This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.

Bu protokol tüm hayvan çalışmaları prosedürleri onaylı Newcastle Hayvan Etik Kurulu Üniversitesi&#39;ne sıkı sıkıya bağlı kalmanın ile yapılır. Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> 37 önceden sıcak Ortam 199 (TC199) veya Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ortamı ° C. Ön oxygenate% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile köpüren ile orta. Orta 7.3 bir son pH değerine sahip olduğunu kontrol edin. </li><li> Her kese için iki adet 5 cm bölümleri keserek dikiş hazırlayın. Döngü kapatılmamış bir düğüme dikişler. </li></ol> 2. Diseksiyon ve gastrointestinal sistemde hazırlanması <ol><li> Ötenazi önce katı gıda 12 saat çekin. İstenirse, bu süre içinde besin jel takviyeleri hayvanları yerleştirin. </li><li> sodyum pentobarbiton aşırı dozda fareler öldürülür ([200 mg / kg], karın içinden enjeksiyon) kurumsal etik proto uygun olarak servikal dislokasyoncols karın ve göğüs üzerine% 70 etanol sprey ve. </li><li> Bir makas kullanarak, karın ortasında yatay bir kesi yapmak ve periton maruz kalmaktadır. </li><li> ayırmak ve pilor sfinkter de mideden üst ince bağırsak kesme ve anal eşiğinde kalın bağırsak keserek gastrointestinal sistem kaldırmak için devam edin. yavaşça mezenterin kaldırmak için bir forseps kullanın. Önceden ısıtılmış, oksijenli bir ortam içinde bağırsak yerleştirin. </li><li> Bağırsak bölümünde tespit geçirgenlik (Şekil 1) için değerlendirilir ve bağırsak geri kalanından bilgilerini bu bölümü kesilecek. <ol><li> , Hayvanlar arasında tutarlılığı korumak mide duodenum ve jejunum göreli bölümleri ölçmek ve çekum kolon ve ileum göreli bölümleri ölçmek için. </li><li> Doku bölümleri seçerken, örneğin Peyer yamaları olarak mukoza ile ilişkili lenfoid doku varlığı not edin. Bu küçük nod olarak tanımlanabilirlümenin serozal tarafında ules. </li><li> 1 ml şırınga kullanarak, yavaşça önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) bir petri çanağı içine barsak segmenti luminal içeriği yıkayın. Bu dışkı içeriği atılan veya saklanabilir -80 istediğiniz gibi gelecek analizi için ° C. </li></ol></li></ol> Bağırsak Sacs 3. hazırlanması <ol><li> test bileşiği veya molekül bir 300 ul hacim ile 1 ml şırınga hazırlayın. mukoza bütünlüğü, FITC Dekstran M.Wt. bir 1 mg / ml solüsyon için 4.400 kullanılabilir. 4,400-70,000 Da büyüklüğü arasında değişen Probes artan hassasiyet için kullanılabilmektedir. Güvenli şırınga üzerine küçük bir hayvan damar kateteri uygun. </li><li> barsak segmentinin açılması 5 cm ölçün ve segmenti kravat güvenli bu noktada bir dikiş-döngü ile kapattı. Yavaşça bağırsak açılışında etrafında önceden bağlı dikiş-döngü yerleştirin ve küntleşmiş kateter yerleştirin. bağırsak segmenti güvenli şekilde kapalı kement çekinve tüm çözüm enjekte edilir sağlamak, bağırsak içine şırınga 300 ul hacmi bırakın. </li><li> Aynı anda bağırsak kesenin kapanmasını sağlamak için dikiş ilmeği çekerken yavaşça kateter kaldırın. bağırsak gevşek bağırsak kese kesin ve 37 ısıtılmış oksijenli ortam, 20 ml ile dolu bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine yerleştirmek ° C. </li></ol> Geçirgenlik 4. Ölçümü <ol><li> ısıtılmış su banyosunda bağırsak keseleri içeren yer konik tüpler 37 ayarlanır ° C. 0, 30, 60, 90 ve 120 dk zaman noktalarında, her bir durumda taze ortam 100 ul hacim değiştirerek, 96 oyuklu bir plaka, konik tüp ve transfer 100 ul numune alın. </li><li> son örnek alındıktan sonra, mukozal yüzeyi açığa sütür noktasında ve segmentin uzunluğu aşağı açık keselerini kesti. </li><li> Her bağırsak parçasının uzunluğunu ve genişliğini ölçün. desi isekırmızı, çıtçıt -80 ° C&#39;de kesimleri ve mağaza dondurmak Moleküler Yöntemler RNA stabilizasyonu çözelti içinde protein veya biyokimyasal analizler, ya da seçenek olarak, deposu için ° C. </li><li> 1 ilâ 1 x 10 -6 kadar FITC etiketli moleküller için log dilüsyonlarda bir standart eğri oluşturmak. </li><li> Bir floresan plaka okuyucu üzerinde FITC için numuneleri ölçün ve standartlar, FITC uyarma / emisyon: / 519 nm 495 nm. </li></ol> Her Bireysel Bağırsak Sac için görünen geçirgenliği 5. Hesaplama <ol><li> sn zaman birimlerini dönüştürün. </li><li> Her bir zaman noktası için, kümülatif konsantrasyon, S hesaplanması Q t = (C t * V r) + (Q t toplamı * V ler), Nerede: Q t = t zamanındaki kümülatif konsantrasyon C t = t zamanındaki Konsantrasyon Alıcı tarafında V r = Hacim Önceki tüm Q t Q t toplamı = Sum V s =Cilt örneklenmiş </li><li> Arsa süresi (T) karşı Q ve eğimi hesaplamak: δQ / ¨t </li><li> Belirgin geçirgenliği hesaplayın (P uygulaması) P app = (δQ / ¨ t) / (A * Co), Nerede: bir doku = Konum Cı 0 = Başlangıç ​​konsantrasyonu </li></ol>

<ol>
	<li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation.">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).</li><li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine.">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li><li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition.">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li><li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury.">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li><li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion:+evidence+for+an+'enteric+tear'+mechanism.">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li><li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis.">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li><li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB/DbpA.">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li><li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine.">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li><li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor:+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis.">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li><li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia.">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li><li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers.">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li><li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers.">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li><li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+(methacrylate)+and+N-trimethylated+chitosan+polymers.">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li><li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae.">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li><li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein.">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li><li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells.">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li><li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization.">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li><li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome.">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li><li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium:+molecular+basis+and+regulatory+aspects.">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li><li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat,+ovine+and+bovine+Peyer's+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function.">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li><li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice.">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li><li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice.">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology &amp; therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li><li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota.">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Burada, mukozal bariyer fonksiyonunu ex vivo değerlendirmek için izolasyon ve bağırsak keselerinin hazırlanmasını ayrıntılı var. Bağırsak kese hazırlıkları öncelikle bağırsak boyunca aday ilaçların emilimini inceleyerek, ilaç araştırma faydalanılmıştır. Bununla birlikte, bu deney, eşit ölçüde iyi barsak hastalığı çalışma için uygundur. bölge ve geçirgenlik sahaya özgü değerlendirilmesi ile büyük ölçüde değişebilir bağırsak geçirgenliği sindirim hastalıklarında mukozal bütünlüğün bölgesel öneminin daha iyi anlaşılmasını sağlar. deney sağlam ve doğru fizyolojik koşullar altında, izole edilmiş dokular kadar 6 saat sonra mortem için geçerli kalır. ötenazi doku, hazırlama hızı önemlidir ve bağırsak içeriğinin temizlendi ve mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde oksijen ortamına transfer edilmelidir. hayvanlar arasındaki tutarlılığı sağlamak amacıyla, doğru bağırsak bölgeleri identifi olması esastırEd (Şekil 1). Duodenum ve jejunum segmentleri mideden ölçülür ise kolon ve ileal segmentler, çekum ölçülür tavsiye edilir. Farklı suşlar, modeller veya transgenik hayvanlar daha büyük ve daha uzun Gits olabilir, çünkü geçirgenlik deneyleri yapmadan önce sizin modelinde ortalama uzunluğu veya her bağırsak segmenti karakterize eden değerdir. Bölgesel tutarlılık ek olarak, her bir bağırsak kesesi eşit uzunlukta kesilir ve SAC doğru miktarda sıvı ile dolu olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu faktörler Tutarsızlık tahliller arasında mukozanın eşitsiz şişkinlik neden olur. Altı şişliği bağırsak segmentinin sadece mukoza yüzeyine lümen içeriğinin maruz kalma azaltır, aynı zamanda işaretleyici seyahat gerekir hangi aracılığıyla doku kalınlığını arttırır. Aşırı şişkinlik dokusunda stres yanıtları dokuya zarar veya aktive edebilir segmenti, potansiyel işbirliğinfounding sonuçlanır. P uygulamasının hesaplama villöz yapının yüzey alanı hesaba katmaz için bu, dikkat edilmelidir. Bu dokunun fiili görünen geçirgenliği hesaplanırken hata yol açarken yüzey alanı sabit olarak hesaplanmaktadır, bu modeller arasında karşılaştırma sonuçlarını etkilemez. Hastalığa bağlı yüzey alanının herhangi bir değişiklik epitel bütünlüğü kaybı telafi edilir ve protokol hastalığın ilerlemesi 6 geçirgenlik değişiklikleri belirlemek için yeterince sağlamdır. doku kültür ortamının kullanılması tavsiye edilir. Barthe ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda. TC199 kullanımı basit tuz tamponları 9 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde epitel canlılığı ve doku histolojik mimarisi, uzun ömürlü artırdığı tespit edilmiştir. Çalışmalarımızda DMEM ve TC199 hem orta 37 ° C&#39;de muhafaza ° C doku yaşam 5,6,10 için en uygun şartları sağladı. doğru medyatahlil sırasında sıcaklık muhafaza gerekli sıkı kavşak bütünlüğü ve transselüler yollar aracılığıyla aktif taşıma ile ilgili deneyleri optimal doku metabolizmasını sağlar iken, doku bütünlüğünün sürdürülmesi için gerekli besinleri epitel besler. 37 altındaki sıcaklıklarda Doku canlılığı ° C neden kaybı, parasellüler taşıma artırılması ve transselüler taşıma 11 azalan. Bu durumda, en iyi şartlarda doku canlılığını uzatan esastır ve bu sayede, deney bölge, bariyer bütünlüğünü ve incelemek için sadece kullanılabilir, aynı zamanda bir müdahalesi ve fizyolojik ve transkripsiyonel yanıtlar incelemek. Esas olarak, ilaç absorpsiyon çalışmaları için kullanılır iken, teknik epitelyal bariyer boyunca bir belirteç molekülünün belirgin geçirgenlik (Papp) incelemek için, bağırsak bütünlüğünün 12-15 çok hassas bir ölçümüdür. Buna karşılık vekil ex vivo ÖlçülmesiBöyle TEER olarak bariyer fonksiyonunun NTS, P uygulaması bağırsak bariyer 4 doğrudan ve son derece hassas ölçüsüdür. Bu işaretleyici moleküllerinin P uygulaması tarafından ölçülen TEER ölçümleri ve geçirgenlik her zaman korele olmadığını fazlalaştı. TEER ölçümleri sıkı kavşaklar ve transselüler paralel dirençlerin 16, hem direncini kapsamaktadır. Bu nedenle TEER sıkı kavşaklar ve hücrelerin kendileri tarafından sunulan birleşik direniş bir ölçüsüdür. hücre-hücre dernekler zayıf ise o zaman bir tek tabaka genel direnci bu katkı düşük olacak (yani, sıkı kavşaklar sızdıran vardır). Böylece sızdıran epiteli için sıkı kavşak dirençler küçük değişiklikler bir bütün olarak epiteli dirençleri ihmal edilebilir değişiklikler olur. Bunun aksine, p APP analizi gerçekten de mukoza engelini 17 çapraz ve bir molekülün yeteneğini al olabilir Papp ölçümlerinin hassasiyetini ölçenFarklı büyüklükteki işaretleyici molekülleri (Şekil 1) seçerek yoluyla Gürler. markör boyutu doğrultusunda incelenen barsak hastalığı modeli ile ilgili olarak önemlidir. Bütünlüğünün kaybı hafif ve orta şiddette olduğu alerji veya fonksiyonel hastalık 18,19, modelleri bağırsak bariyer fonksiyonunun ince değişiklikler tanımlanmasına olanak sağlayacak düşük molekül ağırlıklı belirteçler, daha uygun olabilir. Bunun aksine, bağırsak epiteli soyma içerir DSS kolit gibi modeller ile, daha büyük bir belirteçler bariyer fonksiyonunun nispeten küçük artışlar vurgulanır gibi, mukozal iyileşme değerlendirmek için daha uygun olabilir. Bağırsak keseler GI bariyer fonksiyonunun fizyolojik ilgili bir model sunarken, göz önünde bulundurulması gereken hayvan modellerinin değişkenliği ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, salgı devlet veya epitel mide- genelinde hem parasellüler taşıma etkileyebilirtine 20 ve mukoza jel tabakası 5 bütünlüğü. Böyle Ussing odası hazırlıkları olarak elektrofizyolojik ölçümler, birleşmeyle ex-vivo deneyler, bu hesap da, bağırsak keseler yok. İkinci olarak, bu dokuda 21 geçirgenliğini etkileyebilir olarak, kese hazırlıkları kapsamında, bu tür Peyer yamalar gibi lenfoid yapılar için hesap gerektiğini bağırsak keseler araştırmacılar hazırlanmasında. Bu düşüncelere rağmen epitel devamlılığını değerlendirmek için kullanılan bir çok hücre kültürü modelleri, farklı olarak, bağırsak keseler bir mukoza jel tabakası ve bir alt lamina propria hem de katkı sunmaktadır. Mukoza jel tabakası katkısı, özellikle, örneğin deksametazon 5,17 gibi N-asetil sistein, veya hidrofobik izleyici moleküller olarak mukolitik maddeler, kullanımı ile değerlendirilebilir. Bu ağ, kanser tedavisi veya enflamatuar bağırsak hastalığı modellerinde barsak geçirgenliğinin değerlendirilmesinde özellikle önemli olabilirBurada mukoza bariyer kaybı mukozal inflamasyon 22,23 erken patoloji olabilir. Benzer bir şekilde, ishal, fonksiyonel gastrointestinal hastalık veya dysbiosis bağırsak mukus üretimi ve genel olarak mukoza jel bütünlüğü modellerinde bölge sitelerinin 5,19,24 de değiştirilebilir. Geçirgenlik belirteçleri ve sonraki serum örnekleme ağızdan sonda in vivo bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi için başka bir seçenektir. Bu yöntem dokusu minimal manipülasyon sahipken, bağırsak bariyer fonksiyonunun kompozit ölçüsüdür ve genel bariyer bölgesel katkıları değerlendirmek değildir. GI hastalığın farklı modelleri ağızdan sonda yaklaşımlarla sorumluydu olmayacak nispi öneminin farklı siteleri olması muhtemeldir. Bağırsak kese kullanımı dolayısıyla hastalığın küçük bir hayvan modellerinde, bölgesel bağırsak mukoza bütünlüğünün incelenmesi için de kullanılabilir, bir hızlı, hassas ve fizyolojik açıdan ilgili bir deneydir.

Mide-bağırsak sisteminin intestinal epitelyal bariyer Yetişkin bir insanda, 400 m2&#39;de yaklaşık mukozal yüzey alanıdır. Sonuç olarak, sürekli mikrop, yutulan ilaç, besin ve bakteriyel toksinler karşı maruz kalmaktadır. ev sahibi sadece tolere ortakçı bakteri ve potansiyel patojenler arasında ayrım olmamalıdır, ama aynı zamanda besinlerin emilimini sağlarken, epitel bariyerini geçen bu türlerin ve salgılanan molekülleri engellemek gerekir. Bu nedenle, bağırsak epiteli rolü lümen içeriği 1 için seçici bir bariyer olarak hareket etmektir. Bu kurucu ve uyarılabilir mekanizma 2 oluşan bir yanıt biyolojik sistem yoluyla hareket mukozada doğuştan gelen epitel savunma sistemi tarafından, kısmen, elde edilir. Epitelyal bariyer işlevinin kaybı gastrointestinal hastalıkların bir dizi özelliği olan bir patolojidir. In vivoepitelyal bariyer fonksiyonunun incelenmesi bir izleme molekülünün oral sonda ve sonraki serum analizi 3 ile değerlendirilebilir. Ancak, bu teknik bariyer disfonksiyonu siteye hiçbir gösterge sunar. In vitro ve Transwell sistemlerini 3 kullanılarak sırasıyla odaları 4,5 Ussing transepitelyal direnci ex vivo değerlendirmede, yaygın epitelyal bariyer fonksiyonunun taşıyıcı belirteç olarak kullanılan, ancak hayvan modellerinde 6 katkıda hastalık fizyolojisini yoksundur. Bu protokolde düzeylerde bir dizi mukozal bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek bağırsak bütünlüğü ve doğrudan ve lokalize değerlendirmesini sağlayan bir ex vivo doku hazırlama modeli açıklanmaktadır. Önemli olarak, bu teknik, hastalığın hayvan modellerinde de uygulanabilir, veya farmakolojik olarak mukozal bariyer işlev bozukluğu derinliği sorgusunda izin vermek için manipüle edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&amp;nbsp; Non-absorbable Silk suture</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>No phenol red as this interferes with fluorescence</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>No phenol red as this interferes with fluorescence</td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Use at 10 mM in media</td></tr><tr><td>Small animal vascular cathether: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4,400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20,000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70,000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo intestinal sacs to assess mucosal permeability in models of gastrointestinal disease

epitelyal bariyer gastrointestinal sistemin ilk doğal savunma ve seçici küçük epitel boyunca moleküller ve neredeyse tamamen epitel makromoleküler taşıma yasaklayan taşınmasını kısıtlayan, altta yatan doku bölmelerine lümenin ulaşım düzenler. Bu seçicilik, lipofilik moleküller ve hem apikal reseptörleri ve epitelyumun dar kavşak protein kompleksleri taşıma sınırlar mukoza jel tabakası ile tespit edilir. Epitel in vitro hücre kültürü modelleri uygun olmakla birlikte, bir model olarak, bu eksikliği Mikrobiyota, mukoza-jel, epitel ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı. Öte yandan, alana özgü hiçbir gösterge ile bağırsak emilim veya geçirgenlik in vivo değerlendirilmesi gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyler, genel olarak mide-bağırsak absorpsiyonu ölçülür. Ex vivo geçirgenlik deneyleri &quot;intestinal kesesi&quot; kullanılarak; Bağırsak sitesi özgüllük avantajıyla genel bağırsak bütünlüğü veya belirli bir molekülün karşılaştırmalı taşınmasını ya ölçme hızlı ve hassas bir yöntemdir. Burada geçirgenlik çalışmaları için bağırsak keseleri hazırlanması ve belirgin geçirgenlik (P app) hesaplanmasını tarif intestinal bariyer boyunca bir molekülün. Bu teknik değerlendirme ilaç emiliminin bir yöntem olarak kullanılabilir, ya da gastrointestinal hastalıkların hayvan modellerinde bölge epitelyal bariyer yetmezliği incelemek.

Bu protokol, mide-bağırsak hastalığının hayvan modellerinde intestinal bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler incelemek için kullanılabilir. Gastrointestinal sistemin 7 değişen alanlarında mukozal yüzeyi boyunca paraselüler prob akışı ölçülerek, epitelyal sıkı bütünlüğü değerlendirilebilir. Buna ek olarak, boyut (Şekil 2) ya da hidrofob (Şekil 3), epitelyal pertürbasyon derecesi ya da mukoza jel tabakasının bütünlüğünün paraselüler prob doğasını değiştirmek suretiyle de ölçülebilir. Daha büyük molekül ağırlıklı işaretleyiciler uygulayan bu transepitelyal elektrik direnci (TEER) halinde elektrofizyolojik ölçümlerle anlaşılacaktır olmayabilir gizli değişiklikleri tespit edilmesi, mukoza paraselüler geçirgenliğinin daha hassas bir sorgulama için sağlar, fakat paraselüler taşıma izin vermek için yeterli olacaktır (Şekil 2). Mucosal inflamasyon normalde örter ve epitel arayüzü koruyan koruyucu mukus jel bir goblet hücrelerinin kaybı ve azalmasına yol açabilir. Hidrofobik problar kullanılarak, bağırsak mukus jel tabakası bütünlüğü de (Şekil 3) incelenebilir. Buna ek olarak, bölgesel bariyer bütünlüğü farklı bağırsak alanlardan bağırsak keseleri özel hazırlık yoluyla incelenebilir. Bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler, hastalığın farklı hayvan modellerinde içinde değişebilir ve sondaların oral gavaj ve daha sonra, serum tahlile göre, böylece, bağırsak keselerinin kullanımı, intestinal bariyer fonksiyonunun bir lokalize değerlendirmesi (Şekil 4) sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53250/53250fig1.jpg" /> Murin gastrointestinal Şekil 1. diyagramı. Bir C57BL / 6 faresinin mide bağırsak yolunun şematik bir mide tO anüs. ince bağırsak kavşaklar kolayca makroskopik ayırt edilemez ve tutarlı örnekleme fare varyasyon için fareyi aza indirmeye yardımcı olur. Bağırsak keseleri oluşturmak amacıyla, pilorik sfinkterin bir 5 cm kademeli bir uzak duodenum içerecektir. çekum proksimal uzanan 10 cm uzunluğunda ileum içerecek. Kalan ince bağırsak doku jejunum temsil eder. Rektum kolon 8 temsil çekum uzanan, kalan kalın bağırsak ile anüs 2 cm proksimalinde yer almaktadır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53250/53250fig2.jpg" /> Şekil 2. &#160; FITC Dextran&#39;ın moleküllerin büyüklüğü bağımlı parasellüler taşıma kontrol ve DSS kolit anima epitel mukozasında rağmenLS. Bağırsak keseler 10 gün hastalığın seyri DSS farelerin kolon hazırlanmıştır. Keseler 120 dakika boyunca ölçülmüştür FITC Dekstran geçirgenliği marker 1 mg / FD-4 (MW 4,400 Da) ml çözelti, FD-20 (MW 20.000 Da) ya da FD-70 (70,000 Da) ve akı ile yüklendi. Sağlıklı hayvanlar uyumlu Yaş kontroller olarak kullanılmıştır. N = 5, N. başına 2 teknik çoğaltır ** p &lt;0.01, Student t-testi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53250/53250fig3.jpg" /> Şekil 3 :. Hidrofobik bileşiklerin bariyer bütünlüğünü mukoza-jel tabakasının etkisi. Bağırsak keseler 10 gün hastalığın seyri DSS farelerin kolon hazırlanmıştır. Sağlıklı hayvanlar uyumlu Yaş kontroller olarak kullanılmıştır. Negatif mukus jel kontrolü için, bağırsaklar10 mM N-asetil sistein (NAC) (bağırsak 5 cm başına 300 ul hacim) ile yüklendi ve 37 ° C&#39;de inkübe edildi 15 dakika boyunca C ° ve keseler hazırlandı önce taze ortam ile temizlendi. Keseler 120 dakika boyunca ölçülen 1 mg / ml FD-4 çözeltisi (MW 4.400 Da) ve akı ile yüklendi. N = 3, N. * p &lt;0.05 başına 2 teknik çoğaltır, ** p &lt;0.01, Student t-testi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53250/53250fig4.jpg" /> Şekil 4. bağırsak iltihabı murin modellerinde FD-4 bağırsak bölge geçirgenliği. Bağırsak keseleri sağlıklı hayvanlarda DSS hayvan veya antibiyotik kaynaklı dysbiosis (AID) hayvan jejunum, ileum veya kolon hazırlanmıştır. Keseler 1 mg FD-4 / ml solüsyon ile yüklendi (MW 4.400 Da) ve flux 120 dakika boyunca ölçtü. N = 3, N. * p &lt;0.05 başına 2 teknik çoğaltır, ** p &lt;0.01, Student t-testi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease at JoVE.com

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

ex-vivo-intestinal-sacs-to-assess-mucosal-permeability-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

20.9K Görüntüleme.  University of Newcastle. This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Video: Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Gelişim Biyolojisi

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Tıp

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. Therefore, the intestinal mucosa of anesthetized mice is topically stained with unspecific staining (acriflavine) and a fluorescent tracer (rhodamine-B dextran), mounted on a saline solution-rinsed plate and directly imaged using a confocal microscope. This technique can complement other non-invasive techniques to identify leakage of intestinal permeability, such as transmucosal passage of orally administered tracers. Besides this, the approach presented here allows the direct observation of cell shedding events at real-time. In combination with appropriate fluorescent reporter mice, this approach is suitable for shedding light into cellular and molecular mechanisms controlling intestinal epithelial cell extrusion, as well as to other biological processes. In the last decades, interesting studies using intravital microscopy have contributed to knowledge on endothelial permeability, immune cell gut homing, immune-epithelial communication and invasion of luminal components, among others. Together, the protocol presented here would not only help increase the understanding of mechanisms controlling epithelial cell extrusion, but could also be the basis for the developmental of other approaches to be used as instruments to visualize other highly dynamic cellular process, even in other tissues. Among technical limitations, optical properties of the specific tissue, as well as the selected imaging technology and microscope configuration, would in turn, determine the imaging working distance, and resolution of acquired images.

Taking advantage of intravital microscopy, the method presented here enables real-time visualization of intestinal epithelial cell shedding in living animals. Therefore, topically stained intestinal mucosa (acriflavine and rhodamineB-dextran) of anesthetized mice is imaged up to single-cell resolution using confocal microscopy.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown in the basolateral-out (BO) conformation, where the apical surface of the epithelial cell faces the inner lumen. In this model, access to the luminal surface of enteroids for treatment and experimentation is challenging, which limits the ability to study host-pathogen interactions. To circumvent this, a neonatal apical-out (AO) model for necrotizing enterocolitis was created. Since intestinal epithelial cell permeability changes are pathognomonic for NEC, this protocol outlines using lucifer yellow (LY) as a marker of paracellular permeability. LY traverses the intestinal epithelial barrier via all three major paracellular pathways: pore, leak, and unrestricted. Using LY in an AO model allows for a broader study of permeability in NEC. Following IRB approval and parental consent, surgical samples of intestinal tissue were collected from human preterm neonates. Intestinal stem cells were harvested via crypt isolation and used to grow enteroids. Enteroids were grown to maturity and then transformed AO or left in BO conformation. These were either not treated (control) or were treated with lipopolysaccharide (LPS) and subjected to hypoxic conditions for the induction of in vitro NEC. LY was used to assess for permeability. Immunofluorescent staining of the apical protein zonula occludens-1 and basolateral protein &#946;-catenin confirmed AO conformation. Both AO and BO enteroids treated with LPS and hypoxia demonstrated significantly increased paracellular permeability compared to controls. Both AO and BO enteroids showed increased uptake of LY into the lumen of the treated enteroids compared to controls. The utilization of LY in an AO enteroid model allows for the investigation of all three major pathways of paracellular permeability. It additionally allows for the investigation of host-pathogen interactions and how this may affect permeability compared to the BO enteroid model.

The present protocol outlines a method that utilizes lucifer yellow in an apical-out enteroid model to determine intestinal permeability. This method can be used to determine paracellular permeability in enteroids that model inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis.

Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Biyoloji

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier impairment has been associated with the development of various pathologies such as inflammatory bowel diseases (IBD). In the inflamed mucosa, superficial erosions or micro-erosions that corrupt epithelial monolayers correspond to sites of high permeability. Several mechanisms have been implicated in the formation of micro-erosions including cell shedding and apoptosis. These micro-erosions often represent microscopic epithelial gaps randomly distributed in the colon. Visualization and quantification of those epithelial gaps has emerged as an important tool to investigate intestinal epithelial barrier function. Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa. Additional use of cell death markers revealed that HPR encompass apoptotic foci where epithelial extrusion/shedding occurs. The protocol described here provides a simple but effective approach to visualize and quantify micro-erosions in the intestine, which is a very useful tool in disease models, in which the intestinal epithelial barrier is compromised.

Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa.

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of plasma inflammatory markers and bacterial translocation to the spleen and lymph nodes, the gold standard directly quantifies the ability of selected molecules to traverse the gut mucosal layer toward systemic circulation. This article uses a non-invasive, cost-effective, and low-burden technique to quantify and follow in real time the intestinal permeability in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran (FITC-dextran). Prior to oral supplementation with FITC-dextran, the mice are fasted. They are then gavaged with FITC-dextran diluted in phosphate-buffered saline (PBS). One hour after the gavage, the mice are subjected to general anesthesia using isoflurane, and the in vivo fluorescence is visualized in an imaging chamber. This technique aims to assess residual fluorescence in the abdominal cavity and the hepatic uptake, which is suggestive of portal migration of the fluorescent probe. Blood and stool samples are collected 4 h after oral gavage, and the mice are sacrificed. Plasma and fecal samples diluted in PBS are then plated, and the fluorescence is recorded. The concentration of FITC-dextran is then calculated using a standard curve. In previous research, in vivo imaging has shown that fluorescence rapidly spreads to the liver in mice with a weaker gut barrier induced by a low-fiber diet, while in mice supplemented with fiber to strengthen the gut barrier, the fluorescent signal is retained mostly in the gastrointestinal tract. In addition, in this study, control mice had elevated plasma fluorescence and reduced fluorescence in the stool, while inversely, inulin-supplemented mice had higher levels of fluorescence signals in the gut and low levels in the plasma. In summary, this protocol provides qualitative and quantitative measurements of intestinal permeability as a marker for gut health.

In the present study, fluorescein-isothiocyanate-labeled (FITC) dextran is administered to mice via oral gavage to evaluate intestinal permeability both in vivo and in plasma and fecal samples. As gut barrier function is affected in many disease processes, this direct and quantitative assay can be used in diverse research areas.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Parafin Gömülü 3 Boyutlu Bağırsak Mukoza Modelinin Yapımı

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Yazar Spotlight: 3D İnsan Hücre Hattı Modellerini Kullanarak Bileşiklerin Bağırsak Dokusu Üzerindeki Etkilerinin Araştırılması 

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...