Yazarlar Nisan Wiles ve Dr. Roger Broderson sırasıyla hayvan nekropsi ve bezi yalıtım, hakkında yardım almak için kabul etmek istiyorum. Bu iş için fon Philadelphia üniversite osteopatik tıp merkezleri tarafından kronik bozuklukları, yaşlanma için destek verdi.

hayvan bireylerde bu iletişim kuralı ile ilgili yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Philadelphia Osteopatik Tıp Fakültesi tarafından onaylanmış ve tüm teknikleri sıkı altında yapılmıştır Etik kurallar.
 1. örnek satın alma ve işleme <ol><li>seçin uygun hayvan konu ve CO 2 odası yerine. Bu deneme için 8-10 hafta kullanan eski dişi nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J ve C57BI/6J.</li>
	<li>Gaz akışı açmak % 30-40. Bir kez hayvan yaklaşık 2 dakika sonra gözle görülür bilinci yerinde değil, ek bir 5 dakika süreyle tam basınç için gaz vanası açık 
	Not: hayvan ölüm (örneğin göğüs hareketi) CO 2 teslim bırakma sonra bir 10 dakika boyunca nefes görünür işaretleri gözlemleyerek onaylayın. Hayvan hala hayatta olsa, geri CO 2 odasında yerleştirilebilir. Servikal yerinden çıkması da kan diseksiyon sonuçları çalışmasına mani meme dokuları çevresinde biriktikçe tavsiye edilmez, ancak kullanılabilir.</li>
	<li>Kurban, ardından pin karkas sırtüstü pozisyonda ve % 70 etanol ile emdirmek.</li>
	<li>Yukarıda forseps kullanarak pubis pelt pinch ve küçük Cerrahi makas ile nick. Makas, döner kesme taşıma ventral orta çizgi boyunca pelt Kaudal kafatası için.</li>
	<li>Daha büyük makas veya bir hemostat ile açık açık subkutan fasya bilateral, karın zarını delmek değil dikkatli kullanarak incelemek. Yatay kenar boşlukları boyunca belgili tanımlık kesme distal her iki uçta da kesti.</li>
	<li>PIN pelt Kapakları açın ve tekrar % 70 etanol ile sprey. 
	Not: her ne kadar % 70 etanol bezi ve çevresindeki subkutan doku arasında daha iyi görsel ayrım açiktir, doku kullanımı Bu çözümün sonucu kurutma önlemek dikkatli olun. Kurutma önlemek için 4 dk aşmayacak şekilde bir zaman dilimi içinde bezi kaldırın. % 70 etanol için alternatif olarak, araştırmacı da doku kuruma önlemek için 1 x PBS gibi genel bir ayrı tutma tampon yerine kullanabilir.</li>
	<li>İlgi, meme dokuları bulma slayt boyunca meme bezi ve ilişkili Kutanöz yağ dermis ücretsiz kesme pelt flep içine #4 neşter blade. 
	Not: 3,5 x cerrahi mikro büyüteçler bezleri daha kolay görsel öğeyi yardımcı olabilir.</li>
	<li>Hemen daldırın konik tüp için 24-48 h % 10 tarafsız tampon formalin 10:1 çözüm-doku hacmi içeren yeni izole bezi 
	Not: paraformaldehyde, genomik çalışmalar ve ticari olarak mevcut RNA arabellekleri korunması için etanol gibi birçok alternatif Fiksajlar çalışma amacı bağlı olarak, kullanılabilir.</li>
	<li>Parafin katıştırma için kurumsal iletişim kuralları izleyin, bize örnek katıştırma, satıcıya işleme ve montaj Dilimleme/slayt. Bölüm 5 mikron, dokulara. 
	Not: aşırı yağ çevreleyen bezi nedeniyle 100-200 µm kesit ve boyama önce doku kaldırmayı düşünün.</li>
</ol> 2. Doku Staining <ol><li>ısı blokta lekeli için immünhistokimya <ol><li>yer slaytlar ayarla, parafin eritmek 1 h için 58 ˚C. 
		Dikkat: parafin balmumu erime slaytın dışına çalışmaya başlayabilir. Yakından izleyin veya yer silme ikinci tur balmumu yakalamak için slaytın altında. 
		Not: Bu adım gerekli değildir ve atlanabilir. Sonuçlar beklendiği gibi değilse, bu adımı geri ekleme sonuçları artırabilir.</li>
		<li>Incubate slaytları bir slayt içeren % 100 Ksilen 30 dk tam batma sağlanması için jar. Bir kez yineleyin. 
		Not: Bu noktada, doku bölümlerde yağ dokusu ve parafin serbest olduğundan emin olmak için görsel muayene yapılmalıdır. Ek yağ dokusu veya balmumu belirgin ise, slayt Ksilen içinde yeniden ve sular altında. Bu doku büzülme neden olabilir gibi eklenen Ksilen maruz en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
		<li>% 100 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz rehydrate dokularda bir kez yineleyin.</li>
		<li>Hareket slaytlar % 95 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz için bir kez yineleyin.</li>
		<li>Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 75 etanol 5 dakika süreyle hareket</li>
		<li>Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 50 etanol 5 dakika süreyle hareket</li>
		<li>Kaynatın 10 mM sodyum sitrat çözüm (pH 6.0) sıcak bir tabak veya mikrodalga ve Coplin kavanoza dökün. 
		Uyarı: Dikkatli bir şekilde çözüm Isıtma sırasında izlemek ve üzerinde kaynatın önlemek için dikkat ediniz. Konteyner çok sıcak olacak. Yanık önlemek için koruma kullanın.</li>
		<li>Yavaş yavaş Coplin yer slaytlara jar, tam batma, sağlanması, epitopları almak 10 dk 100 ° C'de kuluçkaya. Kaldırmak ve dikkatle slaytlar kuru.</li>
		<li>Bir engel etrafında doku hidrofobik bir marker ile çizin. Yeterli endojen enzim engelleyici ekleyin (hidrojen peroksit ve sodyum azid, mevcut ticari olarak) ve doku kapağı için 10 dk. kuluçkaya</li>
		<li>10 dakika süreyle saline (PBS) Submerge slaytları 1 x fosfat tamponlu</li>
		<li>Eklemek yeterli % 10 eşek serum ve doku kapsayacak bir oksijen odası oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya 1 x PBS içinde. 
		Not: Deneme burada slaytları oksijen Odası 4 ° C'de gecede depolayarak duraklatılmış. Eşek serum en iyi boyama sonuç vermeye bulundu iken, araştırmacı sığır serum albumin (BSA), keçi serum veya en iyi sonuçları belirlemek için at serum gibi farklı sera sınamak isteyebilirsiniz. BSA kullanıyorsanız, araştırmacı bu taze kullanmadan önce hazırlamalıdır.</li>
		<li>Aşırı engelleyici slaytlardan dikkatle boşaltmak ve düzgün seyreltilmiş birincil antikor doğrudan slaytlara doku eşit olarak çözümde kaplıdır sağlanması % 1 serum eklemek. Oksijen odası oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. 
		Not: Bu adımı uzun zaman süreleri için nemli Odası 4'te depolanmış devam ° C. bu adımda doğru negatif kontrol slaytlar (örneğin bir slayt ile bilinen antijen-negatif doku, vb hiçbir birincil antikor) eklemek emin olun.</li>
		<li>Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya</li>
		<li>Aşırı PBS dikkatle boşaltmak ve doku kapak ve 30 dk içinde oksijen odası için kuluçkaya için yeterli horseradish peroksidaz etiket ekleyin. 
		Not: Bu adımda, araştırmacı fluorescently konjuge ikincil antikorları kullanarak boyama floresan için devam etmek isteyebilirsiniz. Bu isterseniz, açıklanan sonraki adımları uygun şekilde değiştirilmesi.</li>
		<li>Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya</li>
		<li>Yapmak diaminobenzidine (DAB) Kromojen çözüm üretici önerilen oranı göre artı ve mix gönderen vortex. 
		Not: Birçok hazır kitleri piyasada bulunan bu protokol için kullanılan bir kenara.</li>
		<li>Decant fazla tampon slaytlardan ve 2-3 damla Kromojen leke (10-50 µL) doğrudan dokuların ekleyin ve nemli odasında 5 min için kuluçkaya. Dikkatle doku üzerinde slayt akan yaklaşık 1 mL diH 2 O tarafından yıkayın. 
		Dikkat: DAB-Kromojen çok zehirli. Tehlikeli atık içinde kapalı leke cilt ve toplamak akışı ile doğrudan temas önlemek.</li>
	</ol></li> <li>Hematoksilen ve Eozin (H &#38; E) <ol><li>son durulama Kromojen kuluçka sonra takip daldırın Harris Hematoksilen musluk suyu 1-2 dakika süreyle yavaşça altında 2-2,5 dk. durulama slaytlar için slaytlar 
		Not: su doku üzerine doğrudan jet önlemek için dikkat ediniz.</li>
		<li>Submerge farklılaşma çözüm (100 ml % 70 etanol hidroklorik asit 0.25 mL) 2-3 s için slaytlar. Slaytları musluk suyu yaklaşık 1-2 dakika süreyle yavaşça altında durulayın</li>
		<li>% 95 etanol için 30 60 s. durulama slaytlar için slaytlar mavi Agent (100 mL musluk suyundaki 9.4 için ayarlanır pH 4.5 mg kalsiyum karbonat) daldırın s.</li>
		<li>Alkollü Eozin Y 2-3 dakika süreyle Submerge slaytları</li>
		<li>% 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokusunda kurutmak.</li>
		<li>% 100 etanol 1 dk. değiştirmek Dehydrate doku 1</li>
		<li>Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma. 
		Not: farklı bir boyama yöntemi seçildi, farklı montaj medya gerekli olabilir. Örneğin, araştırmacı bir floresan Birleşik ikincil antikor seçerseniz, sulu bir Dağı daha ideal olurdu.</li>
		<li>Gecede oda sıcaklığında ayarlamak slayt izin.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius kırmızı (PSR) Staining <ol><li>lekeli ve immünhistokimya Protokolü (% 50 etanol emmek) adım 6 ile takip için slaytları seçin.</li>
		<li>PSR Submerge slaytları için 1 h. leke</li>
		<li>%0,5 Asetik asit 1-2 s, iki kez leke ayırt etmek için slaytları daldırın.</li>
		<li>% 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokularda kurutmak.</li>
		<li>Dehydrate dokularda % 100 etanol 1 dk. değiştirmek 1</li>
		<li>Temizleyin slaytlar kısa bir süre için % 100 Ksilen içinde hakkında batış tarafından 3-4 s.</li>
		<li>Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma.</li>
	</ol></li></ol> 3. Örnek analiz <ol><li>Duktal analizi <ol><li>seçin slaytlar lekeli α-SMA için. Kamera monte objektif ile donatılmış bir ışık mikroskop kullanarak toplamak temsilcisi imge vasıl 20 X büyütme.</li>
		<li>Kullanma ImageJ (NIH), ayırt etmek ve kanalları her görüntüde saymak. Bunlar el ile numaralandırılan veya bir sayısal puanı için bireysel kanalları devredebiliriz. Bir sayısal puan atamak için ImageJ açın ve eklentileri seçin. Analiz seçin ve açılır menüsünden hücre sayacı seçin. Başlat'ı tıklatın sonra tip kanalları etiketleme başlamak için 1 vurgulayın. Ne zaman tamamlanmak, duktal sayısı görüntülemek için sonuçları seçin. 
		Not: duktal ve değil vasküler yapılardır doğrulamak için dikkat ediniz.</li>
		<li>İçinde &#39; ölçüm ayarla &#39; seçenekleri, kontrol &#39; çevre &#39; ve &#39; alan &#34;.</li>
		<li>Bir serbest Çokgen aracını kullanarak myoepithelial yuvası (α-SMA leke tarafından destekli görünürlük), her kanal etrafında bir çizgi çizin. Seçin &#39; ölçü &#39; ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.</li>
		<li>Tekrar bir serbest Çokgen aracını kullanarak duktal epitel apikal tarafında bir satır Lümen içi içinde çiz. Seçin &#39; ölçü &#39; ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.</li>
		<li>Myoepithelial bölme luminal bölmesinin gelen çevre çevre duktal epitel çevresi elde etmek için çıkarma. Duktal epitel alanı elde etmek için myoepithelial bölme alan luminal bölme alan çıkarma.</li>
	</ol></li> <li>İmmünhistokimya analizi <ol><li>Upload aydınlık alan görüntüleri bir analitik yazılım, ImageJ veya FIJI Suite gibi. 
		Not: Bu protokol analiz ImageJ ve IHC Toolbox eklentisi kullanarak boyama için özet bilgiler.</li>
		<li>IHC araç kutusu eklenti menüsünden açın. İçinde &#34; Model Seç &#34; açar, uygun leke seçin açılan kutu (Yani H-DAB, PSR, vb). Seçin &#34; renk &#34; leke yalıtmak için seçeneği. Bu bir sonuç penceresi açılacaktır. 
		Not: Bu yöntem ilgi bir proteinin hücre dışı veya sitozolik alanlarda yer alan veya plazma zarı bağlı uygundur. Faiz protein nükleer ise, seçme &#34; çekirdeği &#34; olumlu lekeli çekirdekler için görüntü analiz etmek için eklenti isteyecektir.</li>
		Renk Seçici'yi slayt kullanmak uygun yalıtım olmadan arka plan içerme veya dışlama aşırı leke leke emin olmak için <li>. 
		Not: otomatik mod leke tespit edemiyor veya kabul edilebilir Albümdeki yol açmaz, bir kare bölgesi faiz (ROI) üzerinde tanımlanan bir bölge lekeli çizin. IHC Toolbox penceresi seçin &#34; tren &#34; uygun hedef eklentisine yönetecek.</li>
		<li>16-bit için resmi dönüştürün. Gidin görüntü &#8594; türü &#8594; 16 bit.</li>
		<li>Eşik görüntü. Gidin görüntü &#8594; ayarlamak &#8594; otomatik eşik.</li>
		<li>Görüntü ölçüm ölçek uzunluğu atama görüntüde bir hattı yatırım Getirisi ölçek çubuğu üzerinden doğrudan çizerek ayarlayın. Ölçek çubuğu ayarlamak için'gidin analiz &#8594; ölçeği ayarla. Piksel uzunluğu (örneğin 120 piksel / 50 µm) istenen birim sayısını girdi.</li>
		<li>Sonuç alan ölçmek ve gri değeri demek. Gidin analiz &#8594; ayarla ölçümleri ve ölçüm tıklatarak toplamak analiz &#8594; ölçü birimi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+cancer+cell-derived+extracellular+matrix+in+tumor+progression.">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li><li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+biology+and+implications+for+treatment.">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin,+fibronectin,+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer:+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression.">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting.">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li><li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+tumor/stromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients.">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li><li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts.">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li><li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers.">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li><li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2009).</li><li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation.">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li><li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands.">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).</li><li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation.">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li><li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland.">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gazetede, olduğu gibi fare meme dokuları duktal morfoloji ve ECM ifade aşağı akım histolojik analizler için yalıtmak için bir teknik anlatmıştık. Duktal Morfoloji analizleri ile ilgili olarak, duktal mimarisi lekeli histolojik kesitler kapalı tabanlı hızlı incelenmesi bu yöntemi sağlar. Duktal analizleri diğer yöntemleri görselleştirme duktal ağacının etkinleştirmek için boya teknik olarak zor ve zaman alıcı olabilir yöntemleri enjeksiyonlari güveniyor.
Meme Kanserinde ECM anormal olduğu bildirilmiştir. 1 , 2 , 6 , 9 özellikle, ECM bereket ve/veya cross-linking şekillerindeki değişiklikleri tümör ilerleme, metastaz ve terapi direnç3,4,6,7 etkilemeye bildirilmiştir ,8,9. Ayrıca, değişiklikleri ECM ortamında da potansiyel olarak tümör başlatma lehine bir durum için önde gelen duktal epitel hücre morfolojisi ve nükleer silahların yayılmasına karşı17, değiştirmek için rapor edilmiştir. Biz bir caveolin-1 eksik hayvan modeli ECM ifade ve duktal Morfoloji caveolin-1 kaybı aşağıdaki değişiklikler değerlendirmek için kullanılan iken, bir herhangi bir fare modeli bu yöntemleri uygulanabilir. ECM ifade desenleri ve duktal mimari değerlendirmek için aşağı akım histolojik analizler için bütün, olduğu gibi meme dokuları yalıtmak için bir teknik açıklar. Bu metodoloji sonuçlarından sağlam analizleri glandüler morfoloji ve ECM ifade vermiştir. Bu çözümleme ECM ifade, özellikle fibronektin, 100-200 µm yüzeysel doku kesit ve daha kapsamlı bir resmi glandüler fibrozis vermiştir boyama önce kaldırıldı bölümlerden bulduk. Ayrıca, biz eşek serum BSA aksine kullanımı daha iyi kaliteli histolojik örnekleri içinde non-spesifik boyama önemli ölçüde düşürülmüştür vermiştir bulundu.
Duktal mimari analizleri için içindeki doku sağlam ve içinde kırılma noktaları, uygun olmayan doku işleme sonucu kanalları içeren ve kesit, belirgin olmayan bölümleri kullanmak önemlidir. Ayrıca, doğru duktal şubeleri, bir dedektif ölçmek isteyebilirsiniz başka bir parametre ve kolayca kendi monolayer endotel tarafından tespit edilebilir damar yapıları ve Eozinofilik yapıları içinde ayırt etmek önemlidir Lümen CD31 ile boyama ek olarak. Kanalları çeşitli ECM protein, myoepithelial işaret αSMA ve H için lekeli bölümlerde gözlenen &#38; E counterstaining, hangi hücresel bileşeni olarak kanallarının, kanalları numaralandırılmasına vurgulanmış ve ilişkili herhangi bir şube H ile ulaşılabilir &#38; E lekeli doku bölümleri yalnız. Duktal morfogenez daha ayrıntılı analizlerini veya önceden neoplastik ve/veya neoplastik lezyonlar varlığı analizleri için bir dedektif confocal canlı ex vivo dokuları değerlendirmek için görüntüleme kullanmak isteyebilirsiniz. Bu durumda, hangi tüm bezleri eksize aynı tekniği fiksasyon ve adımları elimine işleme doku ile uygulanır.
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda hangi #4 karın bezleri kesin tanımlaması etkin kalmayıp Ayrıca bezinin diseksiyon örten dermis ve temel karın zarını izin cerrahi mikro büyüteçler kullanımını içerir. Önemli subkutan doku ve kasları dışlama boyama ve Histoloji girişim yağ ilişkili azaltılmış. Buna ek olarak, daha iyi bezinin ECM ifade değişiklikleri tanımlamak için 100-200 µm kalan yağ dokuları ortadan kaldırmak yardımcı doku blok kaldırmak yararlı bulduk. Bütün meme bezi yalıtım stromal protein ifade ve duktal morfogenez geniş değişiklikler doku üzerinde bilgi sağlarken, açıklanan tekniği seri bölümler analizi için sabit üzerinden sınırlı, parafin dokularda gömülü. Hangi değişikliklerin dereceye duktal içinde kurmak için dallanma meydana gelmiştir, Bütün Dağı görüntüleme canlı, eski-vivo dokuların gerekli olacaktır. Burada, bir dedektif Cre-Lox bezi belirli protein etkileşimler ya da18Imaging önce duktal ağaç aydınlatmak için bir boya kullanmak için özel, koşullu floresan muhabir conjugations tasarlamak için kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, daha fazla Batı leke veya kütle spektrometresi veya immunoprecipitation (klip) veya Kromatin cross-linking gibi diğer yüksek-den geçerek teknikleri kullanımı analiz proteinlerin bezinin bütünüyle ilgi gerektiren immunoprecipitation (ChIP). Bu durumda, tüm bezleri, küçük parçalar halinde kesitli ve aşağı akım analizleri için buna göre işlenmiş disseke. Buna ek olarak, bir de doku bölümlerde floresan görüntüleme kullanabilirsiniz. Bu teknik birden fazla protein ve protein ifade ortak yerelleştirme aynı doku analiz etmek için ideal olacaktır.
Özet olarak, biz bütün, olduğu gibi meme dokuları hızlı yalıtım sağlayan ve histolojik işleme ve duktal analizleri hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar bir tekniğini tanımlamak. Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar araştırmak ECM ifade ve tümörü taşıyan hayvanlarda duktal Morfoloji ilişkili değişiklikler. Ayrıca, kolajen Yönlendirme ve lif çapı, doku yoğunluğu, analiz etmek için yararlı olabilir bilgi analizleri bölümleri lekeli PSR üzerinde gerçekleştirilebilir.

Meme kanseri doku fibrozu1,2,3,4önemli bir derecesi ile karakterizedir. ECM anılacaktır, bu cep varlık derecelerde tüm dokularda bulunur ve öncelikle fibriler ve fibriler sigara collagens, elastin ve glikoproteinlerin yanı sıra çoğu çeşitli sinyal molekülleri karmaşık bir meshwork oluşur Bu matris münzevi. Homeostatik koşullar altında ifade ve ECM bozulma sıkı kontrol. 5 sırasında meme tumorigenesis, ECM ifade ve yıkımı dengesi bozulur. Bu nedenle, meme tümörleri bol ECM proteinler collagens, fibronektin ve tenascin-C diğerleri arasında gibi hızlı bildirilmiştir. 6 meme tümör ilerleme, metastaz ve terapi direnç1,3, tanıtmak için matris crosslinking artan şekillerinin yanı sıra bu proteinlerin anormal ifade belgelenmiş oldu 4,7,8,9.
ECM kompozisyon ve duktal Morfoloji değerlendirmek için olduğu gibi meme dokuları yalıtım gerçekleştirildi. Burada, caveolin-1 için kadın nulliparous fareler eksik kullanılan, agresif için bağlı bir integral membran protein meme tümör imza10,11,12ve kadın nulliparous B6 kontrol fareler. Histolojik işleme ve bu dokularda boyama duktal Morfoloji karakterizasyonu birlikte birkaç ECM proteinler tanımlaması izin.
Genel olarak, Bütün, olduğu gibi meme dokuları yalıtım araştırmacılar eksojen veya endojen faktörler cevaben meydana gelen doku çapında morfolojik veya hücresel değişiklikleri öğrenmek için fırsat verir. Dezavantaj-in teknik analizleri 2 Boyut (2D) doku bölümleri karşı karmaşık morfolojisi duktal ağacının daha kapsamlı bir resmi verim bir 3D perspektif ile ilişkilidir. Meme bezi gerçekleşecek hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, Bütün, bozulmamış bezlerinin yalıtım verimli duktal morfoloji ve protein ifade çeşitli bölgelerde meme antikorundan analiz etmek için avantajlıdır bezi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Entry software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-R Surgical Micro Loupes</td>
			<td>Rose Micro Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Magnification at researcher&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Medline</td>
			<td>DYND04035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Size appropriate for tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K400611-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792780</td>
			<td>suitable for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S1964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt&#39;s Mounting Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB23750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB108930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB124964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Envision Dual Link System HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology

#4 karın meme dokuları kadın nulliparous fareler gelen ECM ifade ve duktal mimari değerlendirmek için hasat için bu yordamı amacı oldu. Burada, deri altında küçük bir cep Mayo makas, subkutan doku içinde bezlerinin ayrılması temel karın zarını izin kullanılarak oluşturulmuş. Görselleştirme bezlerinin 3.5 kullanımı ile destekli x-R cerrahi mikro büyüteçler. Pelt ters ve geri izin olduğu gibi meme yağ yastıkları tanımlaması tutturulmuş. Her #4 karın bezlerinin açık açık neşter bıçak yanal subkutan katman ve bezleri arasında kaydırarak disseke. Hemen hasat sonrası, bezleri % 10 tarafsız tampon formalin sonraki doku işleme için yerleştirildi. Eksizyon tüm bezinin avantajlı çünkü öncelikle duktal epitel hücreleri ve kısmi biyopsi cevapsız microenvironmental diğer hücresel nüfus arasındaki önemli doku çapında etkileşimler hariç riskini ortadan kaldırır. Bir metodoloji analizleri duktal morfogenez ve protein ifade bezinin ayrı yerlere sınırlayan sabit dokular seri bölümleri kullanımını dezavantajıdır. Bu nedenle, 3 boyutlu (3D) duktal mimarisi ve protein ifadesindeki değişiklikleri kolayca elde edilebilecek değil. Genel olarak, teknik gelişim duktal morfogenez veya meme kanseri gibi aşağı akım araştırmalar için bütün olduğu gibi fare meme dokuları gerektiren çalışmalar için geçerlidir.

Dişi fareler meme dokuları 5 çift var. Özellikle, servikal bezleri (1), iki çift göğüs bezlerinin (#2 ve #3), karın bezleri (#4) bir çift ve kasık bezleri (#5) (Resim 1A) 1 Çift bir çift vardır. Burada, kolayca tanımlanabilir oldukları gibi #4 bezleri izole. İkisi arasında ayrım zor olduğu gibi bazı durumlarda, #4 ve #5 bezleri birlikte izole edildi. Sağlam #4 karın yalıtmak için meme dokuları, pelt tutturulmuş ve dikkatli bir şekilde (şekil 1B) bir okla gösterilen #4 bezleri konumunu açığa temel karın zarını ayrılmış. #4 bezleri dikkatle varlığına ve herhangi bir kalıntı subkutan veya kas doku varlığı için denetledi. Bunlar bizim izole bezleri (Resim 1C) tanımlanabilir değildi, biz önemli ölçüde daha fazla subkutan doku içinde doku değil kaldırıldı kesit önce doku bloklarla fibronektin lekeli bezlerinde Not (Örneğin yüzeysel) (Resim 1D) bezleri hangi 100-200 µm dokusundan dokusunun içinde blok kaldırıldı parça (örneğin önce derin) (Resim 1E) karşı. Doku fibrozis meme bezi eksojen veya endojen faktörler cevaben de daha iyi anlaşılmasını sağlamak için araştırmacı fibrozis de karşılaştırmak hazırlayabilirsiniz karşı bezinin derin kesikler yüzeysel. Diğer analizler için ilerleme-e doğru doku dilimleme ve önemli Eğer subkutan boyama ve/veya kas dokusu bezi diseksiyon takip mevcuttur önce ikiye doku blok bölüm için dedektif için avantajlı olabilir.
Yalıtım, bezleri % 10 tarafsız tampon formalin içinde sabit, işlenen ve boyama için kesitli. Ek olarak diğer protein kollajen ifade ilgi analiz etmek için kullanılan adımları şekil 2Atasvir edilir. ECM proteinler kolajen, fibronektin ve tenascin-C temsilcisi örnekleri Şekil 2' deBgösterilir. Oklar her görüntülerin kanallarını varlığı bu dokularda (Şekil 2B) gösterir.
Morfolojik özellikleri olarak kanallarının ölçmek için yanlış işleme hasarlı doku ve ölçülebilir olmayan kanalları neden olabileceğinden histolojik bölümleri bakımı ile tedavi etmek önemlidir. Uygunsuz kullanım örnekleri arabellekleri veya su doğrudan dokular, uygunsuz bir sıcaklıkta arabellekleri kullanarak veya daha uzun bir süre daha belirtilen iletişim kuralı için doku örnekleri sodyum sitrat ve Asetik asit gibi sert arabellekleri bırakarak üzerinde çalışıyor olabilir. Hangi dokuda hasar oluştu bir doku bölümü örneği şekil 3' teAgösterilir. Burada, büyük zarar doku için kırılma noktaları kanalları (şekil 3A) olarak kolayca görülebilir. Bir bölümü bu gibi duktal yapıları analizleri için kullanılamaz. Şekil 3' teBkanalları ölçülebilir ve ölçülebilir nerede bir sağlam doku örneği örneği gösterilmiştir. Burada, kanalları değildir sadece çevredeki fibronektin lekeli stroma tarafından karakterize, ama aynı zamanda yoğun bir nüfus kanalları (şekil 3B) Lümen astar epitel hücrelerinin varlığı ile karakterizedir. Geliştirme sırasında fare meme bezi tek bir kanal üzerinden bir dizi dallanma ve regresyon her estrous döngüsü ile uğrar bir daha karmaşık duktal ağacı oluşturan hangi yanal ikincil dalları Fideler, doğumda içerir unutmamak gerekir 13. her ne kadar biz bu deneyler hayvanlarda estrous döngüsünü dikkate almamış, araştırmacı duktal numaraları estrous döngüsü bağımsız hakkında bilgi elde etmek için bunu yapmak isteyebilirsiniz. Araştırmacı bir iletişim kuralına estrous döngüsü aşamasını gözle görülür belirlenebilir Caligioni14 tarafından denir. Kanalları miktarının, ile ilgili olarak birden fazla duktal yapılarını histolojik Bu bölümlerdeki varlığı birden çok benzersiz kanalları göstergesi değildir ama yerine daha gelişmiş bir duktal ağacının duktal sonucu ortaya çıkan göstergesidir. Kanalları numaralandırmak için bir görüntü analiz yazılımı gibi ImageJ (NIH) doku bölümünde tek tek kanalları bir numara atamak için kullanabilirsiniz. Araştırmacı kanallarının gelişimsel anomalileri ya da patolojik durum göstergesi olabilir duktal rakamlarla değişiklikler olarak numaralandırmak için hazırlayabilirsiniz. Bizim çalışma ile ilgili olarak, biz kanalları, duktal akıbet sonucu artan sayıda inanıyorum ilgili anormal ifade (IGF-1), fare duktal bilinen bir arabulucu gibi insülin büyüme faktörü 1 büyüme faktörlerinin sürücü caveolin-1 kaybı büyüme 15.
Sağlam kanalları varlığı ek olarak, dalları, fibronektin lekeli bölümünde (şekil 3C) ok ile gösterilen birkaç kanalları içerir. Bu analiz amacıyla bu duktal dalları ayrı bir duktal yapı düşünülmemelidir. Değerlendirme ve kanalları ölçme kanalları vasküler yapılardan ayırt etmek önemlidir. Vasküler yapılar sadece Lümen astar bir endotel monolayer varlığı ile aynı zamanda bir nükleer, Eozinofilik yapıları göstergesi kırmızı kan hücrelerinin (RBC) varlığı ile Lümen (şekil 3D) içinde tespit edilebilir değil. RBC gösterir ve damarlara öneriyor Lümen içinde Eozinofilik yapıların varlığı RBC deplasman doku bölümler boyunca bezi toplama sırasında mümkündür. Vasküler yapılar endotel işaretçisi CD31 kullanarak onaylamak için tavsiye edilir. CD31 ile lekeli bir histolojik bölüm örneği (şekil 3D) gösterilir. Duktal çevresi ve alan ölçmek için vektörel çizimler ImageJ (NIH) myoepithelial sınır (çevresi) ve α-SMA-lekeli doku bölümünde luminal sınır belirlemenizi atanabilir. Boru hattı myoepithelial hücreleri lekeleri gibi α-SMA, düz kas hücrelerinin bir işaretleyici kullanıldı. Mavi çizgili luminal sınır (şekil 3E) gösterirken gösterilen resimde kırmızı çizgi myoepithelial sınır gösterir. Alan toplam stromal doku artı duktal epitel hücreleri (şekil 3E) tarafından işgal şematik gösterilen stromal ve luminal bölmeleri arasındaki bölgedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56512/56512fig1.jpg"> 
Resim 1 : Bütün, olduğu gibi meme dokuları histolojik analizler için yalıtım. (A) hayvan kurban, pelt dikkatle kaldırıldı ve dermis ve Periton arasında yer alan meme dokuları ortaya çıkarmak için geri tutturulmuş. Şematik servikal (#1), göreli konumları gösterir torasik (# ' 2 ve 3), (#4) karın ve kasık (#5) bezleri. (B) disseke hayvan gösterilen ve kırmızı oklarla gösterilen #4 karın bezleri, izole edildi. (C) temsilcisi örnek #4 karın bezlerinin nulliparous kadın B6 fareden izole. (D) önemli subkutan doku içinde doku parafin blok parça (örneğin yüzeysel) önce kalkmış değil bezlerinden ECM protein fibronektin için boyama takip belirgin oldu. (E) Considerably 100-200 µm doku içinde parafin blok parça (örneğin derin) önce kalkmış bezleri daha az subkutan doku ve daha fazla fibronektin stromal doku lekeli tespit edildi. Histolojik kesitler temsilcisi örnekleri vardır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56512/56512fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56512/56512fig2.jpg"> 
Resim 2: işleme ve boyama Histological. (A) histolojik işleme için kullanılan adımları şematik gösterimi. Farklı bir dizi adımı analizleri, kolajen ifade için kullanılmıştır. ECM proteinler kolajen, fibronektin ve tenascin-C kadın nulliparous caveolin-1 eksik hayvanlar bezleri (B) temsilcisi görüntülerini. Oklar kolajen, fibronektin ve tenascin-C için kanalları astar yoğun stroma gösterir. PSR: Picrosirius kırmızı. FN: fibronektin. On-C: tenascin-c <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56512/56512fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56512/56512fig3.jpg"> 
Şekil 3: analizleri duktal mimarisinin. (A) bölüm lekeli bir fibronektin geniş doku hasarı göstermektedir. Bu tatili duktal yapılarda (oklar) varlığı ile işaretlenir. (B) bölümünde lekeli bir fibronektin varlığı bir veya daha fazla katmanı epitel hücresi ve çevresindeki stroma çevrili Lümen ile işaretlenmiş olduğu gibi duktal yapıları varlığı gösterilmiştir. Oklar, bireysel duktal yapıları gösterir. (C) oklarla gösterilir duktal dalları varlığı fibronektin lekeli görüntü vurgulamaktadır. Bunlar daha büyük duktal yapısı Lümen ile sürekliliğini unutmayın. (D) hücre tek bir katman ve Eozinofilik yapıları kırmızı kan hücreleri, gösterge parçalanmayabilir varlığı ile karakterize vasküler yapılar (Kırmızı oklar), birbirine kanalları (siyah ok) ile sık sık gözlenir. Düşük büyütme soldaki resimdeki gösterilir ve karşılık gelen bir yüksek büyütme resim sağda gösterilir. Bu görüntüleri H ile lekeli &#38; E ve tenascin-c CD31 vasküler yapılar astar endotel hücreleri için olumlu bir işaret olarak kullanılmıştır. Büyük bir vasküler yapı hangi CD31 pozitif hücrelerinin gemi Lümen astar görülebilir gösterilir. Düşük büyütme soldaki resimdeki gösterilir ve karşılık gelen bir yüksek büyütme resim sağda gösterilir. (E) duktal alan luminal yuvası anahat için bir vektör (mavi renkle gösterilmiştir) kullanarak ölçüldü iken myoepithelial bölme anahat için bir vektör (gösterilen kırmızı) kullanarak bir α-SMA-lekeli görüntüde duktal çevresi ölçüldü. Stromal ve luminal bölmeleri arasında bölge duktal alanı olarak sınıflandırıldı. Ölçek çubuğu 50 µm. çevre ve alan ölçülü alanları vurgulayarak duktal yapısının şematik =. On-C: tenascin-c Şekil E histolojik bölümünde dan güncellenmiştir: Thompson C vd. 16 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56512/56512fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology at JoVE.com

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Görüntüleme.  University of Nebraska Medical Center. Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Video: Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Sıçanlarda Meme Bezi Morfolojisi ve Meme Kanseri Riski değişiklikler

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Biyoloji

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Fare meme bezi Lokalize İlaç Teslim Intradüktal Enjeksiyon

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3-Boyutlu Histoloji hacmi ve Fare meme bezlerinin Eğitim için onun Uygulama İmar

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...