This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.

이 프로토콜의 모든 동물의 작업 절차를 승인 뉴캐슬 동물 윤리위원회의 대학 엄격하게 준수하여 수행됩니다. 악기, 문화 미디어와 요리 1. 준비 <ol><li> 37 미리 따뜻한 미디어 199 (TC199) 또는 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 미디어 기음. 사전 네이트 95 %, O2 / 5 % CO 2로 버블 링하여 매체. 매체가 7.3의 최종 pH가 있는지 확인합니다. </li><li> 각 주머니 두 5cm 섹션을 절단하여 봉합을 준비합니다. 루프 닫히지 않은 매듭에 봉합. </li></ol> 2. 해부 및 위장관의 제조 <ol><li> 안락사 전에 고체 음식을 12 시간 인출. 원하는 경우,이 기간 동안 영양 젤 보충에 동물을 배치합니다. </li><li> 나트륨 펜토 바르비 과다 복용에 의한 쥐를 안락사 ([200 ㎎ / ㎏, 복강 내 주사) 기관 윤리 프로토에 따라 자궁 경부 전위 다음COLS는 복부와 흉부에 70 % 에탄올을 스프레이. </li><li> 가위 사용하여 복부의 중앙에 수평 절개를하고 복막을 노출. </li><li> 분리 유문 괄약근의 위의 상부 소장을 절단하고 항문에서 대장을 절단하여 위장관을 제거하기 위해 진행합니다. 부드럽게 장간막을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 미리 예열, 산소 매체의 창자를 놓습니다. </li><li> 소장의 부분을 식별하는 투과성 (그림 1)에 대한 평가 및 장관의 나머지에서 무료로이 부분을 절단한다. <ol><li> 동물 사이의 일관성을 유지 위장, 십이지장 및 소장의 상대적인 부분을 측정하고, 맹장 및 결장 회장 상대적인 부분을 측정하기 위해. </li><li> 조직 세그먼트를 선택하는 경우, 이러한 패치 파이어 등 점막 - 관련 림프 조직의 존재를 참고. 이러한 작은 끄덕임으로 식별 될 수있다루멘의 장막 측 ules. </li><li> 1 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 예열 PBS (37 ° C)와 페트리 접시에 장 세그먼트의 내강 내용을 세척하십시오. 이 대변 내용에 폐기되거나 저장 될 수 -80 원하는대로 향후 분석을 위해 C를 °. </li></ol></li></ol> 장내 주머 니나 3. 준비 <ol><li> 시험 화합물 또는 분자의 300 μL 부피 1 mL를 주사기를 준비한다. 점막의 무결성, FITC - 덱스 트란 M.Wt.의 1 ㎎ / ㎖ 솔루션 4400이 사용될 수있다. 4,400-70,000 다에서 크기에 이르기까지 프로브가 증가 감도를 사용할 수있다. 안전하게 주사기에 작은 동물 혈관 카테터를 장착한다. </li><li> 장 세그먼트의 오프닝에서 5cm 측정 및 세그먼트를 묶어 안전하게이 시점에서 봉합 루프로 마감했다. 조심스럽게 소장의 개구부 주위에 미리 연결 봉합 루프를 배치하고 무딘 카테터를 삽입합니다. 장 세그먼트를 확보 할 수 있도록 폐쇄 올가미를 당겨모든 용액을 주입 보장, 소장에 주사기에서 300 μl의 볼륨을 놓습니다. </li><li> 동시에 장 낭의 폐쇄를 고정 봉합 올가미를 잡아 당기면서 부드럽게 카테터를 제거합니다. 소장에서 느슨한 장 주머니를 잘라 37로 예열 산소 매체의 20 ㎖로 가득 50 ML 원뿔 관에 배치 기음. </li></ol> 투수 4. 측정 <ol><li> 가열 된 물을 욕조에 장 주머니를 포함 장소 원뿔 튜브는 37로 설정 기음. 0, 30, 60, 90 및 120 분의 시점에서, 각각의 인스턴스에 신선한 매체와 함께 100 ㎕의 부피를 대체하는 96 웰 플레이트 원뿔 튜브 및 전송에서 100 μL 샘플을 취할. </li><li> 최종 샘플을 취한 후, 점막 표면을 노출시키는, 봉합사 시점과 세그먼트의 길이 아래로 열린 주머니를 잘랐다. </li><li> 각 장 세그먼트의 길이 및 폭을 측정한다. 다목적 경우빨강, 스냅 -80에서 세그먼트 저장을 동결 분자 분석을위한 RNA 안정화 용액에서 단백질 또는 생화학 적 분석, 또는 대안 적으로, 상점에 대한 C를 °. </li><li> 1 1 × 10 -6까지 FITC-태그 분자 로그 희석의 표준 곡선을 구축합니다. </li><li> 형광 플레이트 리더에 FITC에 대한 측정 시료와 표준, FITC 여기 / 방출 / 519 내지 495 나노 미터. </li></ol> 각 개인 소장 골목에 대한 명백한 투수 5. 계산 <ol><li> 초에 시간 단위로 변환합니다. </li><li> 각 타임 포인트에 대한 누적 농도, Q를 계산할 Q의 t = (C t의 *의 V r에) + (Q t 합 * V s의), 장소 : Q의 t = 시간 t에서 누적 농도 C의 t = 시간 t에서의 농도 수신 측에서 V의 R = 볼륨 이전의 모든 Q의 t의 Q T는 합계 = 합계 V S =볼륨 샘플링 </li><li> 플롯 시간 (T) 대 Q 및 기울기를 계산 : δQ / ΔT </li><li> 명백한 투과성을 계산 (P 응용 프로그램) P 앱 = (δQ / ΔT) / (A * 공동), 장소 : 조직의 면적 A = C 0 = 초기 농도 </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여기서는 점막 장벽 기능 생체을 평가 단리 장내 주머니의 제조 상세한있다. 소장 SAC 제제는 주로 소장 전체 후보 약물의 흡수를 시험하는 제약 연구에서 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석은 동일하게 장 질환의 연구를 위해 적합하다. 지역 및 투과성의 사이트에 특정 평가에 따라 크게 다를 수 있습니다 장 투과성은 소화 질환 점막의 무결성의 지역 중요성에 대한 이해를 할 수 있습니다. 분석은 강력하고 정확한 생리 학적 조건에서, 고립 된 조직은 최대 6 시간의 사후에 대한 실행 가능한 남아있다. 안락사 후, 티슈 제조 속도가 중요하며, 소장은 그 내용 플러시 가능한 한 신속하게 산소 매체에 전사한다. 동물들 사이의 일관성을 확보하기 위해서는 정확한 장 영역 identifi 것을 필수에드 (그림 1). 십이지장과 공장의 세그먼트가 뱃속에서 측정하는 동안 대장과 회장 세그먼트, 맹장에서 측정하는 것이 좋습니다. 다른 균주 또는 형질 전환 동물 모델이 커야하고 GITS 이상을 가질 수 있기 때문에, 투과 검정에 참여하기 전에 모델의 평균 길이 또는 각각의 장 구간 특성을 가치가있다. 지역 일관성 또한, 각 장 SAC가 동일 길이로 절단되어 SAC가 유체의 정확한 부피 충전하는 것이 중요하다. 이러한 요소의 불일치는 분석 사이의 점막의 불평등 팽창가 발생합니다. 밑에 팽창 장 세그먼트뿐만 점막 표면 내강 콘텐츠 노출을 줄일뿐만 아니라, 마커 이동해야되는 조직의 두께를 증가시킨다. 오버 팽창 조직에 스트레스 반응을 조직을 손상 시키거나 활성화시킬 수있다 세그먼트, 잠재적으로 공동의nfounding 결과. P 앱의 계산은 융모 구조의 표면적을 고려하지 않습니다에 대한 것을 주목해야한다. 이 조직의 실제 명백한 투과성을 계산 오차로 연결하면서 표면적 상수로 계산 될 때, 그것은 모델 간의 비교 결과에 영향을 미치지 않는다. 인한 질병 표면적 변경 상피 완전성 상실로 상쇄되고 프로토콜 질병 진행 (6) 투과율의 변화를 식별하기에 충분히 견고하다. 조직 배양 배지의 사용을 권장합니다. 바르 등의 연구가 수행된다. TC199의 사용은 단순 염 버퍼 (9)에 비해 유의하게 생존 상피 조직 학적 구조의 수명을 증가시킬 것으로 밝혀졌다. 우리의 연구에서 DMEM과 TC199 두 매체는 37로 유지 ° C는 조직의 생존 5,6,10-을위한 최적의 조건을 제공했다. 올바른 미디어분석 기간 동안 온도를 유지하는 것이 필수적 꽉 접합부 무결성 및 세포 횡단 경로를 통해 능동 수송과 관련된 분석이다 최적의 조직 신진 대사를 보장하면서, 조직의 무결성을 유지하는 데 필요한 영양소와 상피를 제공합니다. 37 이하의 온도 조직 생존의 ° C 원인 손실, paracellular 전송을 증가시키고 세포 횡단 수송 (11)을 감소시킨다. 따라서, 최적의 조건으로 조직 생존을 연장하는 것이 필수적이며, 그렇게함으로써, 분석은 지역 배리어 무결성을 검사 할뿐만 아니라 이용 될 수 있지만, 또한 간섭 연구 및 생리적 전사 반응을 조사. 주로 약물 흡수 연구에 사용하지만, 기술은 상피 장벽을 가로 질러 마커 분자의 명백한 침투성 (P 앱) 검사 장 무결성 12-15의 고감도 측정합니다. 반면 대리하는 생체 방식 측정같은 봉사자 등의 장벽 기능의 국세청, P 앱은 장 장벽 (4)의 직접적이고 매우 민감한 측정합니다. 이 마커 분자의 P 앱 의해 측정 티이 측정 및 투과율이 항상 상관하지 않는 것이 주목할 가치가있다. 티이 측정 단단한 접합부 및 세포 횡단 병렬 저항기 (16) 양자의 저항을 포함한다. 따라서 티이 단단히 접합 및 세포 자체에 의해 제공되는 합성 저항의 측정이다. 세포 간 연결이 약한 경우, 단분자막의 전체 저항이 기여도가 낮은 것 (즉, 엄격한 접합 누설이있다). 따라서 누설 상피 타이트 접합부 저항의 작은 변화가 전체 상피의 저항을 무시할 변경된다. 반면, P 앱 분석은 실제로 점막 장벽 (17)을 통과하고있는 분자의 능력을 알 수있다 P 앱 측정의 민감도를 측정다른 크기의 마커 분자를 (그림 1) 선택을 통해이 거행. 마커 크기 고려 대상인 장 질환 모델에 관하여 중요하다. 무결성의 손실은 중간에 온화 알레르기 또는 기능적 질환 18, 19, 모델은 장 장벽 기능에 미묘한 변화의 확인을 수 저 분자량 마커에 더 적합 할 수있다. 대조적으로, 같은 장내 상피 denuding 포함 DSS 대장염과 같은 모델 큰 마커 배리어 무결성 비교적 작은 증가가 강조되는 바와 같이, 점막 치유를 평가하는 것이 더 적절할 수있다. 장내 주머니가 GI 보호막 기능의 생리 학적 관련성 모델을 제공하지만, 고려해야 할 동물 모델의 변동에 대한 일부 제한이있다. 예를 들어, 분비 된 상태 또는 상피 INTES 걸쳐 모두 paracellular 수송에 영향을 미칠 수있다가지 (20) 및 점막 겔 층 (5)의 무결성. 이러한 Ussing 챔버 준비 등의 전기 생리 측정을 통합 생체 분석은,이 차지하고 수 있지만, 장 낭하지 않습니다. 둘째, 이들 조직 (21)의 투과성에 영향을 미칠 수 있으므로, SAC 제제 내에 그러한 파이어 패치 등 림프 구조를 설명한다 장내 주머니 연구자 준비. 이러한 고려 사항에도 불구하고, 상피 완전성을 평가하는 데 많은 세포 배양 모델 달리 장 점액 낭은 겔 층 및 하부 고유 층 양쪽의 기여를 제공한다. 점액 겔층의 기여는, 특히, 덱사메타손 5,17와 같은 N- 아세틸 시스테인 또는 트레이서 소수성 분자로서 mucolytic 에이전트의 사용을 통해 평가 될 수있다. 이 승, 암 치료 또는 염증성 장 질환의 모델에서 장 투과성을 평가하는데 특히 중요 할 수있다여기 점막 장벽의 손실은 점막 염증 22, 23의 초기 병리 될 수 있습니다. 마찬가지로, 설사 질환, 기능성 위장관 질환이나 dysbiosis, 장 점액 생산 및 전체 점액 젤의 무결성 모델에서 지역 사이트 5,19,24에서 변경 될 수있다. 투과성 마커 이후의 혈청 샘플의 구강 투여는 생체 내에서 장 투과성을 평가하기위한 또 다른 방법입니다. 이 방법은 조직의 최소 조작을 하였지만, 그것은 장내 장벽 기능의 복합 계수이며 전체 장벽 지역 기여도를 평가하지 않는다. GI 질환의 다른 모델은 구강 투여 방법에 의해 설명 될 수 없습니다 상대적 중요성의 다른 사이트가있는 것 같다. 장내 주머니를 사용하므로 작은 동물 질환 모델에서의 지역 장 점막의 무결성을 검사하는데 사용될 수있는 신속한 감지 및 관련 생리 학적 검정이다.

위장관 장 상피 장벽 인간 성인 400 평방 미터로 추정 점막 표면적이다. 따라서, 지속적 미생물 섭취 약물, 영양분 및 박테리아 독소의 도전에 노출된다. 호스트는 허용 공생 박테리아 병원균 구분하지해야하지만 동시에 영양소 흡수를 허용하면서, 상피 장벽을 넘어에서 이러한 종의 분자 및 분비를 방지한다. 따라서, 장 상피 세포의 역할은 내강 내용 1 선택적 장벽으로 작용한다. 이 구성 적 및 유도 메커니즘이 이루어진 반응 시스템을 통해 생물학적 작용 점막 상피에서 타고난 방어 시스템에 의해 부분적으로 달성된다. 상피 장벽 기능의 상실은 위장관 질환의 특징 인 다수의 병리이다. 생체를상피 장벽 기능의 검사는 추적 분자의 구강 투여 이후 혈청 분석 (3)를 통해 평가 될 수있다. 그러나,이 기술은 장벽 기능 장애의 사이트에 같은 징후를 제공하지 않습니다. 생체 외 및 트랜스 웰 시스템 (3)를 사용하여 각각 챔버 4,5 Ussing transepithelial 저항의 생체 평가에서 일반적으로 상피 장벽 기능의 대리 지표로 사용하지만, 동물 모델 (6)의 기여 질병 생리학 부족합니다. 이 프로토콜에서는 다수의 레벨에서 점막 장벽 기능을 평가하는데 사용될 수있다 장 무결성 및 직접 지역화 평가 수 생체 조직 준비 모델을 설명한다. 중요한 것은,이 방법은 질환의 동물 모델에 적용 할 수 있거나, 또는 그의 약학 적 점막 방벽 기능 부전의 깊이 질의에서 허용하도록 조작 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&amp;nbsp; Non-absorbable Silk suture</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>No phenol red as this interferes with fluorescence</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>No phenol red as this interferes with fluorescence</td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Use at 10 mM in media</td></tr><tr><td>Small animal vascular cathether: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4,400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20,000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70,000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo intestinal sacs to assess mucosal permeability in models of gastrointestinal disease

상피 장벽 위장관 제 타고난 방어 선택적 작은 상피 걸쳐 분자와 거의 상피 고분자 전송 금지의 이동을 제한하는 하부 조직 구획 루멘으로부터 수송을 조절한다. 이 선택은 친 유성 분자 양쪽 정점 수용체 상피 단단한 접합부 단백질 복합체의 전송을 제한 점액 겔 층에 의해 결정된다. 상피 세포의 시험 관내 세포 배양 모델은 편리하지만, 모델, 그들은 부족한 미생물, 점액 젤, 상피 세포와 면역 체계 사이의 상호 작용의 복잡성. 한편, 사이트 특이성 표시없이 장내 흡수 또는 투과율의 생체 내 평가를 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 전체 위장관 흡수를 측정한다. 생체 외 투과 검정을 &quot;장 주머니&quot;를 사용하여; 장 사이트 특이성의 추가적인 장점으로, 전체 장 무결성 또는 특정 분자의 비교 수송를 측정하는 신속하고 민감한 방법입니다. 여기에서 우리는 투과성 연구를위한 장 주머니의 준비 및 명백한 투자율 (P 응용 프로그램)의 계산을 설명 장 장벽을 가로 지르는 분자. 이 기술은 평가 약물 흡수의 방법으로 사용할 수도 있고, 위장관 질환의 동물 모델에서의 지역 상피 장벽 기능 장애를 조사.

이 프로토콜은 위장 질환의 동물 모델에서 장 장벽 기능 지역적 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다. 위장관 (7)의 다양한 영역에서의 점막 표면에 걸쳐 paracellular 프로브의 유량을 측정함으로써, 상피 꽉 접합 무결성을 평가할 수있다. 또한, 크기 (도 2) 또는 소수성 (도 3), 상피 섭동의 정도 또는 점막 겔층의 무결성을 paracellular 프로브의 특성을 변화시킴으로써,도 측정 할 수있다. 더 큰 분자량 마커를 사용하는 등 transepithelial 전기 저항 (봉사자) 등의 전기 생리 측정에 의해 명백하지 않을 수 있습니다 신중한 변화를 감지, 점막의 paracellular 침투성의 더 민감한 심문을 허용하지만, 어떤 paracellular 전송을 허용하기에 충분하다 (그림 2). 뮤코샐 염증은 일반적으로 위에 놓 및 상피 인터페이스를 보호하는 보호 점액 젤의 배 세포의 손실 감소로 이어질 수 있습니다. 소수성 프로브를 사용하여, 장내 점막 겔층의 무결성도 (도 3)을 조사 할 수있다. 또한, 지역 장벽 완전성 다른 장 영역에서 장내 주머니의 특정 제제를 통해 조사 할 수있다. 장벽 기능의 지역 변경 질환의 다양한 동물 모델 내에서 변화 및 프로브의 구강 투여 이후 혈장 분석에 비해 따라서, 장내 낭의 사용은, 장 장벽 기능의 국부적 평가 (도 4)을 허용한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53250/53250fig1.jpg" /> 쥐 위장관 그림 1. 다이어그램. C57BL / 6 마우스의 위장관의 개략도, 위장에서이 t합니다그는 항문. 소장 접합 쉽게 육안으로 구별 할 수없는 일관된 샘플링은 마우스의 변화에​​ 마우스를 최소화하는 데 도움이됩니다. 장내 주머니를 만드는 목적 유문 괄약근에 5cm 세그먼트 말단은 십이지장을 포함한다. 맹장에서 근위 연장 10cm 섹션은 회장을 포함합니다. 나머지 소장 조직은 공장을 나타냅니다. 직장은 대장 (8)을 나타내는 맹장까지 연장, 나머지 대장과 항문에 2cm의 근위부에 위치해 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53250/53250fig2.jpg" /> 그림 2. &#160; FITC-덱스 트란 분자의 크기에 의존 paracellular 전송 제어 및 DSS 대장염의 애니 마에서 상피 점막하지만LS. 창자 주머니는 십일 질병의 과정에 DSS 마우스의 콜론에서 제조 하였다. 주머니는 120 분에 걸쳐 측정 된 FITC-덱스 트란 투과성 마커의 1 밀리그램 / FD-4 (MW 4400 다) ml의 용액, FD-20 (MW 20,000 다) 또는 FD-70 (70,000 다) 및 플럭스로드되었다. 건강한 동물 유사한 연령 대조군으로 사용 하였다. N = 5, N. 당 2 기술 복제 ** p &lt;0.01, 학생의 t-test를. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53250/53250fig3.jpg" /> 그림 3 :. 소수성 화합물에 대한 장벽의 무결성 점액 - 겔 층의 영향. 소장 주머니는 십일 질병의 과정에 DSS 쥐의 결장에서 제조 하였다. 건강한 동물 유사한 연령 대조군으로 사용 하였다. 음의 점액 - 겔 제어를 위해, 창자10 mM의 N- 아세틸 시스테인 (NAC) (소장의 5cm 당 300 μL 볼륨)와로드 (37)에서 배양 하였다 15 분 동안 C를 °와 주머니가 준비되기 전에 신선한 매체와 플러시. 주머니는 120 분에 걸쳐 측정 1 ㎎ / ㎖의 FD-4의 용액 (MW 4400 다) 및 플럭스로드되었다. N = 3, N.의 *의 P &lt;0.05 당 2 기술 복제, ** p &lt;0.01, 학생의 t-test를. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53250/53250fig4.jpg" /> 그림 4. 장 염증의 쥐 모델에서 FD-4 장의 지역 침투성. 소장 낭은 건강한 동물, DSS 동물 또는 항생제 유발 dysbiosis (AID) 동물의 공장, 회장 또는 결장에서 제조 하였다. 주머니가 1 mg의 FD-4 / ㎖의 용액으로로드 된 (MW 4400 다)와 F럭스는 120 분에 걸쳐 측정했다. N = 3, N.의 *의 P &lt;0.05 당 2 기술 복제, ** p &lt;0.01, 학생의 t-test를. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53250/53250fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

ex-vivo-intestinal-sacs-to-assess-mucosal-permeability-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

20.9K 조회수.  University of Newcastle. This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

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Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

연구

발생학

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

의학

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. Therefore, the intestinal mucosa of anesthetized mice is topically stained with unspecific staining (acriflavine) and a fluorescent tracer (rhodamine-B dextran), mounted on a saline solution-rinsed plate and directly imaged using a confocal microscope. This technique can complement other non-invasive techniques to identify leakage of intestinal permeability, such as transmucosal passage of orally administered tracers. Besides this, the approach presented here allows the direct observation of cell shedding events at real-time. In combination with appropriate fluorescent reporter mice, this approach is suitable for shedding light into cellular and molecular mechanisms controlling intestinal epithelial cell extrusion, as well as to other biological processes. In the last decades, interesting studies using intravital microscopy have contributed to knowledge on endothelial permeability, immune cell gut homing, immune-epithelial communication and invasion of luminal components, among others. Together, the protocol presented here would not only help increase the understanding of mechanisms controlling epithelial cell extrusion, but could also be the basis for the developmental of other approaches to be used as instruments to visualize other highly dynamic cellular process, even in other tissues. Among technical limitations, optical properties of the specific tissue, as well as the selected imaging technology and microscope configuration, would in turn, determine the imaging working distance, and resolution of acquired images.

Taking advantage of intravital microscopy, the method presented here enables real-time visualization of intestinal epithelial cell shedding in living animals. Therefore, topically stained intestinal mucosa (acriflavine and rhodamineB-dextran) of anesthetized mice is imaged up to single-cell resolution using confocal microscopy.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

면역학 및 감염병학

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown in the basolateral-out (BO) conformation, where the apical surface of the epithelial cell faces the inner lumen. In this model, access to the luminal surface of enteroids for treatment and experimentation is challenging, which limits the ability to study host-pathogen interactions. To circumvent this, a neonatal apical-out (AO) model for necrotizing enterocolitis was created. Since intestinal epithelial cell permeability changes are pathognomonic for NEC, this protocol outlines using lucifer yellow (LY) as a marker of paracellular permeability. LY traverses the intestinal epithelial barrier via all three major paracellular pathways: pore, leak, and unrestricted. Using LY in an AO model allows for a broader study of permeability in NEC. Following IRB approval and parental consent, surgical samples of intestinal tissue were collected from human preterm neonates. Intestinal stem cells were harvested via crypt isolation and used to grow enteroids. Enteroids were grown to maturity and then transformed AO or left in BO conformation. These were either not treated (control) or were treated with lipopolysaccharide (LPS) and subjected to hypoxic conditions for the induction of in vitro NEC. LY was used to assess for permeability. Immunofluorescent staining of the apical protein zonula occludens-1 and basolateral protein &#946;-catenin confirmed AO conformation. Both AO and BO enteroids treated with LPS and hypoxia demonstrated significantly increased paracellular permeability compared to controls. Both AO and BO enteroids showed increased uptake of LY into the lumen of the treated enteroids compared to controls. The utilization of LY in an AO enteroid model allows for the investigation of all three major pathways of paracellular permeability. It additionally allows for the investigation of host-pathogen interactions and how this may affect permeability compared to the BO enteroid model.

The present protocol outlines a method that utilizes lucifer yellow in an apical-out enteroid model to determine intestinal permeability. This method can be used to determine paracellular permeability in enteroids that model inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis.

정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

생물학

Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier impairment has been associated with the development of various pathologies such as inflammatory bowel diseases (IBD). In the inflamed mucosa, superficial erosions or micro-erosions that corrupt epithelial monolayers correspond to sites of high permeability. Several mechanisms have been implicated in the formation of micro-erosions including cell shedding and apoptosis. These micro-erosions often represent microscopic epithelial gaps randomly distributed in the colon. Visualization and quantification of those epithelial gaps has emerged as an important tool to investigate intestinal epithelial barrier function. Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa. Additional use of cell death markers revealed that HPR encompass apoptotic foci where epithelial extrusion/shedding occurs. The protocol described here provides a simple but effective approach to visualize and quantify micro-erosions in the intestine, which is a very useful tool in disease models, in which the intestinal epithelial barrier is compromised.

Here, we describe a new method to visualize the specific location of where transcellular and paracellular permeability is enhanced in the inflamed colonic mucosa. In this assay, we apply a 10 kDa fluorescent dye conjugated to a lysine fixable dextran to visualize high permeability regions (HPR) in the colonic mucosa.

Epithelial cells lining the intestinal mucosa create a physical barrier that separates the luminal content from the interstitium. Epithelial barrier ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of plasma inflammatory markers and bacterial translocation to the spleen and lymph nodes, the gold standard directly quantifies the ability of selected molecules to traverse the gut mucosal layer toward systemic circulation. This article uses a non-invasive, cost-effective, and low-burden technique to quantify and follow in real time the intestinal permeability in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran (FITC-dextran). Prior to oral supplementation with FITC-dextran, the mice are fasted. They are then gavaged with FITC-dextran diluted in phosphate-buffered saline (PBS). One hour after the gavage, the mice are subjected to general anesthesia using isoflurane, and the in vivo fluorescence is visualized in an imaging chamber. This technique aims to assess residual fluorescence in the abdominal cavity and the hepatic uptake, which is suggestive of portal migration of the fluorescent probe. Blood and stool samples are collected 4 h after oral gavage, and the mice are sacrificed. Plasma and fecal samples diluted in PBS are then plated, and the fluorescence is recorded. The concentration of FITC-dextran is then calculated using a standard curve. In previous research, in vivo imaging has shown that fluorescence rapidly spreads to the liver in mice with a weaker gut barrier induced by a low-fiber diet, while in mice supplemented with fiber to strengthen the gut barrier, the fluorescent signal is retained mostly in the gastrointestinal tract. In addition, in this study, control mice had elevated plasma fluorescence and reduced fluorescence in the stool, while inversely, inulin-supplemented mice had higher levels of fluorescence signals in the gut and low levels in the plasma. In summary, this protocol provides qualitative and quantitative measurements of intestinal permeability as a marker for gut health.

In the present study, fluorescein-isothiocyanate-labeled (FITC) dextran is administered to mice via oral gavage to evaluate intestinal permeability both in vivo and in plasma and fecal samples. As gut barrier function is affected in many disease processes, this direct and quantitative assay can be used in diverse research areas.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

파라핀 Embedding을 이용한 3D 장 점막 모델 구축

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사 

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...