayırıcı ultra-santrifüj ve / veya ultra filtre eksozom izolasyonu için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, HIV-1 bulaşmış kişilerin plazma büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki hem eksozomlar ve HIV viral partikülleri içerir. Bu nedenle, insan plazmasında HIV viral parçacıklardan eksozom etkin ayrılması olmuşturmeydan okuma. Bu sınırlama gidermek için, Cantin et tadil edilen bir prosedür geliştirilmiştir. al., insan plazmasında HIV parçacıklardan eksozom saflaştırılması için 2008. Iyodiksanol gradyanları hızı, HIV-1 pozitif bireylerin plazmasındaki HIV-1 parçacıklardan eksozomlar ayırmak için kullanıldı. Virüs partikülleri p24 ELISA ile tespit edilmiştir. Eksozomlar eksozom belirteçleri asetilkolinesteraz temelinde (AChE) ve CD9, CD63, ve CD45 antijenleri üzerinde belirlenmiştir. Bizim degrade prosedürü virüs parçacıklarının serbest eksozom hazırlıklarını vermiştir. Insan plazmasından eksozomlann verimli arıtma plazma türevi eksozom içeriğini incelemek ve bağışıklık düzenleyici potansiyeli ve diğer biyolojik fonksiyonlarını araştırmak sağladı.

Eksozomlar verimli, HIV-1 pozitif insan plazmasından saflaştırılır. Asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi tarafından tanımlanan izole edilmiş eksozomlar, HIV-1 antijen, p24 tarafından tanımlanan virüs partiküllerinin, oysa iyodiksanol gradyanları üstündeki daha düşük yoğunluklu fraksiyonları 1-3 ayrılmış (alt kısmına yakın, 10-12), daha yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda ayrılmış. Eksozom varlığı daha eksozom belirteçlerinin AChE, CD9, CD45, CD63 ve ve elektron mikroskobu ile (Şekil 2) immunoblot belirlenmesiyle teyid edilmiştir. Pro-inflamatuar sitokinler ve kemokinler ile ilişkili olan ve önemli ölçüde, HIV-1 seropozitif bireylerin eksozomlann yükselmiştir. Saflaştırılmış eksozomlar olan ve olmayan plazma HIV-1 ile enfekte edilmiş ve HIV-1 seronegatif kişilerin çoklu deney ile 21 sitokinler / kemokinler için analiz edilmiştir. Tüm 21 sitokinler / kemokines HIV-1 pozitif bireylerden izole eksozom tespit edilmiştir. HIV-1 seronegatif kontrollerden (Tablo 1) plazma ve eksozom kıyasla Ek olarak, seviyeleri önemli ölçüde yükselmiştir. CD38 ekspresyonu, HIV-1 seropozitif bireylerden eksozomlann maruz kalan hücrelerin yüzeyi üzerinde artmıştır. Enfekte edilmemiş insan donörlerden alınan PBMC&#39;ler ile ilgili aktivasyon markeri CD38 seviyeleri için, HIV-1 seropozitif ve seronegatif bireylerden bir araya getirilmiş eksozom 48 saat süre ile maruz kalan ve değerlendirildi CD4 + ve akış sitometrisi ile CD8 + T-hücreleri. Bu gözlenen 48 saat maruziyet sonrası, CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin önemli ölçüde HIV negatif eksozom tedavisi ve muamele edilmemiş a kıyasla, HIV-1 pozitif bireylerden eksozomlann maruz bırakılan T hücreleri yüksek bulundu saf ve merkezi bellek yüzeyi üzerinde CD38 ekspresyonu ile kontroller (Şekil 3). HIV-1 pozitif insan plazmasından eksozom izolasyonu 1. şematik gösterimi Şekil. (A), periferal kanın 10 ml &#39;HIV-1 seronegatif kişilerin seropositve ve toplanmıştır. (B) EDTA kan toplama tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjlenmiştir. (C), plazma ayrılmış 1x PBS ve (D), yarım 50 ml konik bir tüp transfer seyreltildi, 30 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj edilir. (E) süpernatan tüpleri ultrasantrifüj aktarılır ve (F) 2 saat süre ile 10,000 x g&#39;de santrifüjlendi. (G, H) Yüzey maddesi atıldı ve eksozom pelet yeniden süspansiyon haline getirildi ve 1X 1 ml PBS içinde yıkanır. Santrifüj sonrasında (I) &#39;in yüzey maddesi atıldı ve pelet, PBS 1x 1 ml yeniden süspansiyon haline getirildi ve 2 saat boyunca 250,000 x g&#39;de santrifüje tabi 6-18% iyodiksanol hızı gradyanı ve (J) üzerine yerleştirilmiş. Santrifüj sonrasında (K), gradyanın üstten alta 1 ml&#39;lik kısımlar tra edildi1.5 ml tüplere nsferred AChE içeriği ve immunoblot analizi için analiz edilmiştir. (L) fraksiyonlar 2 ve 3 den edildi birleştirildi ve 1X PBS ve 2 saat 400,000 x g hızında santrifüjlendi (M), 4 ml ile sulandırıldı. (N) Santrifüj sonrasında, süpernatan atıldı ve pelet, pro-enflamatuar, sitokin ve kemokin ifadesi analizi için 1X PBS içinde 1 ml yeniden süspansiyona alınmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495fig1large.jpg" target="_blank">Bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53495/53495fig2.jpg" /> Şekil 2. Eksozomlar şekilde insan plazmasından saflaştırılır. HlV-seropozitif ve seronegatif kişilerin Bireysel iyodiksanol hız gradyanı fraksiyonlar (A) &#39;asetilkolinesteraz için enzimatik analiz (AChE) ve exosomal belirteçleri CD9, CD (B) Western blot analizine tabi tutulmuştur45, CD63, virüs protein p24 ve idi (C) anti-CD63 ile birlikte imüno-ve saflaştırılabilir eksozom (C) &#39;nin hazırlanmasını teyit etmek için elektron mikroskopi ile incelenir ve. (Izinle kullanılan Konadu ve ark, 2014 21, gelen Şekil). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53495/53495fig3.jpg" /> Bağışıklık Değişim Potansiyel Şekil 3. tahlilinden. PBMC, HIV-1 seronegatif kişilerin, HIV-1 seropozitif plazmasında (HIV + Exo) ya da seronegatif toplanan eksozom birine muamele edilmemiş (HIV EKZO) bireyler, sol maruz kaldıklarında ya da tedavi edilen 5 ug / Bir pozitif kontrol olarak, Concanavalin A ml (Con A). 48 saat maruz kaldıktan sonra, Naif (CD45RA + / CD62L +), Orta (TCM; CD45RA- / CD62L +) ve Efektör (TEM; CD45RA- / CD62L-) Hafıza CD4 + ve CD8 + T hücreleri akış sitometrisi ile CD38 ifadesi için analiz edildi. Eksozom konsantrasyonu, toplam protein normalize edildi ve 1 ug / ml&#39;de ilave edildi. Hata çubukları +/- ortalama temsil eden altı bağımsız donörlerin SEM. Gruplar arasındaki fark One Way ANOVA Testi istatistiksel olarak anlamlı açısından test edilmiştir. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001, **** p &lt;0.0001. (Izinle kullanılan Konadu ark gelen Şekil, 2014 21). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53495/53495table1.jpg" /> Pro-enflamatuar sitokin ve kemokin ifadesi için saflaştınldı eksozom ve HİV-1 seropozitif gelen bütün plazma ve seronegatif kişilerin Tablo 1. Analiz. </strong&gt; HİV-1 seropozitif ve seronegatif bireylerden saflaştınldı eksozomlar, pro-inflamatuar sitokin ve kemokin ifadesi için analiz edildi. Ölçülen 21 pro-enflamatuar sitokinler ve kemokinler ile ilişkili ve anlamlı seronegatif kontrollere göre, HIV-1 seropozitif bireylerin eksozomlann yükselmişti. Buna ek olarak, IL-1 a, IFNa2 ve CXCL10 anlamlı seronegatif kontrollerden a kıyasla, HIV-1 seropozitif bireylerin bölünmemiş plazma yüksekti. Gruplar arasındaki fark Mann-Whitney U Testi ile istatistiksel olarak anlamlı açısından test edilmiştir. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0,001, **** p &lt;0.0001. (Izinle kullanılan Konadu ve ark, 2014 21, gelen Şekil). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495table1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals at JoVE.com

HIV-1 Pozitif Bireylerin Plazmasından Eksozomların İzolasyonu | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

isolation-of-exosomes-from-the-plasma-of-hiv-1-positive-individuals

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

17.2K Görüntüleme.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Video: Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

HIV-1 V3 döngü Taç R2 Sıra immünolojik İlgili Dinamik Tersiyer Yapısal Özellikler Değerlendirilmesi Ab initio Katlanır

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...