The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

NOT: Prosedür taze veya dondurulmuş flaş dokularda yapılabilir. Biz kan hücreleri ve plazma proteinleri kırmızı ortadan kaldırmak için diseksiyon sırasında PBS ile çok kanlanan dokular perfüze öneririz. Biz sabitleme gibi sabit dokularda prosedürü yürüten önermiyoruz (yani, kimyasal çapraz) decellularization müdahale ve aynı zamanda önemli ölçüde daha sonraki kütle spektrometresi analizi bozabilir. Bütün prosedür için, protein ve peptid kurtarma maksimize etmek için düşük tutma tüpleri ve pipet uçları kullanmanızı öneririz. Dokuların veya Tümörler 1. Decellularization Not: başlamadan önce, reaktifler hazırlanması ve her bir tampon istenen hacme (Bölme protein çıkarımı takımla birlikte verilmektedir), proteaz inhibitörleri ekleyin. Tüm tamponlar ve numuneler, SDS Yağış önlemek için oda sıcaklığında tutulması gerekiyor Tampon CS hariç deney süresince buz üzerinde tutulmalıdıryağışa. Not: protokol farklı pH ve özüt, hücre içi proteinlerin sırayla ve çözünmeyen ECM proteinleri (Şekil 1, Tablo 1 için zenginleştirmek için tuzları ve değişik deterjan miktarını ihtiva eden bir tampon içinde inkübe bir dizi kullanır kullanımına alternatifler de Tartışma bakın ticari kit) burada ayrıntılı. Aşağıda verilen reaktif hacimleri dokular ya da tümörler (Tablo 1 e bakınız), 100 mg ve uygun bir şekilde ayarlanması gerekir. <ol><li> Doku tamamen bozulur ve homojen bir süspansiyon elde edilene kadar, bir doku homojenleştirici kullanılarak proteaz inhibitörleri içeren tampon C&#39;de 500 ul doku 100 mg homojenize edilir. Not: ekleme deoksiribonükleaz I (nihai konsantrasyon: 200 ug / ml, üreticinin talimatlarına uygun olarak yeniden) ve A (20 ug / ml, üreticinin talimatlarına uygun olarak yeniden nihai konsantrasyon) ribonükleazaTampon N. </li><li> Hücre içi çözünür proteinlerin Sıralı ekstraksiyon <ol><li> Sitozolik proteinlerin çıkarımı. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca bir boru rotator Homojenat inkübe edin. Daha sonra Western blot analizi (Beklenen Sonuçlar bölümü ve Şekil 2) için homojenat küçük bir kısım (20 ul, 10 ul) kaydedin. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin Homojenat. Temiz bir tüpe supernatant toplamak bu Western blot analizi sitosolik (C) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma. </li><li> Yıkamak için, proteaz inhibitörlerini ihtiva eden B Tamponu 400 ul pelet tekrar süspansiyon ve 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin Homojenat. Süpernatantı atın. </li><li> Çıkarmak için, nükleer proteinler, Tampon N 150 ul proteaz inhibitörlerini ihtiva eden pelletini, deoxyribonucleaSE I ve ribonükleaz A ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin ve temiz bir tüp içinde supernatant toplamak. Bir kez bu adımı yineleyin: ikinci kez numune santrifüj sonra, önceki süpernatana süpernatant ekleyin: Bu western blot analizi nükleer (N) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma. Sonra, adım 1.2.3 başına yıkamalarda gerçekleştirin. </li><li> Membran proteinlerini ekstre etmek için, Tampon M, 100 ul, proteaz inhibitörlerini ihtiva eden pelet tekrar süspansiyon ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin </li><li> Temiz bir tüpe supernatant toplamak Bu western blot analizi membran (M) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma. </li><li> 2 pelet tekrar süspansiyon, sitoskeletal proteinler elde etmek içinProteaz inhibitörleri içeren ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tüp rotator örnek inkübe Tampon CS 00 ul. Pelet tamamen çözülür unutmayın. Biz pelet bozulması gözlemleyerek kadar pipetleme ve aşağı pelet kesintiye öneririz. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Temiz bir tüp içinde süpernatant toplayın. Bu noktada, pelet (video) büyüklüğünde bir başka belirgin bir azalma not edin. </li><li> Tampon C içeren proteaz inhibitörlerinin 150 ul pelet yeniden süspanse edin ve 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant toplayın ve önceki üstte yüzen eklemek Bu Western blot analizi sitoskeletal (CS) fraksiyonu teşkil edecektir. Flaş -80 ° C bu kısmını ve mağaza dondurma. </li><li> Ek yıkar gerçekleştirin. 500 ul PBS proteaz inhibitörleri, bir içeren pelet yeniden süspansend, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, bir boru rotator örnek inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. NOT: deterjanların tüm izleri peptidler (bakınız Bölüm 3) içine önce proteinlerin sindirimi için kapsamlı yıkar kaldırılması gerekir. Bu noktada, ECM-zenginleştirilmiş pelet anında donduruldu olabilir ve -80 ° C&#39;de tutuldu. Topak boyutu, başlangıç ​​malzemesi içinde çözünmeyen (ECM), proteinlerin miktarı ve decellularization verimliliğine bağlı olacağını not edin. </li></ol></li></ol> 2. SDS-PAGE ve Western Blot tarafından Decellularization / ECM Zenginleştirme Kalitesinin İzlenmesi <ol><li> Toplam doku ekstraktı 10-20 ul kısım ve Laemmli Tampon 100 mM DTT içeren ara fraksiyonların 50 ul alikotları karıştırın. 100 mM DTT içeren 3x Laemmli tamponu ECM zenginleştirilmiş, çözünür olmayan kısmın yeniden süspanse edin. Not: O konsantrasyonları yükselmişDTT ve SDS nispeten çözünmez olan ECM proteinlerinin çözündürme yardımcı olur. </li><li> SDS-PAGE ile protein ayırın ve nitroselüloz zarlar üzerine aktarıldı. </li><li> Sitosolik, nükleer membran, hücre iskeleti ile ECM fraksiyonların her birinin proteinleri temsilcisine izlemek için antikorlar kullanılarak bağışıklık-lekeleme gerçekleştirme (Örnek Sonuçlar bölümünde, Tablo 2 ve Şekil 2). </li></ol> Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler için Proteinlerin 3. In-solüsyon Sindirim Not: SDS decellularization prosedürü ve uzaklaştırılmasından sonra elde edilen topak, bu proteinler ve peptitler sindirilmiş gereken kütle spektrometrisi ile daha fazla analiz için çözünmeyen ECM proteinlerinde zenginleştirilmiş olan. Bu aşama, örneğin, protein konsantrasyonunu ölçmek için ECM proteinin çözünür bir sonucu olarak, bu mümkün olmadığından, dikkat edin. Böylece ECM-Enri sindirimi reaktif hacimleri sağlamakECM zenginleştirilmiş pelet (Tablo 3) boyutu (mm) ya da kuru ağırlığına göre peptidlere ched örnekleri. amonyum bikarbonat, üre, DTT, iyodoasetamit ve trifluoroasetik asit çözeltileri tüm taze hazırlanmış olması gerekir. <ol><li> ECM zenginleştirilmiş pelet 8 M üre uygun hacimde eklenmesiyle ECM zenginleştirilmiş örnek yeniden süspanse edin ve 10 mm nihai konsantrasyonda DTT ekleyin (bakınız Tablo 3). 37 ° C &#39;de 2 saat süre ile 1400 rpm&#39;de sürekli çalkalama ile inkübe edin. NOT: Bu noktada, ECM proteinleri tamamen çözülmüş olmayacak ve gözle görülür büyük protein parçacıkları santrifüj leme veya süzme ile göz ardı edilmemesi gerekir. Süspansiyon Deglikosilasyondan ve sindirim (video) üzerine silinir. </li><li> Alkilasyon <ol><li> HPLC dereceli su içinde iyodoasetamit çözelti hazırlayın. Oda sıcaklığına soğumasına ve 25 mM&#39;lik bir son konsantrasyona değin iodoasetamid ekleyin. Tam alkilasyonu için DTT: iyodoasetamit oranı 1 arasında olmalıdır: 2 arasındadır.5 ve 1: 3 arasındadır. </li><li> Oda sıcaklığında, 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. </li></ol></li><li> Deglikosilasyon: Not: deglikosilasyon karbohidrat yan N değiştirilmiş peptitlerin tanımlanması müdahale zincirleri glikosilasyonu -bağlı kaldırmak için gereklidir. <ol><li> 100 mM amonyum bikarbonat, pH 8.0, 2 M üre seyreltin ve PNGaseF uygun miktarda (bakınız Tablo 3). 37 ° C &#39;de 2 saat süre ile 1400 rpm&#39;de sürekli çalkalama ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Sindirim <ol><li> Lys-C ilave edin ve 37 ° C&#39;de 2 saat süre ile 1400 rpm&#39;de sürekli çalkalama ile inkübe edin. Tripsin ekleyin ve 37 ° C&#39;de 1400 rpm&#39;de O / N sürekli çalkalama ile inkübe edin. NOT: 8M üre ilk sulandırıldıktan sonra bulutlu başladı ECM zengin süspansiyon O / N sindirimi (video) sonra açık görünür. </li><li> 37 ° C&#39;de ilave bir 2 saat süre ile 1400 rpm&#39;de sürekli çalkalama ile örnek tripsin bir ikinci kısım ilave edin ve inkübe edilir. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Asitleştirme <ol><li> Sindirim tamamlandıktan sonra, taze hazırlanmış% 50 trifloro-asetik asit (TFA) ile numunenin asit hale getirilmesiyle tripsin etkisiz hale getirirler. Örnek Bir seferde% 50 TFA 1-1.5 ul ekleyerek ve (video) pH kağıdı kullanarak çözeltinin pH ölçümü peptit solüsyonu 1 ul kullanmanızı öneririz pH &lt;2. ulaşmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin asitleştirildi. Temiz düşük tutma tüp supernatant toplamak. Bu noktada, peptid solüsyonu -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Tuzdan arındırma Not: Bu son adım genellikle kendi tercih edilen yöntemlere göre kütle spektrometrisi imkan ifa edilmesi. <ol><li> Önceki proteomik analizi, bir vakum deriştirme aygıtı içinde, konsantrasyon izledi taze hazırlanmış% 60 asetonitril,% 0.1 triflüoroasetik asit ile elüt örnekler ve peptidler desalt. Taze hazırlanmış% 3 acetonitr peptitler yeniden süspanseile,% 0.1 trifloroasetik asit 8. NOT: tuzunun alınması işlemlerinden sonra, peptid solüsyonu konsantrasyonu spektrofotometri ile ölçülebilen ki (Beklenen Sonuçlar bölümüne bakınız). </li><li> Şimdi yine kütle spektrometresi tesisin optimum prosedürlere göre, kütle spektrometresi ile analiz örneği. NOT: Biz diğer yayınlar 8 başvurmak için kütle spektrometresi kullanılarak ECMlerin kompozisyon karakterize ilgilenen araştırmacıları teşvik - LC-MS / MS parametreleri, protein tanımlama ve veri analizi için kütle spektrometresi veri araması dahil daha detaylı bir açıklama sağlamak 10 ve web sitesi Biz 8 geliştirdiği in silico matrisome açıklama aracını kullanarak. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).</li><li>Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+assembly:+a+multiscale+deconstruction.">Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li><li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnological+strategies+for+engineering+complex+tissues.">Nanotechnological strategies for engineering complex tissues.</a> Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).</li><li>Wilson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+an+underexplored+but+important+proteome.">The extracellular matrix: an underexplored but important proteome.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).</li><li>Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+definition+of+an+ECM+parts+list:+an+advance+on+GO+categories.">Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories.</a> Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo.+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+primary+metastatic+colon+cancers+and+their+metastases+to+liver.">Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver.</a> BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters.">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, e01308 (2014).</li><li>Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pH+on+extracellular+matrix+preservation+during+lung+decellularization.">Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics.">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li><li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+growth+plate+cartilage.">Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage.</a> Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Dom&#233;nech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.+In.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In.</a> Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-solution+ultrasonication-assisted+digestion+method+for+improved+extracellular+matrix+proteome+coverage.">An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage.</a> Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Lennon, R., Byron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+the+complexity+of+the+human+glomerular+extracellular+matrix.">Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Değişiklikler Biz 8 on doku ve tümör tiplerinden ECM zenginleştirmek için bu tam prosedürü istihdam rağmen - 10, protokolün değişiklikler aşağıdaki durumlarda dikkate alınmalıdır: Ara fraksiyonlardaki ECM proteinleri 1) tespiti. Fibronektin ve Lamininler için yukarıda tarif edildiği gibi farklı dokular ya da tümör tipleri arasında, hücre dışı matrislerin kendi ekstrakte / çözünmezlik ile farklılık gösterebilir. Örneğin, fibrotik doku ya da yeniden modelleme dokuların ECM ait dinamik üzerinde döner düşünülmektedir ve bu yüzden bir kere daha kolayca 12 ekstrakte olduğu dokularda ECM proteinlerinin daha yüksek bir oran dikkate olabilir. ECM proteinleri tespit edildiği fraksiyonuna bağlı olarak, ECM proteinlerinin çıkarma neden olan veya bu adımı atlayarak aşamasının inkübasyon süresini azaltmak öneriyoruz. 2) DECM-zenginleştirilmiş pelet hücre içi bileşenlerin önemli bir oranda etection. Bazı doku veya tümör tipleri oranı hücreleri içinde: ECM, özellikle yüksek (örneğin, karaciğer, dalak, sigara desmoplastik tümörler) &#39;dir. Bu durumda, (özellikle sitoskeletal proteinler ve / veya Histonların) hücre içi proteinleri tarafından ECM&#39;nin zenginleştirilmiş fraksiyonun önemli bir kirlenme gözlenebilir. Verimli, biz Tampon M ve / veya Tampon CS (her ikisi de içeren deterjanlar, bu genellikle bol hücre içi proteinleri tüketir) iki kez inkübasyon yinelenen öneririz hücre içi proteinlerin tüketmek. Diğer bir alternatif (bir sonraki paragrafa bakınız), bu da nispeten daha fazla çözünür ECM proteinlerinin tükenmesine neden olabilir bu uyarı ile, daha yüksek deterjan konsantrasyonları alternatif tamponlar kullanmak olacaktır. Bir ticari kit kullanılarak 3) Alternatif. Bu ileri geri tampon maddenin kesin bileşimini elde etmek için, özel sebeplerden dolayı, yapamazkomparmantal Protein Ekstraksiyonu kiti tedarikçisi m. Ancak, biz Tablo benzer çekimi yapmak için tanımlanan deterjan ile ev yapımı tamponlar (NP-40, sodyum deoksikolat ve SDS) konsantrasyonları kullanarak kendi deneyimlerine dayanarak 1 notları dahil ettik. Yeni yapılan bir çalışmada da ECM proteinleri 13 korumak için decellularization tamponların pH önemine değindi. Tekniğin Sınırlamalar Burada sunulan yöntem, ECM proteinleri özünde daha çözünmez en hücre içi proteinlerin daha olduğu gerçeğine dayanır. Ancak, decellularization yöntemi burada açıklanan kesinlikle böyle bir büyüme faktörleri veya ECM-biçimlenme enzimler gibi ECM içinde bulunan çözülebilir bileşenleri ayıklar. Tarif edildiği gibi sıkı bir şekilde ECM proteinleri bağlı ECM ile ilişkili proteinler hazırlanan örneklerde proteomik ile tespit edilmiştir, ancak, bu yöntem tam olarak bileşimini profil çok katı olabilir matrisome ile ilişkiliproteinler. Diğer yöntemlere göre tekniğin önemi ara adımlar ihmal edilebilir ya da ECM protein kaybını önlemek ya da sırasıyla, hücre içi proteinlerin kirletici tükenmesi geliştirmek için tekrarlanır: diğer yöntemlere göre, burada sunulan yöntemin avantajı, ilgi ECM doğasına uygun olmasıdır. Bu yöntem, aynı zamanda, sadece takip eden peptid hazırlanması ve kütle spektrometrisi ile etkileşimi önlemek için kapalı durulanır deterjan az miktarda kullanılır. Son olarak, peptidlere ECM zengin protein preparatları sindirimi için tarif edilen yöntem aynı zamanda proteinler çözünür ve sanayide &quot;ham&quot; ECM zenginleştirilmiş fraksiyonları üzerinde yapılabilir gerekmeyen avantajına sahiptir. (Örneğin, guanidin hidroklorür gibi) çaotroplar kullanan alternatif decellularization yöntemleri kütle spektrometresi ile ECM&#39;lerin kompozisyon incelemek için b vareen (14 gözden) literatürde bildirilen ve kıkırdak 15,16, kalp 17, meme bezi 18 ve damar 19 ve glomerüler 20 temel zarların ECM bileşiminin karakterize edilmesi için kütle spektrometresi ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Öneriler ECM analiz takip eden proteomik için zenginleştirilmiştir halinde tripsinizasyon kısmen ECM sindirim ve ECM protein ve peptid kaybına neden olacak şekilde hücreleri sindirimi tripsin kullanılarak Decellularization yöntemleri, kullanılmamalıdır. Kollajenaz sindirim dokusu bozulması yardım için kullanılacak olsaydı ECM sindirim ve ECM protein ve peptid kaybına neden olur Benzer şekilde, dikkatle takip edilmesi gerekir. Gelen çözeltisi genel olarak jel sindirim? ECM proteinleri 3x Laemmli tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon haline getirildi bile ve 100 mM DTT, ayrı bir PO (% 6 SDS ihtiva eden), çapraz bağlanmış ve yüksek çözünürlüğü olan veSDS jelleri üzerinde orly. Böylece-jel sindirim tercih edilen bir yöntem değildir. Gelecekteki uygulamalar Burada tartışılan olmasa da, decellularization sırasında toplanan ara fraksiyonların her birinin kompozisyonu da kütle spektrometresi ile analiz edilebilir, dikkati çekiyor. Çok küçük bir numune (örneğin, insan biyopsileri) ya da eğitim Bu, özellikle yararlı olabilir bilgileri, diğer hücresel fraksiyonları üzerinde arzu edilir.

hücre dışı matris (ECM) kısmen, hücreler ve parametreler için mimari destek ve tutunması çapraz bağlanmış ve glikosile edilmiş proteinler, dokuların biyomekanik özellikleri 1,2 karmaşık bir ağ örgüsü olan. ECM proteinleri de hücrelere doğrudan reseptörleri (örneğin, integrinler, syndecans, vs.) ya da 3 Büyüme faktörü sinyal iletiminin düzenlenmesiyle işaret etmektedir. ECM böylece vb çoğalması, yaşam, polarizasyon, farklılaşma, göç gibi hücresel süreçlerin önemli düzenleyicileri biyofizik ve biyokimyasal ipuçları sağlar ECM fizyolojisi, geliştirme ve 4 yaşlanma kilit roller oynar. Ayrıca, bu tür kalp-damar hastalıkları, fibroz, kas-iskelet hastalıkları, kanser gibi çeşitli patolojiler, neden olduğu ya da ECM değişiklik ile sonuçlanır. Ayrıca, ECM kök hücre nişler bakım katkıda bulunur ve inci anahtar ECM molekülleri tanımlamakDestek stemness doku mühendisliği ve rejeneratif tıp 5 direkt uygulama olacaktır. Ancak, onun önemine rağmen, ECM kalmıştır, yakın zamana kadar, 6 kadar yeterince. In silico analiz ECM ve ECM ile ilişkili proteinlerin topluluk olarak tanımlanır matrisome, insan ve fare hem de genomlarında 1,7,8 birkaç yüz gen ürünlerini içermesidir olduğunu ortaya koymuştur. Ancak, ECM proteinlerinin çözünmezliği normal ve patolojik numunelerin in vivo hücre dışı matris kompozisyon sistematik karakterizasyonu engellemiştir. 10 - Biz son zamanlarda bu çözünmezliği avantaj döndü olabilir ve ECM proteinler 8 zenginleştirmek için kullanılan gösterdi. 10, 13 - Bu ve diğerleri ayrıca kütle spektrometresi ECMlerin 8 bileşimini karakterize etmek için tercih edilen bir yöntem olup olduğunu göstermiştir. BizBurada farklı pH ve tuz ve deterjan konsantrasyonları tamponlarda sıralı inkubasyon oluşan bir decellularization prosedürü tarif. Ekstraksiyon (veya tükenmesi) sitozolik, nükleer, membran ve hücre iskeleti proteinleri ve ECM proteinleri zenginleşmesine Bu prosedür sonuçları. Daha sonra kütle spektrometresi ile sonraki analiz için peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein hazırlıklarını sindirimi nasıl açıklar. Ayrıntılı ve burada gösterilen prosedürler kullanılarak, başarılı bir şekilde ilave edilen ve kütle spektrometrisi ile karakterize edici özelliği, on farklı doku ve tümör türleri hücre-dışı matrisler: normal fare akciğer 8, insan ve murin kolon 8,9, insan karaciğer 9, insan kolorektal tümörler ve türetilmiş karaciğer metastazı 9, melanom ksenogrefleri 8, (yayınlanmamış Nebe ve ark.,), meme tümörü ksenogrefleri 10, murin pankreas adacık ve murin İnsülinomalar. Farklı matrisom karşılaştırılmasıes başka potansiyel diagnostik veya prognostik biyolojik olarak kullanılabilir doku ve tümöre özgü ECM imza ortaya koymuştur. Bu prosedür, bir ya da nispeten küçük değişikliklerle, başka örneklerde uygulanabilir olduğuna inanıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

hücre dışı matris (ECM) ECM kardiyo-vasküler de dahil olmak üzere gelişme ve çeşitli patolojilerin önemli roller oynadığı hücre proliferasyonu, canlılığı, göç, vb önemli regülatörleri olan, biyofiziksel ve biyokimyasal işaretler sağlamaktadır çapraz bağlı proteinlerin kompleks bir ağ örgüsü olan ve kas-iskelet sistemi hastalıkları, fibrozis, ve kanser. Bu nedenle, normal ve hastalıklı dokuların ECM&#39;lerin bileşiminin karakterize yeni bir prognostik ve tanısal biyolojik ve potansiyel yeni terapötik hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. Ancak, ECM proteinleri doğası (boyutu büyük çapraz bağlı ve kovalent bağlı, ağır glıkosıle) zorlu ECMs biyokimyasal analizler hale gelmiştir. Bu zorluğu aşmak için, ECM proteinlerinin çözünmezliği yararlanır taze veya dondurulmuş doku ve tümörlerden ECMs zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi. Biz burada detaylı sıralı i oluşur decellularization prosedürü tarifFarklı pH ve tuz ve deterjan konsantrasyonları tamponlarda ncubations ve 1&#39;de sonuçlar) hücre içi (sitozolik, nükleer, membran ve sitoskeletal) protein ve ECM proteinleri 2) zenginleştirme çıkarma. Biz o zaman deglycosylate ve kütle spektrometresi ile sonraki analiz için peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein hazırlıklarını sindirimi nasıl açıklar.

Decellularization prosedürü kalite kontrolü decellularization etkinliği western blot ile her bir fraksiyonun protein içeriğini analiz ile izlenebilir. diyagnostik değer 2 listeleri proteinleri Tablo decellularization prosedürü kalitesini değerlendirmek için. Şekil 2A, sitosolik ara kısımların etkili ekstraksiyon (GAPDH gösterir ), çekirdek (histonlar), membran (β1 integrin) ve sitoskeletal (aktin) proteinleri, ECM proteinleri (kolajen I) Bu fraksiyonlar saptanır etmiştir (Şekil 2). Buna karşılık olarak, final peleti ECM proteinleri için zenginleştirilir ve büyük ölçüde hücre içi protein (Şekil 2A). Aktin de tespit edilebilir, her ne kadar Şekil 2B, tatmin edici bir hücre içi protein tükenmesi (bir histon ECM bakımından zengin fraksiyon tespit edilir) sunulur tüketilmiş ECM-zengin fraksiyon ve monomerik kollajen I tükenmesi- Görünür molekül ağırlığı ~ 110 kDa, varsayımsal bir birleştirilmemiş kollajen tekabül eden - CS fraksiyonunda gözlenebilir. Bazı dokularda bu bileşenler kısmen önceden fraksiyonlar 8-10 içinde çözünmüş olabilir, ancak biz de rutin olarak, örneğin fibronektin ve laminin gibi ek ECM proteinlerini izler. Örneğin, fibronektin da ECM dahil değil gibi çözünebilir plazma fibronektin oluşur. Ekstraksiyon öncesinde dokuların perfüzyon fibronektin konsantrasyonunu azaltır, ancak her zaman ortadan kaldırmaz. Bazı dokularda Lamininler bulunan gevşek hücre yüzeyi ya da ara fraksiyonlarda ECM ve özü ile ilişkilidir. Bu durum ortaya çıkarsa o ekstraksiyon koşulları (Tartışma) değiştirilerek ele alınabilir. ECM proteinleri ve hücre içi bileşenlerinin aynı zamandaki azalması zenginleştirilmesi farklı tamponlar proteinlerin nispi çözünürlüğüne dayalı olduğunu not edin. ThFarklı dokulardan arasındaki farklılık ise - bazı durumlarda histon ve aktin daha kolay diğerlerine göre daha ayıklanır. Ayrıca histonlar N fraksiyonu (Şekil 2B) çıkarılan bekleniyor, ancak biz sık sık M veya CS fraksiyonu (Şekil 2A ve B) histonların daha tam tükenmesi gözlemlemek, dikkat. Gösterge peptid konsantrasyonu tahmin sindirim, asidifikasyon ve tuzunun alınması işlemlerinden sonra elde edilen peptid çözeltisinin konsantrasyonu, spektrofotometri ile, ya triptofan, tirosin karşılık gelen 280 nm dalga boyu kullanılarak peptit solüsyonunun absorbans ölçülerek, ya da peptidin absorbansa karşılık gelen 205 nm dalga boyu kullanılarak ölçülebilir tahviller. (Sırasıyla, 82 mg, 100 mg ve 100 mg), üç fare akciğerleri örneklerin decellularization elde edilen peptid çözeltilerinin konsantrasyonu ölçüldü prepa424 ng / ml, 450 ng / ml, sırasıyla peptitler 580 ng / ml: Kırmızı paralel olarak ve her biri üzerinde elde edilmiştir. Kütle spektrometresi ile ECM peptidler tanımlanması Burada tarif edildiği gibi hazırlanan ECM zenginleştirilmiş protein örnekleri, bileşimin kütle spektrometrik analizi, sinyal yoğunluğu&gt;% 70 ECM ve ECM ile ilişkili proteinlerin 8-10 tekabül göstermiştir. Doku veya tümör, 100 mg (ıslak ağırlık) decellularize kompartman Ekstraksiyon kiti reaktifler Tablo 1. Cilt. Bu tablo bir bileşim, doku ya da tümör 100 mg decellularization yapmak için kullanılan her tampon hacmi listeler. Proteaz inhibitörleri kokteyli bir 50x çözelti olarak sağlanan ve her bir tamponun 2 eklenmesi ihtiyacı vardır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bölme Protein Ekstraksiyonu Kit Reaktifler </td><td> 100 mg doku için ses </td><td> Kompozisyon (Millipore datasheet kedi # dayanan 2145 1) </td></tr><tr><td> Tampon Cı </td><td> 500 ul </td><td> HEPES (pH 7.9 3), MgCl2, KCI, EDT 4, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat 5 </td></tr><tr><td> Tampon W </td><td> 400 ul </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat </td></tr><tr><td> Tampon N </td><td> 150 ul 2 x </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCI2, NaCI, EDTA, gliserol, sodyum ortovanadat </td></tr><tr><td> Tampon W </td><td> 400 ul </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat </td></tr><tr><td> Tampon M </td><td> 100 ul </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum deoksikolat (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Sodyum ortovanadat </td></tr><tr><td> Tampon CS </td><td> 200 ul </td><td> BORU (pH 6.8), MgCI2, NaCI, EDTA, sakaroz, sodyum dodesil sülfat (SDS), 7, sodyum ortovanadat </td></tr><tr><td> Tampon Cı </td><td> 150 ul </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCI2, KCI, EDTA, sukroz, gliserol, sodyum ortovanadat </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 ul / yıkama </td><td> - </td></tr></tbody></table> Notlar: 1 tescilli nedenlerden dolayı, biz kiti tedarikçiden tampon kesin bileşimini elde koyamadık, ama biz burada benzer çekimi yapmak için ev yapımı tamponlar kullanarak kendi deneyimlerine dayanarak bazı notlar yer alıyor. 2 proteaz inhibitörü: bu gibi sistein, serin ve treonin peptidazlar, serin esteraz, iki değerli katyon bağımlı metalloproteinaz karşı inhibitörlerin çeşitli dahil edilmesi tavsiye edilmektedirPek çok ticari olarak temin edilebilir proteaz inhibitörü kokteyl bulunmaktadır. 7.0 Yukarıdaki 3 pH lızozomal proteazlarının etkili bir inhibitörüdür. (Genellikle 2 mM&#39;de kullanılan) 4 EDTA iki değerlikli katyon bağımlı proteazların etkin bir inhibitörüdür. 5 Sodyum ortovanadat, bir fosfataz önleyicisidir. Tipik bir etkili konsantrasyonu, 0.5-5 mm olacaktır. % 0.1% -0.5 6 NP40 en membran lipidleri çözündürülmesi için yeterli olmaktadır. NP40 ve DOC kombinasyonu - genellikle hala bozulmamış birçok protein-protein etkileşimlerini yaprakları daha sıkı ekstre olarak kullanılır - genellikle (örneğin, her biri% 0.5), eşit konsantrasyonlarda kullanılmaktadır. 7 SDS daha sıkı iyonik deterjan (CMC% 0.1) &#39;dir. Bu, aynı zamanda, diğer iki deterjan SDS / NP-40 / DOC, bir orta sertlik tampon olarak 0.1 / 0.5 /% 0.5 ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Tablo 2. Teşhis proteinlerdecellularization prosedürü kalitesini izlemek. Bu tablo decellularization prosedürü kalitesini ve verimliliğini izlemek için kullanılabilen her hücre içi bölmenin (sitosol, çekirdek, plazma membranı, hücre iskeleti ve ECM) özellikleri olan proteinlerin örnekleri listeler ECM-zenginleştirme. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hücre içi Bölme </td><td> Tanı Proteinler </td></tr><tr><td> Sitosolik proteinlerdir </td><td> Gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) </td></tr><tr><td> Nükleer proteinler </td><td> Histonlar, Laminler, Nucleoporin </td></tr><tr><td> Membran proteinleri </td><td> İntegrinler, Transferrin Reseptör </td></tr><tr><td> Sitoskeletal proteinler </td><td> Aktin, Tübülin, Vimentin </td></tr><tr><td> Bazal membran ECM proteinleri </td><td> Kolajen IV, Nidogens, Lamininler </td></tr><tr><td> İnterstisyel ECM proteinleri (interstisyel) </td><td> Kolajen I, Kolajen III, Kolajen VI, Fibronektin </td></tr></tbody></table> Antikorlar üzerinde öneri için, yayınları 8-10 bakın. Peptidler içine ECM zenginleştirilmiş örnekleri sindirmek reaktiflerin Tablo 3. Cilt. Bu tablo ECM-zenginleştirilmiş protein örnekleri tekrar süspansiyon ve azaltmak, alkilleştirir, deglycosylate ve kütle spektrometresi analiz öncesi peptidler içine proteinlerin örnekleri sindirmek için kullanılan reaktif listeler. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> Hazırlık </td><td> 1 mm kalınlıkta bir pelet için nihai konsantrasyon / Miktar (~ 5-10 mg kuru ağırlık) </td><td> 1 mm kalınlığında pelet için Volume (~ 5-10 mg kuru ağırlık) </td></tr><tr><td> Amonyum bikarbonat (NH4 HCO 3) </td><td> HPLC dereceli su içinde 100 mM çözelti, </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Üre </td><td> 100 mM amonyum bikarbonat içinde 8 M çözelti </td><td> 8 M </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Ditiyotreitol </td><td> 500 mM&#39;de HPLC dereceli su ile sulandırın </td><td> 10 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Iyodoasetamit </td><td> 500 mM&#39;de HPLC dereceli su ile sulandırın </td><td> 25 mM </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> Peptid N glikosidaz F (PNGaseF) </td><td> 500 U / ul ticari çözüm </td><td> 1000 U </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Endoproteinaz lvsC, kütle spektrometresi dereceli </td><td> 0.5 ug / ul HPLC dereceli su ile sulandırın </td><td> 1 ug </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Tripsin, kütle spektrometresi dereceli (yuvarlak 1) </td><td> 0.5 ug / ul ticari çözüm </td><td> 3 ug </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Tripsin, kütle spektrometresi dereceli (yuvarlak 2) </td><td> 0.5 ug / ul ticari çözüm </td><td> 1.5 ug </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> Trifluoro-asetik asit (TFA) </td><td> HPLC dereceli su içinde% 50 çözelti, </td><td> - </td><td> 2-5 ul </td></tr><tr><td> Asetonitril (elüsyon) </td><td> HPLC dereceli su içinde% 0.1 TFA ile% 60 çözelti, </td><td> - </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Asetonitril (sulandırma) </td><td> HPLC dereceli su içinde% 0.1 TFA ile% 3 solüsyonu </td><td> - </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table><img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Deneysel işlemin Şekil 1. Şema. Protoco şematik iş akışıl, dokular (Bölüm 1) decellularize decellularization kalite kontrol ve ECM zenginleştirme (Bölüm 2) değerlendirmek ve kütle spektrometresi analizi (Bölüm 3) öncesinde peptidler içine ECM-zenginleştirilmiş protein örnekleri sindirmek için. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Western blot ile decellularization prosedürü Şekil 2. kalite kontrolü Western blotlar murin akciğer (A) ve insan meme karsinoma ksenogreft (B) Aşağıdaki antikorlar kullanılarak numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tavşan anti-aktin (klon 14-1) ve tavşan anti- -β1 laboratuvarda üretilen antikorların integrin; tavşan anti-kolajen I, fare anti-GAPDH ve tavşan anti-pan-histon antikor Millipore&#39;dan edildi. Primer antikor inkübasyonunun ardından zarlar yıkandı ve HRP-konjuge keçi anti-tavşan veya keçi anti-MM varlığında inkübeJackson ImmunoResearch Laboratuvarı se ikincil antikor. Son olarak zarlar yıkandı ve Batı Yıldırım ™ kimyasal parıltı maddesi (PerkinElmer LAS) içinde kuluçkalanmıştır. * ECM zengin fraksiyonun minimal rezidüel histon kontaminasyonu gösterir. ** CS fraksiyonunda monomerik (karine birleştirilmemiş) kollajen I kısmi tükenmesi gösterir. *** ECM zengin fraksiyonun kalan aktin kirlenmesini gösterir. anti-kollajen antikoru ile tespit yayma post-translasyonel modifikasyonlar (örneğin, çapraz-bağlama, glikosilasyon) farklı düzeylerde gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

enrichment-extracellular-matrix-proteins-from-tissues-digestion-into

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

26.8K Görüntüleme.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

Video: Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...