Name: differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line
Uploaded: 2016-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
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We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1. Allgemeine Überlegungen <ol><li> Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für eine Liste der notwendigen Reagenzien. Führen Sie alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen. </li><li> Verwenden hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (hiFBS) für alle Medien Zubereitungen, die FBS enthalten. Zu erwärmen-Inaktivierung bei 56 ° C für 30 min ein 50 ml Aliquot von FBS erwärmen, alle 10 min invertierenden (siehe auch Tabelle 1). Hinweis: Wenn FBS ohne Hitzeinaktivierung verwendet wird, die epithelial-ähnlichen Phänotyp schneller ganzen Kulturen von SH-SY5Y-Zellen fortschreitet. </li><li> Vor dem Gebrauch, um die Medien in einem Inkubator zu wärmen und Gleichgewicht vor jedem Schritt eine richtige pH-Gleichgewicht zu schaffen. Beispielsweise 50 ml Medium dauert etwa eine Stunde vollständig äquilibrieren (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2). Hinweis: Dieses Protokoll verwendet ein zweistufiges Verfahren, das teilweise Aufspaltung differenzierten SH-SY5Y-Zellen benötigt werden mit Trypsin behandelt und erneut plattiert. Dies ist eine stressigeVerfahren für diese außerordentlich zerbrechlich Zellen. Daher ist es wichtig, die Zellen in Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert. Dies wird für die bevorzugte Abheben von Neuronen, so dass epithelial-ähnlichen Zellen noch an der Schale befestigt ermöglichen. </li><li> Führen Verreiben von differenzierten Zellen langsam mit einer 10 ml Kunststoffpipette mit der Spitze gegen den Boden des konischen Rohrs mit den Zellen. Führen Verreiben mit einer langsamen Geschwindigkeit, nach oben und unten nicht mehr als das Fünffache. </li></ol> 2. Durchgang von SH-SY5Y Wartung Kulturen <ol><li> Split Wartung Kulturen, wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreicht haben, und nicht mehr als 10 bis 15 Passagen. Kulturen müssen in der Regel alle 3-5 Tage passagiert werden (vorausgesetzt, Kulturen werden nicht mehr als 5-fach beim Spalten verwässert). </li><li> Um Durchgang Zellen aus einem T-75-Kolben, absaugen Medien ab, dann mit ca. 10 ml 1x PBS spülen. Hinweis: Wir empfehlen nicht, die SH-SY5Y Wartung Kulturen fu Aufspaltungeitere als 1: 5 während der Passagierung da dies die Zellen verursachen aufgrund der niedrigen Konfluenz zu sterben. </li><li> Absaugen PBS, und fügen Sie 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA (1x). </li><li> Inkubieren in Inkubator 2-3 min und Spitze sanft Zellen von der Oberfläche des Kolbens freizugeben. </li><li> In 10 ml Basiswachstumsmedien (siehe Tabelle 2) und verreiben 1-2 mal. </li><li> Spin down für 2 min bei 1000 · g, absaugen Medien, dann Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien. </li><li> Verdünnen Zellen von 1: 3 bis 1: 5 in einem Gesamtvolumen von 20 ml für normale Beschichtung in T-75-Kolben, oder zählen und Platte für Differenzierung (Kapitel 5). </li></ol> 3. Einfrieren SH-SY5Y-Zellen <ol><li> Einfrieren frühen Passagen von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen in Basic Wachstumsmedien, ergänzt mit 5% (v / v) DMSO. </li><li> Zunächst einfrieren Aliquots bei -80 ° C für 24 Stunden, dann Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung. Hinweis: Als Referenz wurde ein konfluenter (75-85%) T-75-Kolben wird fünf Ausbeute1 ml Aliquots von SH-SY5Y-Zellen zum Einfrieren. Jeder dieser Teilmengen sollten überall 2-5 Millionen Zellen insgesamt enthalten. </li></ol> 4. auftauen und Kultur Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen <ol><li> Bereiten Grundwachstumsmedien. </li><li> Auftauen schnell gefrorenen Zellen in einem 37 ° C Wasserbad (ca. 2 min). </li><li> Die Zellen in 9 ml Grundwachstumsmedien in einem 15 ml konischen Röhrchen, und dann 2 min bei 1.000 x g zentrifugiert. </li><li> Saugen Sie den Überstand, während man aufpassen, nicht die pelletierten Zellen zu stören, und sanft resuspendieren Zellen in 10 ml Basiswachstumsmedien. </li><li> Platte Zellen auf einem T-25-Kolben oder 60 mm 2 Gericht. </li><li> Am nächsten Tag ersetzen Medien toten Zellen zu entfernen. </li></ol> 5. Tag 0: Plating Cells für Differenzierung <ol><li> Siehe Abbildung 1 für die Differenzierung Zeitplan. </li><li> Spülen undifferenzierten Zellen mit 1x PBS, absaugen und dann trypsinize mit 1-2 ml erwärmt1x 0,05% Trypsin-EDTA. </li><li> Wenn Zellen in Trypsin sind, für ca. 3 min in einem Inkubator inkubiert. </li><li> Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 10 ml Basiswachstumsmedien, spülen Sie die Seiten der Flasche oder Schale, und verreiben sanft 1-3 mal. Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge für 2 min bei 1000 · g, und die Medien anzusaugen, während man aufpassen, nicht das Pellet zu stören. </li><li> Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien und verreiben 1-3 mal. </li><li> Zählen von Zellen eine Zählkammer, verdünnte dann Grundwachstumsmedien zu 50.000 Zellen / ml verwendet wird. </li><li> Plate 2 ml Zellen pro 35 mm 2 Gericht für eine Gesamtmenge von 100.000 Zellen pro Schale und legen Sie wieder in Inkubator. </li></ol> 6. Tag 1: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1) <ol><li> Aliquoten 50 ml Differenzierung Medien # 1 (siehe Tabelle 2) und in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert. </li><li> Wenn Medien erwärmt wird, damit sie in einem Inkubator ins Gleichgewicht (37° C, 5% CO 2) für mindestens eine Stunde eine richtige pH-Gleichgewicht vor der Verwendung herzustellen. </li><li> In Retinsäure (RA) (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. Anmerkung: Retinsäure ist lichtempfindlich und sollten in dunklen Flaschen bei 4 ° C gelagert werden </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator. </li></ol> 7. Tag 3: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5) </li></ol> 8. Tag 5: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5) </li></ol> 9. Tag 7: Split Cells 1: 1 <ol><li> In RA erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Differenzierung Medien # 1 unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> In 200 ulerwärmt 0,05% Trypsin EDTA 1x pro 35 mm 2 Schüssel und warm in Inkubator etwa 2-3 min oder bis die Zellen von der Platte abgehoben sichtbar sind, wie unter einem Mikroskop beobachtet. </li><li> Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und mit den Medien verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen. Hinweis: Während der Trypsinierung Schritte, nicht trypsinize nicht zu viele Gerichte auf einmal. Dies hilft neuronalen Kulturen zu gewährleisten, nicht zu lange in Trypsin inkubiert, die cytotoxisch sein können. </li><li> Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf Mal mit einem 10-ml-Plastikpipette. </li><li> Aliquoten 2 ml Zellsuspension in frischem 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator. </li></ol> 10. Tag 8: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 2) <ol><li> In RA (siehe &lt;strong&gt; Tabelle 1) erwärmt und Medien sofort ins Gleichgewicht gebracht, bevor Medien zu Gerichten hinzuzufügen. </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 2 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Schüssel und Rückkehr zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden, da sie schnell austrocknen kann. </li></ol> 11. Tag 9: Bereiten extrazellulären Matrix (ECM) beschichteten Schalen <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen von ECM-Lösung auf Eis und verdünnen 1: 100 in kaltes DMEM. </li><li> Dispense 2 ml Mischung in jedem 35 mm 2 Schüssel und sicherzustellen, dass das gesamte Boden der Schale bedeckt ist. </li><li> In einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1 h oder über Nacht. </li><li> Saugen Sie Mischung und lassen für etwa 1 Stunde in einer Haube an der Luft trocknen. Bei einer Raumtemperatur für bis zu 2 Monate. </li></ol> 12. Tag 10: Transfer Zellen aufECM-beschichtete Platten 1: 1 <ol><li> In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. </li><li> vorsichtig absaugen aus Medien und entsorgen. </li><li> Zugabe von 200 &amp; mgr; l Trypsin zu jedem erwärmt 35 mm 2 Schüssel und erlauben etwa 1-2 min bei Raumtemperatur inkubiert oder bis Neuronen werden sichtbar aus der Schale gehoben, wie unter einem Mikroskop beobachtet. Hinweis: Führen Sie diese Trypsinierung Schritt bei Raumtemperatur, um nicht zu über brüten Neuronen mit Trypsin und Schäden verursachen. Neuronen Freisetzung aus Platten viel schneller als epithelial-ähnlichen Zellen in diesem Stadium. </li><li> Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 2 pro 35 mm 2 Gericht und die Medien nutzen verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf mal mitein 10-ml-Plastikpipette. </li><li> Dispense 2 ml Zellsuspension in ECM-beschichtete 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator. </li></ol> 13. Tag 11: Änderung Medien (Differenzierung Medien # 3) <ol><li> In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 3 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden. </li></ol> 14. Tag 14: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 3) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3) </li></ol> 15. Tag 17: Letzte Medienwechsel (Differenzierung Medien # 3) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3) </li></ol> 16. Tag 18: Neuronale Kulturen gebrauchsfertig <ol><li> Ändern Medien an die frische Differentiation Medien # 3 mit RA alle 3 Tage Neuron Gesundheit zu erhalten. Hinweis: Die Zellen in Neurone differenziert werden sollte, und weisen einen neuronalen Phänotyp. Kulturen typischerweise stabil für bis zu 14 Tage nach der terminalen Differenzierung jedoch Dauer Neuron Lebensfähigkeit hängt von Passagezahl der undifferenzierten Zellen zu Beginn der Differenzierung. Höhere Durchgang Zahlen ergeben differenzierten Neuronen mit einer kürzeren Lebensdauer. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das obige Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Methode homogene und lebensfähigen humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen. Dieses Protokoll nutzt Techniken und Praktiken, die mehrere zuvor veröffentlichten Methoden 4.1 und Ziele integrieren, um die besten Praktiken der einzelnen zu beschreiben. Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen beruht auf allmähliche Serumentzug; die Zugabe von Retinsäure, neurotrophen Faktoren und extrazellulären Matrixproteinen; und Serien Spaltung für differenzierte reife anhaftenden Neuronen zu wählen. Diese Zelllinie beginnt als eine heterogene Population von adhärenten und Suspensionszellen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die beiden Populationen zu erhalten, indem PBS Waschungen vor Passagieren oder Medienwechsel Quellen, aber ein gewisser Verlust an suspendierten Zellen notwendig ist das Entfernen der toten Epithelzellen zu erlauben. Die vorgestellte Methode erzeugt eine homogene Population von differenzierten menschlichen SH-SY5Y Neuronen für weitere Experimente. Obwohl other Mittel verwendet werden, die Differenzierung von Nervenzellen in einem cholinergen oder adrenergen Phänotyp 16,17 zu führen, die Verwendung von RA SH-SY5Y-Zellen zu unterscheiden, ist zuvor verwendet worden, mit einem dopaminergen Phänotyp 37,38 herzustellen Neuronen. Zugabe von RA hat sich gezeigt, Zelldifferenzierung durch eine Reihe von Mechanismen zu induzieren, einschließlich der Arretierung der Zellzyklusprogression von G0 / G1, Erhöhung der Expression des Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) Inhibitoren p21 und p27 Kip1 und die anti-apoptotischen Proteinen Bcl -2 und Bcl-xL und PI3K / AKT-Aktivität zu verbessern, die 39 eine Rolle bei der Neuriten Entwicklung und Differenzierung spielt. Es ist zwingend notwendig, während der Ausführung des Protokolls sanft und sterile Handhabungstechniken zu verwenden, wie SH-SY5Y-Zellen sehr empfindlich auf plötzliche Veränderungen. Es ist, weil dieser Empfindlichkeit, dass die schrittweise Serumentzug Protokoll über Protokolle bevorzugt wird, die in med machen schnelle Änderungen erfordernia Zusammensetzung. Wenn die Zellen an den Tagen 7 und 10 aufzuteilen, ist es wichtig, die Zeitdauer, die die teilweise differenzierten Neuronen in Trypsin verbringen zu minimieren. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung Neuronen und fördert die bevorzugte Freisetzung von Nervenzellen im Vergleich zu Epithelzellen, die länger dauern, zu lösen. Dies hilft, eine homogenere neuronalen Population von Zellen zu schaffen und Kontamination mit dem proliferierenden und undifferenzierte Epithelzellen zu minimieren. Es ist auch wichtig, Reagenzien zur Kultivierung und Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen werden routinemäßig und nicht gehalten ersetzt werden soll unbegrenzt verwendet beachten. Zum Beispiel kann Grundwachstumsmedien bis zu 6 Wochen gehalten werden, während Differenzierungsmedium sollte nur bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden. Dies stellt sicher, Reagenzien wie dbcAMP und BDNF sind frisch und stabil. Zusätzlich hergestellt RA sollte nur für bis zu 6 Wochen und im Dunkeln gelagert werden, bevor eine neue Charge sollte gemacht werden. Wir haben größere beobachtet Konsistenz der neuronalen Ergebnisse with dieser Vorsichtsmaßnahmen. Sobald Zellen in reife Nervenzellen differenziert wurden, können sie für bis zu 2 Wochen nach der terminalen Differenzierung und für Experimente verwendet aufrechterhalten werden. Im Anschluss an die terminale Differenzierung, sollten Medien alle 3-4 Tage (Differenzierung Medien # 3) geändert werden. Im Gegensatz zur differenzierten Neuronen, Erhaltungskolben undifferenzierten SH-SY5Y Zellkulturen enthalten, können viele Wochen mit regelmäßigen Passagieren gehalten über. Es ist wichtig zu Wartungsdurchgang Kulturen regelmäßig eine Überpopulation von epithelial-ähnlichen Zellen zu verhindern, die nicht mehr zur Differenzierung zu Nervenzellen fähig sind. Wenn diese Zellen die mit neuro-Potenzial überwiegen, wird Serumaushungerung unverhältnismäßige Mengen von Zelltod verursachen. Undifferenzierten Kulturen können nur bis zu etwa 15 Passagen aufrechterhalten werden. Sobald die Kultur etwa 15 Passagen überschritten hat, beginnen undifferenzierten Zellen zu sterben und haben eine raue, ungesunde Aussehen. Darüber hinaus differenzierung von Hoch SH-SY5Y-Zellen Passage ist schwieriger, da weniger Zellen wird jedes geteilte überleben, und diejenigen, die oft tun aggregieren beide Zellkörper und Axone, so dass nachfolgende Analysen erschwert. Es ist eine deutliche Abnahme der Zellzahl während des Differenzierungsprozesses so viele Zellen verloren gehen oder nicht überleben den Spaltvorgang. Daher wird zu Beginn eines jeden Experiments differenzierten SH-SY5Y-Zellen beteiligt, sollte man einen Anteil von ~ 30-40% Verlust von Neuronen und sicherzustellen, wird eine geeignete Anzahl von Zellen bei Beginn plattiert, um die gewünschte Ausbeute zu erzielen. Während Überzug 100.000 Zellen viele gesunde, reife SH-SY5Y Neuronen produziert, weniger oder größere Zahlen zunächst je nach Versuchs Notwendigkeit überzogen werden kann. Es ist klar, dass vollständig differenzierten SH-SY5Y Neuronen bieten eine bessere Annäherung des reifen humanen in vivo gefunden Neuronen als Zelle ihre undifferenzierten Vorläufer tun Gegenstücke (Abbildung 2). Diese Neuronen wird ein vorteilhaftes Modell für künftige Charakterisierungen der Neurobiologie, für die Untersuchung von neurotropen Viren bereitzustellen, oder für Chemotoxizität in Neuronen zu screenen.

Die Fähigkeit, in vitro Modellsysteme zu verwenden, hat sich stark verbessert den Bereichen Neurobiologie und Neurowissenschaften. Zellen in Kultur bieten eine effiziente Plattform Proteinfunktionalität und molekularen Mechanismen der spezifischen Phänomene zu verstehen, die Pathologie der Krankheit und Infektion zu charakterisieren, und die vorläufigen Testarzneimittelprüfungen durchzuführen. In der Neurobiologie umfassen die wichtigsten Arten von Zellkulturmodellen abgeleitet primären neuronalen Kulturen von Ratten und Mäusen, und Neuroblastom-Zelllinien, wie Ratte B35-Zellen 5, Neuro-2A Mauszellen 6 und Ratten-PC12-Zellen 7. Obwohl die Verwendung solcher Zelllinien signifikant die Feld fortgeschritten ist, gibt es mehrere Störfaktoren, die mit Umgang mit nicht-menschlichen Zellen und Gewebe. Dazu gehören Verständnis speziesspezifische Unterschiede in Stoffwechselprozessen, Phänotypen von Krankheitsmanifestation und Pathogenese bei Anwendung im Menschen verglichen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieRe gibt erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch Genexpression und Transkriptionsfaktor-Signalisierung, Hervorhebung der Einschränkungen von Tiermodellen und die Bedeutung des Verstehens, die Wege zwischen Nagern und Menschen 11.08 konserviert sind. Andere haben die Verwendung von humanen neuronalen Zelllinien, einschließlich der N-Tera-2 (NT2) menschlichen Teratokarzinom Zelllinie und induzierbare pluripotente Stammzellen (iPS) eingesetzt. Diese Zelllinien sorgen für gute Modelle für die in vitro menschliche Systeme. Jedoch Differenzierung von NT2-Zellen mit Retinsäure (RA) führt zur Erzeugung eines gemischten Population von Neuronen, Astrozyten und radialer Gliazellen 12, einen zusätzlichen Reinigungsschritt notwendig, um reine Populationen von Neuronen erhalten. Zusätzlich zeigen NT2 Zellen eine sehr variable Karyotyp 13, wobei mehr als 60-Chromosomen in 72% der Zellen. iPS-Zellen zeigen Variabilität bei der Differenzierung zwischen verschiedenen Zelllinien und variieren in der Differenzierung Effizienz<html> 14. Es ist daher wünschenswert, eine konsistente und reproduzierbare humanen neuronalen Zellmodell zu haben diese Alternativen ergänzen. SH-SY5Y Neuroblasten-ähnlichen Zellen sind ein Subklon des Eltern Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH. Die Elternzelllinie wurde im Jahr 1970 von einer Knochenmarkbiopsie erzeugt, die 15 beide Neuroblast artig und Epithel-ähnlichen Zellen enthält. SH-SY5Y-Zellen haben einen stabilen Karyotyp, bestehend aus 47-Chromosomen, und kann von einer Neuroblasten artigen Zustand zu reifen menschlichen Nervenzellen durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen, einschließlich der Verwendung von RA, Phorbolester, und spezifische Neurotrophine wie Gehirn stamm unterscheiden neurotrophic factor (BDNF). Vor deutet darauf hin, dass die Verwendung verschiedener Methoden zur spezifischen Neuronen Subtypen wie adrenergen auswählen, cholinergen und dopaminergen Neuronen 16,17. Dieser letztere Aspekt macht SH-SY5Y-Zellen, die für eine Vielzahl von neurobiologischen Experimenten. ontent &quot;&gt; Mehrere Studien haben wichtige Unterschiede zwischen SH-SY5Y-Zellen in ihrem undifferenzierten und differenzierten Zuständen festgestellt. Wenn SH-SY5Y-Zellen sind undifferenziert, sie vermehren sich und treten schnell unpolarisierten zu sein, mit sehr wenigen, kurzen Prozessen. Sie wachsen häufig in Klumpen und express Marker indikativ für unreife Neuronen 18,19. Wenn differenziert, erstrecken sich diese Zellen lang, verzweigt Prozesse, Verminderung der Zellproliferation, und in einigen Fällen polarisieren 2,18. ausdifferenzierten SH-SY5Y-Zellen zuvor gezeigt wurde, ein auszudrücken Vielzahl von verschiedenen Markern von reifen Nervenzellen, einschließlich des Wachstums-assoziierten Protein (GAP-43), neuronale Zellkerne (NeuN), Synaptophysin (SYN), synaptischen Vesikel Protein II (SV2), Neuron spezifische Enolase (NSE) und Mikrotubuli-assoziierten Protein (MAP) 2,16,17,20 und 4 die Expression von glial Marker wie glial fibrillary acidic protein (GFAP) fehlt. In weiteren Unterstützung, die SH-SY5Y-Zellen differenziert represent eine homogene neuronalen Population, die Entfernung von BDNF führt zu zellulären Apoptose 4. Dies deutet darauf hin, dass das Überleben von differenzierten SH-SY5Y-Zellen auf trophischen Faktoren abhängig ist, ähnlich Neuronen zu reifen. Verwendung von SH-SY5Y-Zellen erhöht ist, seit der Subklon 1978 3 hergestellt wurde. Einige Beispiele für deren Verwendung umfassen Untersuchung Parkinson-Krankheit 17, Alzheimer-Krankheit 21 und die Pathogenese von viralen Infektionen einschließlich Poliovirus 22, Enterovirus 71 (EV71) 23,24 , Varicella-Zoster-Virus (VZV) 1, humanen Cytomegalovirus 25 und Herpes simplex-Virus (HSV) 2,26. Es ist wichtig, dass mehrere Studien unter Verwendung von SH-SY5Y-Zellen, diese Zellen in ihrem undifferenzierten Form verwendet zu beachten, vor allem im Bereich der neurovirology 27-36. Der Unterschied in der beobachteten Phänotyp von undifferenzierten gegenüber differenzierten SH-SY5Y-Zellen wirft die Frage auf whether die beobachtete Fortschreiten der Infektion würde in reifen differenzierten Neuronen unterschiedlich sein. Beispielsweise unterscheiden SH-SY5Y-Zellen haben einen höheren Wirkungsgrad von HSV-1 Aufnahme gegen die undifferenzierten, SH-SY5Y-Zellen vermehren, was zu einem Mangel an Oberflächenrezeptoren zurückzuführen sein kann, die HSV binden und modulieren Eintrag der undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen 2. Es ist daher wichtig, dass, wenn ein Experiment zum Testen Neuronen in vitro fokussiert Gestaltung, SH-SY5Y-Zellen, um differenziert werden die genauesten Ergebnisse für die Übersetzung und Vergleich zu in vivo-Modelle zu erhalten. Die Entwicklung einer zuverlässigen Methode humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen ist zwingend notwendig Forscher zu ermöglichen Translationsexperimente durchzuführen, die genau den menschlichen Nervensystems modellieren. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein Verfahren, das beste Verfahren der vorangegangenen Methoden 4.1 zu bereichern für den menschlichen Neuronen abgrenzt, die differenziert werdenVerwendung von Retinsäure.

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Sigma</td><td>SRP3014 (10 &amp;mu;g)/B3795 (5 &amp;mu;g)</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td><td>Sigma</td><td>M5650</td><td>-</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>GlutamaxI</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>-</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>-</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td><td>Sigma</td><td>E0282</td><td>See step 11 of the protocol</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>-</td></tr><tr><td>Retinoic acid (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Should be stored in the dark at 4 &amp;deg;C because this reagent is light sensitive</td></tr><tr><td>SH-SY5Y Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>-</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin + EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td>-</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC dishes</td><td>Falcon (A Corning Brand)</td><td>353001</td><td>-</td></tr></tbody></table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Derzeit gibt es viele Fälle auf dem Gebiet der Neurobiologie und neurovirology wo undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen als Funktionsmuster für den menschlichen Neuronen verwendet werden 27-36, und wichtiger ist, kann undifferenzierten Zellen Phänotypen fehlt wie eine optimale Virusaufnahme 2, die notwendig für eine genaue Interpretation. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen oder andere in vitro neuronale System werden die Zellen in geeigneter Weise in Neurone differenziert, um Daten zu erhalten, die die bestmögliche Darstellung von dem, was in Neuronen in vivo eintreten könnten. Die obige Protokoll Ausbeuten hoch lebensfähigen, homogenen, differenzierten neuronalen Kulturen innerhalb von 18 Tagen, die für die anschließende biochemische und Bildanalysen verwendet werden kann. Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen zeigen eine große, flache, Epithel-ähnlichen Phänotyp mit zahlreichen kurzen Prozesse nach außen erstrecken (2A), während differenzierte Zelles besitzen mehrere neuritic Projektionen, die in die umliegenden Zellen (2B) verbinden. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen differenzierenden Zellen mit Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert werden, um sicherzustellen, dass nur Neuronen aus der Schale freigesetzt. Dies hinterlässt den undifferenzierten Epithelzellen, die die differenzierten neuronalen Zellpopulation sonst verunreinigen würde. Die neuronalen Eigenschaften von vollständig differenzierten SH-SY5Y-Zellen werden durch Techniken, wie Immunfluoreszenz-Nachweis von klassischen neuronalen Marker (Figur 3) gezeigt. SH-SY5Y-Zellen zeigen eine Vielzahl von verschiedenen Phänotypen im Verlauf der Differenzierung und es ist wichtig gesunden Neuronen von denjenigen zu identifizieren zu können, die beansprucht werden. Auf Differenzierung Tag 1, vor der Einführung von Differenzierung Medien # 1, haben Zellen eine flache, zurückgezogen Phänotyp mit kurzen, stämmigen Prozesse (4A).Nach 5 Tagen nach der Serumentzug, beginnen SH-SY5Y-Zellen länger Projektionen zu entwickeln und zeigen eine weitere neuronalen Phänotyp (4B). Passagieren ist eine harte Prozess für SH-SY5Y-Zellen, und an den Tagen unmittelbar Passagieren folgende Zellen erscheinen ungesund. Dies wird durch Zellkörper Klumpenbildung und die Anwesenheit von weniger, kürzere Prozesse belegt. (Siehe vor Bilder: 4C und 4E und nach Bilder: Zahlen 4D und 4F). Etwa 48 Stunden den Bruchteil einer folgenden, scheinen Zellen zu gewinnen, und voll ausgereifte, differenzierte Neuronen an Tag 18 (2B) erhalten. Dies wird durch eine Verringerung der Zellkörper Verklumpung belegt, und Erweiterung von zahlreichen dünnen, verzweigten neuritische Prozesse, die zu den benachbarten Zellen oft verbinden. Faktoren, die neuronalen Kulturen zu erhalten, reproduzierbar und lebensfähigen wesentlich sind, umfassen unter Verwendung von hitzeinaktiviertem FBS, Trypsin Inkubation minimierenZeit, und sanft Verreiben. Wichtig ist, Details dieses Protokoll die Verwendung von vier verschiedenen Medien-Formulierungen mit verschiedenen Konzentrationen von hiFBS, wodurch ein sanfter Übergang in einem serumausgehungerten Zustand für die Zellen zu schaffen. Wenn sie reif sind SH-SY5Y-Zellen gesund sind, zeigen sie zahlreiche Projektionen, die in die umliegenden Neuronen (5A) zu verbinden. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Unterscheidungs ​​epithelialen Phänotyp die neuronalen Kulturen überholen, wenn sie während des Differenzierungsprozesses (5B) falsch gehandhabt werden. Außerdem, wenn Neuronen sterben beginnen, wird Neuriten zurückziehen, Zellkörper beginnt zu verklumpen und Aufrunden und Ablagerungen von Neuriten Degeneration beginnt am und um Zellprozesse zu akkumulieren. Dieser Vorgang ist vergleichbar mit dem, was in 5C und 5D gezeigt wird. Während 5C eine natürliche Entwicklung von Zelltod nach Nährstoff und Umweltentzug zeigt,5D zeigt differenzierten SH-SY5Y Neuronen 4 Stunden nach der Infektion mit HSV-1-Stamm KOS, bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 6 PFU. Dieses Protokoll wurde im Labor und reproduzierbare Ausbeuten, homogene Populationen von Neuronen, die sind für Downstream-Analysen und Experimente sorgfältig optimiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig1.jpg" /> Abb. 1: Zeitplan der Differenzierung Verfahren Der Differenzierungsprozess besteht aus 11 Stufen im Laufe einer 18-Tage-Frist verteilt. Am ersten Tag der Differenzierung Protokoll (Tag 0), zwischen 25.000 und 100.000 Zellen werden auf unbeschichteten 35-mm-Schalen ausplattiert. An den Tagen 1, 3 und 5, wird alte Medium entfernt und Differenzierung Medien # 1 angewendet wird. 1 auf unbeschichtete 35mm Gerichte in Differenzierung Medien # 1: Am Tag 7 werden die Zellen 1 geteilt. Am Tag 8 wird das Medium zur Differenzierung geändertMedien # 2, und am Tag 10 werden die Zellen aufgeteilt wieder 1: 1, aber diesmal auf ECM-beschichtete 35-mm-Schalen in Differenzierung Medien # 2. An den Tagen 11, 14 und 17 wird alte Medium entfernt und Differenzierung Medien # 3 angelegt wird. Am 18. Tag, sind differenzierte Neuronen bereit für Downstream-Anwendungen zu nutzen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig2.jpg" /> Abb. 2: Die morphologische Erscheinungsbild von undifferenzierten und differenzierten SH-SY5Y-Zellen (A) Undifferenzierte SH-SY5Y-Zellen haben eine flache Phänotyp mit wenigen Projektionen während (B) unterschieden SH-SY5Y Neuronen zeigen umfangreiche und langgestreckte neuritic Projektionen. Die Bilder wurden in der Phase bei 20-facher Vergrößerung unter Verwendung eines invertierten Epifluoreszenzmikroskop erhalten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig3.jpg" /> Abbildung 3:Marker der neuronalen Differenzierung. Immunfluoreszenz beleuchtet neuronalen Funktionen von SH-SY5Y-Zellen vollständig differenziert. (A) Anti-SMI31 (grün) färbt die phosphoryliert Neurofilament H in der flächendeckendes Netz von Neuriten. (B) Anti-MAP2 (rot) Etiketten Mikrotubuli-assoziierten Protein 2, die neuronale Soma und proximalen Teil der Neuriten enthüllt. Entsprechende Phasenbild für jeden Immunfluoreszenz-Panel wird auf der rechten Seite gezeigt. Die Bilder wurden in 10-facher Vergrößerung unter Verwendung eines invertierten Epifluoreszenzmikroskop erhalten. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig4.jpg" /> Abbildung 4: Zwischenschritte der Differenzierung Protokoll (A) 1. Tag der Differenzierung.. Die Zellen halten eine zurückgezogene Phänotyp mit kurzen Projektionen. (F) Tag 5 der Differenzierung. Die Zellen wurden 5 Tage ausgesetzts von Serumentzug (Differenzierung Medien # 1). Die überlebenden Zellen beginnen zu verlängern und mehr Prozesse bilden, das mit benachbarten Zellen verbinden. (C) 7. Tag vor der Differenzierung zu spalten. Die Zellen zeigen eine hohe Zahl von lang Prozesse, mit weniger Zahlen von Zellen eine Epithel-ähnlichen Phänotyp zeigen. (D) 8. Tag der Differenzierung, einen Tag nach dem ersten Durchgang. Nach Splitting, Zellkörper Klumpen bilden und Verfahren kurz erscheinen als ein Ergebnis der Passagierung Verfahren. (E) Tag 10 der Differenzierung vor gespalten auf ECM-beschichteten Platten. Die Zellen zeigen mehr Prozesse, die Verbindungen mit Zellen in der Nähe machen. Zellkörper Clustering ist auch offensichtlich. (F) Tag 11 der Differenzierung, der einen Tag nach zweiten Teil. Die Zellen werden unterstrich die zweite Passage folgenden und viele Neuronen schließlich verloren. Allerdings ist die verbleibende Population lebensfähig, homogen und in neuronalen Phänotyp. Zellkörper erzeugen lArger Cluster und Prozesse beginnen, von der Basis der Cluster zu emittieren. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53193/53193fig5.jpg" /> Abb. 5: Epithelial Überwucherung und neuronalen Tod - zwei alternative Ergebnisse des Differenzierungsprozesses (A) Gesunde, reife SH-SY5Y Neuronen zeigen diffusen axonalen Projektionen zu den benachbarten Zellen verbinden. (B) In einigen Fällen wurden Zellen mit einer Epithel-ähnlichen Phänotyp Wartung Kulturen überholen. Diese Überbevölkerung von Epithel-ähnlichen Zellen kann zu selten Passagieren Wartungs Kulturen fällig. Diese Kulturen sollten verworfen werden, da die Epithel-ähnlichen Zellen werden weiterhin Neuronen zu übertreffen. Pfeile bezeichnen Epithel-ähnlichen Zellen. (C) Wenn SH-SY5Y-Zellen ungesund sind und beginnen zu sterben, runden Zellkörper und Prozesse beeinträchtigen, eine erhebliche Menge an Schutt zu erzeugen. (D </strong&gt;) Merkliche Ansammlung von Zellbruchstücken und das Zurückziehen der neuronalen Prozesse zeigt sich in reife, differenzierte Neuronen, 4 h mit einem Stamm von Herpes simplex-Virus 1 (HSV-1) KOS bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 6 nach Infektion PFU. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Details </td><td> Stock </td><td colspan="5"> Anleitung </td></tr><tr><td rowspan="2"> 10 &amp; mgr; M RA </td><td> All-trans-Retinsäure </td><td rowspan="2"> 5 mM </td><td colspan="5" rowspan="2"> Resuspendieren 50 mg RA in 33,3 ml 95% EtOH. RA ist empfindlich gegen Hitze, Licht und Luft. Halten Sie in einer dunklen Flasche und bei 4 ° C für bis zu 6 Wochen. Verwenden Sie bei 1: 500 Verdünnung und verdünnen in Differenzierung Medien unmittelbar vor der Anwendung </td></tr><tr><td> (300,44 g / mol) </td></tr><tr><td> 1x B-27 </td><td> B-27 Supplement </td><td> 50x </td><td colspan="5"> Auftauen 1-10 ml-Flasche und aliquoten Rest in Einweg Je 1 ml und bei -80 ° C. Shop 10-ml-Flaschen bei -20 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20 mM KCl </td><td> Kaliumchlorid </td><td rowspan="2"> 1 M </td><td colspan="5" rowspan="2"> In 250 ml Wasser zu 18,6 g KCl und Sterilfilter. Bei Raumtemperatur lagern </td></tr><tr><td> (74.55 g / mol) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2 mM db-cAMP </td><td> Dibutyryl cyclisches AMP </td><td rowspan="2"> 1 M </td><td colspan="5" rowspan="2"> Resuspendieren volle Flasche von 2,04 ml Wasser zu 1 g db-cAMP hinzufügen. Empfindlich gegen Licht und Feuchtigkeit. Speicher in Aliquots von 100 &amp; mgr; l oder 200 &amp; mgr; l entweder bei -20 ° C oder -80 ° C </td></tr><tr><td> (491,37 g / mol) </td></tr><tr><td> 50 ng / ml BDNF </td><td> Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) </td><td> - </td><td colspan="5"> Zentrifuge Fläschchen Pulver nach unten zu bekommen.60; Resuspendieren 10 ug Fläschchen in 1 ml Neurobasal + 1x B27 oder 5 ug Fläschchen in 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 erhalten 10 ug / ml. Verwenden Sie bei 1: 200-Verdünnung. Shop Arbeits Aliquots bei -80 ° C (zB: 250 ul) </td></tr><tr><td> hiFBS </td><td> Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum </td><td> - </td><td colspan="5"> Aliquot aufgetaut FBS in 50 ml konische Röhrchen. Wärme bei 56 ° C in einem Wasserbad für 30 min. Entfernen und gefrierArbeits Aliquots bei -20 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Auf Lösungen und Komponenten. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Grundlegende Wachstumsmedien </td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Volumen für 500 ml </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> EMEM </td><td> 415 ml EMEM </td><td></td></tr><tr><td> 15% hiFBS </td><td> 75 ml hiFBS </td&gt; <td></td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 5 ml Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM Glutamin </td><td> 5 ml Glutamin </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Halten Sie 6 Wochen maximal </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Differenzierung Medien # 1 </td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Volumen 50 ml </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> EMEM </td><td> 48 ml EMEM </td><td></td></tr><tr><td> 2,5% hiFBS </td><td> 1,3 ml hiFBS </td><td></td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 500 ul Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM Glutamin </td><td> 500 &amp; mgr; l Glutamin </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M RA </td><td> 100 ul RA (5 mM Lager) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Halten Sie für 2 Wochen Maximum und fügen RA unmittelbar vorbenutzen </td></tr><tr><td colspan="3"> * Bewahren Sie keine zusätzlichen Medien einmal RA zugegeben - RA ist instabil </td></tr><tr><td colspan="3"> Differenzierung Medien # 2 </td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Volumen 50 ml </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> EMEM </td><td> 49 ml EMEM </td><td></td></tr><tr><td> 1% hiFBS </td><td> 500 ul hiFBS </td><td></td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 500 ul Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM Glutamin </td><td> 500 &amp; mgr; l Glutamin </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M RA </td><td> 100 ul RA (5 mM Lager) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Halten Sie für 2 Wochen Maximum und fügen RA unmittelbar vor der Anwendung </td></tr><tr><td colspan="3"> * Bewahren Sie keine zusätzlichen Medien aufce RA zugegeben - RA ist instabil </td></tr><tr><td colspan="3"> Differenzierung Medien # 3 </td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Volumen 50 ml </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 47 ml Neurobasal </td><td></td></tr><tr><td> 1x B-27 </td><td> 1 ml B-27 (50X Lager) </td><td> 1.50 </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td><td> 1 ml KCl (1M Lager) </td><td> 1.50 </td></tr><tr><td> 1x Pen / Strep </td><td> 500 ul Pen / Strep </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 2 mM GlutamaxI </td><td> 500 ul GlutamaxI (100x Lager) </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td> 50 ng / ml BDNF </td><td> 250 ul BDNF Lager (10 ug / ml) </td><td> 1: 200 </td></tr><tr><td> 2 mM Dibutyryl zyklischen AMP (db-cAMP) </td><td> 100 ul db-cAMP (1M Lager) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M RA </td><td> 100 ul RA (5 mM Stamm) </td><td> 1: 500 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Halten Sie für 2 Wochen Maximum und fügen RA unmittelbar vor der Anwendung </td></tr><tr><td colspan="3"> * Bewahren Sie keine zusätzlichen Medien einmal RA zugegeben - RA ist instabil </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Medien Rezepte.

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Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

71.2K Aufrufe.  The Pennsylvania State University. It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications. 

Serie: Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Neurowissenschaften

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median survival following diagnosis is less than 15 months with maximal surgical resection, radiation, and temozolomide chemotherapy. The challenges inherent in developing more effective GBM treatments have become increasingly clear, and include its unyielding invasiveness, its resistance to standard treatments, its genetic complexity and molecular adaptability, and subpopulations of GBM cells with phenotypic similarities to normal stem cells, herein referred to as glioblastoma stem cells (GSCs). Because GSCs are required for tumor growth and progression, differentiation-based therapy represents a viable treatment modality for these incurable neoplasms. 
The following protocol describes a collection of procedures to establish a high throughput screening platform aimed at the identification of small molecules that promote GSC astroglial differentiation. At the core of the system is a glial fibrillary acidic protein (GFAP) differentiation reporter-construct. The protocol contains the following general procedures: (1) establishing GSC differentiation reporter lines; (2) testing/validating the relevance of the reporter to GSC self-renewal/clonogenic capacity; and (3) high-capacity flow-cytometry based drug screening. 
The screening platform provides a straightforward and inexpensive approach to identify small molecules that promote GSCs differentiation. Furthermore, utilization of libraries of FDA-approved drugs holds the potential for the identification of agents that can be repurposed more rapidly. Also, therapies that promote cancer stem cell differentiation are expected to work synergistically with current "standard of care" therapies that have been shown to target and eliminate primarily more differentiated cancer cells.

An efficient screening protocol is presented for the identification of small molecules that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells (GSCs). The assay is based on a stem cell differentiation reporter whereby the expression of the enhanced GFP (eGFP) is driven by the human GFAP promoter.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Krebsforschung

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, recent evidence indicated that Tau is present also in other subcellular compartments including the nucleus where it is implicated in DNA protection, in rRNA transcription, in the mobility of retrotransposons and in the structural organization of the nucleolus. We have recently demonstrated that nuclear Tau is involved in the expression of the VGluT1 gene, suggesting a molecular mechanism that could explain the pathological increase of glutamate release in the early stages of Alzheimer&#39;s disease. Until recently, the involvement of nuclear Tau in modulating the expression of target genes has been relatively uncertain and ambiguous due to technical limitations that prevented the exclusion of the contribution of cytoplasmic Tau or the effect of other downstream factors not related to nuclear Tau. To overcome this uncertainty, we developed a method to study the expression of target genes specifically modulated by the nuclear Tau protein. We employed a protocol that couples the use of localization signals and the subcellular fractionation, allowing the exclusion of the interference from the cytoplasmic Tau molecules. Most notably, the protocol is easy and is composed of classic and reliable methods that are broadly applicable to study the nuclear function of Tau in other cell types and cellular conditions.

Tau is a neuronal protein present both in the cytoplasm, where it binds microtubules, and in the nucleus, where it exerts unconventional functions including the modulation of Alzheimer&#39;s disease-related genes. Here, we describe a method to investigate the function of nuclear Tau while excluding any interferences coming from cytoplasmic Tau.

Modulation der subzellulären Lokalisierung von Tau als Werkzeug zur Untersuchung der Expression krankheitsbedingter Gene

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Genetik

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

Human neurale Organoide zur Untersuchung von Hirntumor und neurodegenerativen Erkrankungen

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

Biotechnik

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Enthüllung der mitochondrialen Ultrastruktur in Neuronen mit STED-Mikroskopie

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der mitochondrialen Alterung 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Verwendung von Lebendzell-STED-Bildgebung zur Visualisierung der mitochondrialen Innenmembran-Ultrastruktur in neuronalen Zellmodellen

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...