We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

MiniSOG Hücre hatları 1. Üretim <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile takviye edilmiş düşük glikoz Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çanak U2OS (insan osteosarkoma) hücreler büyümek atmosfer. </li><li> Bunlar miniSOG ve mCherry sekansları içeren plazmid transfeksiyon reaktifi yapılar 19 ve imalatçının protokolüne göre, onarım etiketli proteinlerin saflaştırılmış transfeksiyon kalitesi (A269 / 280 oranı 1.8-2.0) ile lipofeksiyon ile% 80 konfluent olduğunda, hücreleri transfekte. MiniSOG ifade plazmid Tsien-Lab sipariş edilebilir: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> İki gün sonra transfeksiyon flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile miniSOG ve MCherry etiketiyle rekombinant proteini eksprese eden hücreler, kriteri. Hücreleri toplayın20 aşırı ifade eden hücreleri önlemek için bir ara madde floresan ile. </li><li> Kültür,% 10 FBS ve seleksiyon ajanın G418 (Geneticin) 0.6 ug / ml ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde 10 ml bir 10 cm&#39;lik bir tabak üzerinde pozitif hücreler. </li><li> Görünür koloniler plakalar üzerinde ortaya çıkmıştır sonra, MCherry pozitif kolonilerin ekranı ters bir floresan mikroskop kullanılarak ve kalıcı bir kalem ile (plaka alt üzerine) çevrelerindeki daireler çizin. Düşük büyütme hava objektif lens (örneğin, 10x) kullanın ve dikkatli steril 1000 ul pipet içine emme yavaş yavaş koloniler çizilmeye ve steril tekniği kullanarak klonları seçin. </li><li> Seçilen koloniler genişletin ve% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenmiş aşama 1.1 açıklanan büyüme ortamı kullanarak onları kısımlarını aşağı dondurma. Steril 18 x 18 mm 2 kapak fişleri onları büyüyen ve bunları teşhir ederek DRF oluşumu için hücreleri testRadyasyon 2 Gy. Stabil bir miniSOG mCherry ifade ışınlanmış hücreler mCherry görüntülenmesinde filtre seti kullanan bir floresan mikroskop ile görüntülendi zaman tamir protein DSBs tipik odak desen özelliği göstermek zorundadır etiketledi. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür U2OS hücreleri stabil miniSOG ifade ve mCherry adımda 1.1 belirtilen şartlar altında onarım proteinleri etiketledi. DMEM 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çapında bir cam alt tabak içinde% 80 konfluansa kadar hücreleri büyütün. Plastik ve kullanılan plastik kapak kayma verdiği tutkal kullanılan reçine sulu ve alkollü çözümlere karşı dayanıklı ve dirençli olduğundan emin olun! </li><li> Denemeyi gerçekleştirmeden önce, ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için bir floresan mikroskop kullanılarak steril bir elmas kalemle çizilerek ektopik proteinleri ifade hücreleri içeren yaklaşık 1 mm 2 küçük bir alanda özetlemektedir. Alternatif bir cam alt çanak t kullanınşapka lamel yerleşik bir ön kazınmış ızgara sistemi ile lamel içeriyor. NOT: ESI ve floresan mikroskobik resimler 21 birleştirerek yüksek kalitede bağıntılı mikroskopi kullanılarak ise, lamel kalınlığı immersiyon yağı hedefleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu kalınlık No. 1.5 (0,16-0,18 mm) olması gerekir. Bölge kenarlarına yakın oluşabilecek reçine polimerizasyonu ile sorunları önlemek amacıyla TEM incelenecek için çanak merkezine yakın bir alan seçin (nokta 4,10-4,13 bakınız). </li></ol> 3. DNA Hasarı İndüksiyon <ol><li> , Gama radyasyonu ile hücrelerin ışın tedavisi, bir radyomimetik ilaç kullanımı, ya da (18,22 veya 23 de tarif edildiği gibi, örneğin,) konfokal mikroskop lazer ışınlama, mikro hasarını teşvik eder. </li><li> Bu örnekte, 405 nm sol kullanarak bir sezyum-137 radyasyon kaynağı veya lazer microirradiate gama ışınlama 2 ve 6 Gy ile hücrelerin ışın tedavisi0,5 ug / ml Hoechst ile 20 dakika boyunca hücrelerin duyarlılaştırılması sonra konfokal mikroskop id hal lazer. </li></ol> 4. Numune Hazırlama <ol><li> 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde ya da karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit DİKKAT 1 ml hücreleri saptamak. DİKKAT: Paraformaldehit ve sodyum kakodilat zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 ya da fosfat tampon maddesi, pH 7.4, 4 ml hücreler iki kez yıkayın. </li><li> 2 ml 50 mM glisin ile sabitleştirilmiş hücreler tedavi, 5 mM aminotriazol ve 30 dakika boyunca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ve 0,1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde 10 mM potasyum siyanür DİKKAT (pH kontrol!), Reaksiyona girmemiş bloke etmek için aldehit grupları ve arka plan artırabilir hem grupları tarafından üretilen reaktif oksijen türleri bastırmak için. DİKKAT: Potasyum siyanür son derece zehirlidir! WKulak eldiven, bir başlık altında çalışmak ve yeterince zehirli maddeler atmayın. PH belirlenmiş ve doğru olması önemlidir, böylece, reaksiyon pH karşı çok hassastır. </li><li> Bağıntılı mikroskopi isteniyorsa, ters bir floresan mikroskop 2D veya 3D adımda 2.2 seçildi alan kaydedin. </li><li> 2 ml&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içine, bir 10 mg tablet diaminobenzidin hidroklorür koyarak 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür DİKKAT çözeltisi hazırlayın. Distile H, konsantre edilmiş hidroklorik asit (11.65 M) 2 O ve 20 ul 980 ul ekleyin ve çözelti, açık kahverengi ve berrak hale gelene kadar karıştırın. 7.0 ile 7.6 arasında bir pH değerine kadar sodyum hidroksit ile pH ayarlanması sırasında, 1 mg / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M fosfat veya 0,1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde bu çözüm seyreltilir (pH 7,4 önerilir). UYARI: diaminobenzidin zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın. </li><li> Fotooksidasyon, replace 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ya da fosfat tampon maddesi içinde 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür çözeltisinin 2 ml&#39;si ile tamponu. Işıktan bu çözüm korumak ve oksijenin çözünürlüğünü artırmak için 4 ° C&#39;nin buz üzerinde soğumasını. (Çözelti içine yerleştirilir ve bir oksijen şişeye bağlı bir hortum kullanarak) bir solüsyonu ile oksijen kabarcıkları geçirmek suretiyle oksijen ile çözelti Doymuş. Tekrar pH&#39;ı kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Not: Bu, pH pH 7.0 ve pH 7.6 arasında olduğunu fotooksidasyon reaksiyon için çok önemlidir. </li><li> Dikkatli bir 40x immersiyon yağı objektif lens ile donatılmış bir ters floresan mikroskop üzerine sabit hücrelerle çanak monte edin ve ilgi alanına taşımak. GFP veya CFP filtre küpleri kullanarak mavi ışıkla miniSOG etiketi Excite. MiniSOG 473 nm 10&#39;da bir omuz ile 448 nm bir uyarım maksimum vardır. </li><li> Hatta yeşil miniSOG floresan ha sonra aydınlatma ile devamtamamen kayboldu ve polimerize diaminobenzidin kahverengi fotoğraf oksidasyon ürünü iletilen ışık kanalda çıkana kadar s. Oksidasyon ürünü hücrelerin çoğunda görünür olduğunda, foto-oksidasyon durdurmak için floresan aydınlatma kapatın. NOT: Fotoğraf-oksidasyon objektif lens, filtre iletim dalga boylarında ve verimlilik ve aydınlatma kaynağına göre birkaç dakika sürebilir. </li><li> Postfix&#39;i 0.1 M sodyum kakodilat, pH% 2 gluteraldehit, 1 ml 7,4 tamponu veya 30 dakika boyunca fosfat tamponu pH 7.4 ile hücreleri. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 veya 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde 20 dakika boyunca% 0.1% -0.5 ozmiyum tetroksit hücrelerin zarları sabitleyin. NOT: Bu zarlarını stabilize gerekli ozmiyum tetroksit mümkün olan en düşük konsantrasyonu kullanılması tavsiye edilir. Polimerleştirilmiş DAB çökeltiler ESI güçlü doğrudan tespit edilebilir bir azot yüksek yoğunluğa da sahip yanaozmiyum boyama miniSOG etiketli proteini tespit etmek için ve ESI zarar verebilecek gerekli değildir. Osmiyum tetroksit çok zehirlidir! Davlumbaz çalışın ve yeterince zehirli atık imha edin. </li><li> 30,% 50,% 70,% 90,% 98,% 100,% adım etanol (her biri 5 dakika) ile bir etanol dizi hücreler kurutmak. Daha sonra, bir 1 hücreleri inkübe:% 100 etanol ve akrilik reçinesi (LR White) 1 karışımı ve 100 en azından bir 4 saat hücreleri inkübe edilmeden önce, hücre içine girmesini kolaylaştırmak için 4 saat süre ile bir çalkalama düzenine üzerine tabak koyun % akrilik reçine (LR Beyaz). </li><li> Reçinenin polimerize etmek için, bir jilet kat akrilik reçine hızlandırıcılı kenarı ile etiketlenmiş bir 2 ml mikrosantrifüj tüpü kapağı kesti. Hızlandırıcı sadece jant kapakları ve tüp içine akmaz emin olun. Daha sonra, dikkatlice yaklaşık LR Beyaz reçine Pasteur pipeti kullanarak üçte iki tüp doldurun. Reçine iletişim zekâ içine almaz özenh jant üzerinde hızlandırıcı! </li><li> Çanak hücreleri sızan reçine çıkarmak ve tüpün genişliği neredeyse tamamen çanak cam kaplı gözlem penceresi doldurur ve böylece dik ayakta mikrosantrifüj tüp üzerine baş aşağı çanak yerleştirin. </li><li> Daha sonra, tüp ve lamel mühür tüp reçine artık hücrelerin kapsar şekilde tüp ters çevirmek için hızlandırıcı için 1 dakika 2 bekleyin. </li><li> 60 ° C&#39;da bir fırın içine tüp ile çanak yerleştirin ve 12 saat için tedavi. </li><li> Blok kürünü zaman fırından ekli reçine dolgulu mikrosantrifüj tüp ile çanak kaldırmak ve çanak ependorf tüp ayırın. Sıvı azot ve sıcak su içinde donmuş halde öğütme süreçleri ile ayrılmasını kolaylaştırmak. </li><li> Cam alt çanak atın ve dikkatle bloğu kaldırmak için bir jilet ile ependorf tüp açmak kesti. </li><li> Kalıcı bir kalem ile blok etiketleyin. </li><li> Tri Bir jilet kullanınDaha önce bir elmas veya tungsten kalem ile işaretlenmiştir alanı içerir (veya ilgi hücreleri alanı içeren) 1 ila 2 mm bölgesinde bir şey kalmayacak şekilde blok m. </li><li> Bir ultramicrotome içinde blok monte bir düzeltme bıçakla blok Döşeme ve elmas bıçak kullanarak yaklaşık 50 nm ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> Yüksek aktarım 300 meş ızgaraları bölümleri Pick up. Bu ızgaralar çok küçük ızgara çubukları ve böylece ilgi alanında daha az hücre kapsamaktadır. </li><li> Coat karbon yaklaşık 0.2-0.4 nm TEM elektron ışını altında istikrara kavuşturmak için bir karbon kaplayıcı kullanarak ızgaraları bölümleri. </li></ol> 5. Elektron Mikroskobu <ol><li> Bir enerji filtresi ile donatılmış bir TEM içine ızgaraları yükleyin. Mikroskop ve üreticinin talimatlarına göre enerji filtresi ayarlama sonra, düşük büyütme modunda bölümlerde hücreleri kontrol (normal iletim) ve karşılaştırmak(adım 4.4 &#39;de elde edilen) uygun olduğunda bunları veri floresan. </li><li> Ilginç özellikleri (DNA hasarı parça veya DNA onarım odakları) ile bir çekirdeğe kez enerji filtreleme moduna geçin bulundu ve kalınlık haritası kayıt edilir. NOT: Bu prosedür sıfır kayıp ve filtresiz görüntü kaydını içerir. 0.3 kadar kalınlıklar ücretsiz yol (olay demetinin elektron% 30 örnek tarafından dağınık alır) iyi element haritaları oluşturmak için yeterince ince anlamına gelir. </li><li> Kullanılan mikroskop enerji filtresi kontrol yazılımı kullanarak elemanları fosfor ve azot Tutanak oranı haritalar. 20 eV bir yarık genişliği ile de, 120 eV enerji kaybı 20 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliğine sahip 175 eV enerji kaybı fosfor haritası sonrası kenar görüntüleri kaydetmek. Ayrıca 35 eV bir yarık genişliğine sahip 358 eV 35 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliği ile 447 eV azot haritalar, kayıt sonrası kenar görüntüler için. NOT: görüntülü elemanların içeriğinde bu yana (phosphOrus ve nitrojen) (yakl.% 1), gürültü oranı daha iyi bir sinyal ile görüntüler oluşturmak için &quot;3 pencere yöntemi&quot; üzerinde &quot;Oran Görüntü&quot; (kalitatif element harita) (elementer haritayı quantitate) tercih nispeten düşüktür. </li></ol> 6. Görüntü İşleme <ol><li> (Örneğin, Dijital Mikrografik) edinilen resim dosya biçimini işleyebilir bir görüntü işleme yazılımı element oranı haritalar açın. Kırmızı kanal ve bir RGB görüntüsünün yeşil kanal içine fosfor haritası içine azot haritası kopyalayın, daha sonra üst üste ve haritalar hizalayın. </li><li> Etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) dosyası olarak kompozit görüntü aktarın. Katmanları kullanabileceğiniz bir görüntü işleme yazılımı (örneğin, Photoshop) görüntü açın. </li><li> 8 bitlik veri setine (255 0) ile görüntüdeki minimum ve maksimum değerleri rescaling her kanalın dinamik aralığını ayarlayın. </li><li> Kullanarak azot haritadan fosfor içeriği (ÇıkartProtein dağılımını gösteren bir harita nitel üretmek amacıyla &quot;Katmanlar&quot; pencere). </li><li> &quot;Dizinlenmiş renkli&quot; içine önceki adımda oluşturduğunuz nükleik asit (fosfor) ve protein (azot) haritaları dönüştürme ve nükleik asit dağılımı ve bir mavi arama tablosu gösteren harita için CMYK renk uzayında sarı arama tablosu oluşturmak olmayan nükleoprotein haritayı göstermek için. Renkler, iki element haritalar arasında maksimum kontrast üretmek için seçilir. </li><li> Farklı katmanlar olarak fosfor ve protein dağılımını gösteren haritalar yeni bir görüntü oluşturun ve içe aktarın. Birbirine bindirilmiş iki katmanı görmek için &quot;ekranı&quot; şeffaflık modunu kullanın. </li><li> Adım 5.2 elde sıfır kayıp görüntüyü açın. Bu görüntü, geleneksel TEM görüntü benziyor kaydedilen alanın görüntüsünü temsil ancak numune ile çarpışan olmadan numune geçtik elektronları içeriyor. IhracatTIFF görüntüsü olarak bu görüntü. </li><li> Bir fotoğraf editörü ihraç sıfır kayıp görüntü açın ve element haritayı gösteren görüntünün üst tabakası içine kopyalayın. &quot;Ekran&quot; şeffaflık modunu kullanarak görüntüyü hizalayın. </li><li> İsteğe bağlı eşik segment sıfır kayıp görüntü miniSOG kaynaklanır sinyali. Yukarıda tarif edildiği gibi ayrı bir katman olarak elde edilen görüntü ekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus.">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li><li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture.">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).</li><li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging.">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li><li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li><li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spectroscopic+imaging.">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li><li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps.">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li><li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope.">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041 (2011).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+foci:+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors.">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li><li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes.">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li><li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li><li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin,+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci.">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li><li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks.">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li><li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones.">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li><li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable,+high-producing+mammalian+cell+lines.">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li><li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ.">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li><li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI özellikle fosfor bakımından zengin olan alanlar harita yapabiliyor çünkü çekirdeğinde kromatin ve ribonükleoproteinlerin farklı durumları incelemek için mükemmel bir araç olarak hizmet verebilir. Bu derinden bir elektron mikroskobu ile elde edilen ve spesifik olmayan zıt yöntemleri bağımlı değildir olabilir ayrıntı miktarını artırır. ESI bir dezavantajı aynı hızlanan gerilimde geleneksel TEM daha ince kesitler gerektirir. Bu seri bölümleri ile çalışan veya tomografik yöntemlerle 28 kullanılarak aşılabilir. Bilgi bir çok fosfor ve azot dağılımları bakarak elde edilebilir olsa da, bazı proteinlerin dağılımının haritasının çıkartılması mümkün ilgi çekicidir. Yöntem, bu çalışmada sunulan ile, ESI diaminobenzidin site-spesifik polimerizasyona dayalıdır; yöntemleri ile kombine edilebilir olduğu gösterilmiştir. Bu yöntem, bir fu ilave etmemesine karşınESI için ll yeni bir renk, bir protein dağılımının haritasının açıkça yararlıdır. Bu kromatin etkileşim proteinler için geçerlidir. Bir çalışmada, birden fazla protein popülasyonu görselleştirmek için ihtiyacı varsa önceden foto-oksidasyon 9, ön gömme boyama olarak uygulandığında, immünolojik kullanarak etiketleme yöntemleri hala kullanılabilir. Kararlı hücre çizgileri ile karşılaştırıldığında, geçici transfeksiyonlar ekspresyon seviyeleri hücreler arasında önemli ölçüde değişebilir ve bu nedenle sabit etiketli protein benzer miktarlarda eksprese eden birden fazla hücreleri bulmak için yapabilir bir dezavantaja sahiptir. Bu nedenle, stabil hücre hatlarının oluşturulması tavsiye edilir. Bununla birlikte, fluoresans görüntü kullanılarak protein ekspresyonunun nispi miktarını hakim ve geçici transfeksiyonu takiben ara madde ifade ile hücreleri seçmek mümkündür. MiniSOG füzyon etiketini kendisi flüoresan ise de, kuantum verimi GFP (0,37 vs 0.6) 10 önemli ölçüde daha kötüdür. PurpmCherry gibi ek floresan protein etiketi ekleyerek karşılıklı mikroskopi ose, miniSOG uyarma oluşur tekli oksijenin üretiminin olmadan canlı hücrelerde görüntüleme sağlar. MiniSOG ile işaretlenmiş olan proteinlerin ekspresyon seviyesi, DAB-ihtiva eden tampon maddesi içinde oksijen miktarı ve pH da foto-oksidasyon hızını etkileyebilir. Bazen, çünkü fotoğraf oksidasyon reaksiyonunun ışık bağımlılığı ilgili bölge homojen foto-oksidasyonu gerçekleştirmek için oldukça sorunlu olabilir. Uzun süreli foto-oksidasyon spesifik olmayan boyama ve ESI öğeli özel sinyallerin algılanmasını karmaşıklaştırabilir numunede çok fazla ağır metal birikimi, yol açabilir. Foto-oksitleme işlemi bu nedenle genellikle lamel birkaç hücre içeren çok küçük bir bölgesi, normal olarak boyanır oldukça zaman alıcıdır. Biz miniSOG kombinasyonu yapışık hu bir tek tabaka kullanarak ESI ile etiketli proteinlerin göstermiştirAdam kanseri hücre hattı. Prensip olarak, yöntem, aynı zamanda sürece miniSOG-etiketli makul seviyelerde protein ve uzun saydamlık ve oksijen difüzyon ifade etmek mümkündür ve DAB gibi herhangi bir başka örnek (maya, bakteri, doku embriyo) uygulanabilir Uygun foto-oksidasyon ve böylece homojen boyama sağlamak için yeterli derecede yüksek. Süspansiyon hücreleri için, bu tür poli-L-lisin gibi bir yapıştırıcı kullanılarak bir kapak slip üzerinde hücrelerin yerini sabitlemek için avantajlı olacaktır. Kalın numuneler için, daha düşük bir sayısal diyafram ile hedefleri daha homojen bir aydınlatma elde edecek, ancak fotoğraf okside daha uzun sürer. . Osmiyum tetroksit kullanımı dahil - Biz mümkün olduğunca tarafından Shu ve arkadaşları 10 yayınlanmış orijinal protokole yakın miniSOG-etiketli füzyon proteinlerinin kullanımını sunduk. Orada o ayrı tercihen DAB-polimerler ve membranlarda yatırılması gelen, osmiyum tetroksit bazı reaktivite gösteriyor ki gözlenebilir venumunenin biyolojik bir materyal (10 Şekil 3) çoğu üzerinde birikme. Osmiyum tetroksit 45 eV bir element kenarı vardır. Bu sinyal ve plazmonlar numune geçişi sırasında birden enerji kaybı olayları tabi numune artışları ve tek elektronların kalınlığı olarak elektron enerji kaybı spektrum üzerinde bindirilmiş olabilir. Yüksek OsO 4 konsantrasyonları numune hazırlamada kullanılan, bu fosfor element haritaları kalitesini sınırlayabilir. Daha önce 10 Kullanılmıyor ne göre anlamlı derecede düşük olduğu biz burada kullanmış konsantrasyonları, kaliteli fosfor haritaların üretimi sağladı. Kullanarak bir deneyde miniSOG yüksek OsO 4 konsantrasyonları talepleri etiketli proteinlerin, hala iyi fosfor haritası oluşturulmasını sağlar iyi konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmesi gerekecektir. Bu DNA tamir odaklarda oluşturan DAB polimer sufficie olduğunu buldukozmiyum tetroksit ile post-fiksasyon ihmal bile (daha iyi kontrast veya sıfır kaybı modunda) ntly alışılmış TEM modunda görüldüğü üzere, yoğun (bakınız Şekil 8). Bu şekilde kaydedildi sinyallerin segmentasyon osmiyum ile tedavi edildi örnekleri kullanarak gibi sağlam oldu. Görüntülenmiştir zorundadır nükleer protein bağlı olarak, oluşturduğu yapıların büyüklüğü ve membran sistemleri görselleştirmek için gerekliliği, osmiyum tetroksit kullanılması gerekli olmayabilir ve ihmal fosfor elementi imzasını maskeleme potansiyelini ortadan kaldıracaktır. ESI 18,29,30 kullanan diğer yayınlara göre gürültü en az miktarda element oranı haritaları oluşturmak amacıyla öncesi ve sonrası kenar resimler için farklı ayarlar kullandık. Biz ampirik el yazması sunulan ayarları belirledik (şekil 9). Kenarlarda seçilen ayarlar Ele düzeltmek için gitmelidirtoplama pencereleri sürece zihinsel haritalar numunede mevcut olan diğer unsurları ile örtüşen. Bizim durumumuzda, kükürt gibi bir eleman olabilir. (Amino asitler metionin ve sistein oluşur) sülfür konsantrasyonu son derece düşüktür ve sadece önemsiz bir miktarda hesaplanan harita katkıda bulunmasından dolayı biz dezavantajları daha ağır basar Burada kullanılan ayarlar kullanılarak elde daha iyi bir S / N oranı inanıyoruz Bu örnekteki kükürt izleri doğabilecek. Biz ESI ve TEM teknikleri ile kombine DNA onarım proteinleri MDC1, 53BP1 ve Rad52 kullanarak nanometre çözünürlüklerde DRFs ultra yapısını ortaya çıkardı. Kromatin ve bireysel DSB onarım protein lokalizasyonu organizasyonu bu yaklaşımı kullanarak çözüldü. Kromatin sırtlar arasındaki boşluğu doldurmak için lazer mikro-ışınlama DNA ve onarım proteinleri eğilimi izleyen DNA lezyonları zengin etki Onların yerelleştirme gördü. Rad52 durumunda, pla içindeys homolog rekombinasyon bir rol, lazer zarar iz boyunca nükleer vücut gibi küresel yapılar oluşumu gözlenmiştir ve bu durum, diğer test edilen iki protein aksine oldu. Hasar gamma ışıması tarafından uygulandığında, 53BP1 zarar kromatin yaklaşık odaklar oluşturdu. Odaklarda kromatin ve protein göreli kompozisyonu ve pozisyon zamanla değiştirmek gibi görünüyor. Bu proteinlerin ve kromatin organizasyonu hasarlı kromatin yanı sıra değişiklikleri ve nükleer organlarının kompozisyonu arasındaki ilişki tüm kolayca doğrudan bu özelliklerini değerlendirmek olamaz zıt maddeler uranyum kullanan ve kurşun geleneksel aydınlık mikroskobu ise ESI tekniği kullanılarak elde edilebilir. Böylece, bu teknik özellikle DNA üzerinde etkili süreçler için yapı-işlev ilişkilerinin, çalışma için yüksek potansiyeli göstermektedir.

Son yıllarda üzerinde 1 ışık mikroskobu önemli gelişmelere rağmen, hücre biyologlar hala çözünürlükte bir boşluk muzdarip. Bu makromoleküler kompleksleri arasında koordineli etkileşimi içeren temel hücresel süreçleri yapı-fonksiyon ilişkilerinin anlaşılmasını sınırlar (örneğin, kromatin yeniden, DNA onarımı, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyonu olarak). Transmisyon elektron mikroskopları (TEM) gerekli çözünürlüğü sağlamak s olsa da, görsel yapıların biyokimyasal kompozisyonu belirlemek mümkün olurken spesifik proteinlerin etiket yapısal yetersizlik nedeniyle bu süreçleri tanımlamak için zorlu olmuştur. Nükleer yapıları ayırt etmeye yardımcı iç membran yokluğunda, çekirdek özellikle zor olmuştur. Elektron spektroskopik görüntüleme (ESI), DNA, RNA ve prot eş zamanlı algılama ve farklılaşmasını izin vererek bu sınırlamaların bazılarını çözerNükleer yapılar 2-5 ein tabanlı. Elektron spektroskopik görüntüleme: Elektron mikroskobu yüksek hassasiyet ve çözünürlükte element dağılımları haritası için bir esnek olmayan numune 6 bir elemanın iç kabuk elektronları ile etkileşimleri dağılmış olan elektronların seçer bir görüntüleme spektrometresi kullanabilirsiniz. Enerji elemanı spesifik miktarlarda numune atom iyonizasyonu bir sonucu olarak kaybolur, çünkü bu elektron ayrıldı ve elektron mikroskobu bağlı bir spektrometre kullanılarak görüntülenebilir. Böylece numune ile etkileşimde elektronların spektrumunun analizi örneği 7 element kompozisyonu hakkında nitel ve nicel bilgiler ortaya koymaktadır. Numune geçerken enerji kaybetmek yok elektronlar elektron enerji kaybı &quot;sıfır kayıp zirve&quot; bulunurtayfı. Bu elektronların bolluğu numune kütlesi, yoğunluğu ve kalınlığı ile ilgilidir ve numune ile çarpışan veya numunenin geçişi sırasında enerji kaybı olmadan numune geçmesine elektron oluşur. Bu bilgiler, örnek 8, belirli bir eleman mevcut atomların sayıları mutlak ölçümü için yararlı olabilir. Biyolojik örnekler heavy metal kullanarak çoğunlukla kötü TEM olay ışın elektronları saptırmak hafif elementlerin, boyama metotları oluşur beri tuzları numunedeki kontrast üretmek için uygulanmak zorundadır. Bu farklı maddeler ve yetersizlik en özgüllüğü mümkündür birden fazla leke görselleştirmek için özgüllüğü olmaması çekirdeğinin çalışmada bilinen elektron mikroskobu değeri sınırlıdır. ESI özellikle hücre çekirdeğinin yapıların çalışma, geleneksel TEM göre önemli avantajlara sahiptir.Bu protein komplekslerinden nükleoprotein kompleksleri ayırmak için ve nükleik asitlerin yoğunluklarına dayalı olarak farklı nükleoprotein kompleksleri çözmek için nitelikteki DNA- ve RNA-içeren makromoleküler kompleksler fosfor açısından zengin doğasını yararlanmak mümkündür. Kalan biyolojik madde azot bolluğu dayalı görüntülü olabilir. Farklı anatomik yapıların içindeki dağılımı ve göreceli bolluk Haritalama sadece bu iki element ve analiz çekirdeğinin hakkında bilgi bir sürü bize sağlar. Örneğin, kromatine ve fosfor bolluğu temsil harita ribozomlar tespit etmek kolaydır. Interkromatin alanı, çekirdek gözenek kompleks ve nükleer organları, diğer yandan kolayca azot harita görüntü tespit edilebilir. Mini singlet oksijen jeneratörü sistemi (miniSOG) ESI güçlü bir teknik temsil ederken o alır çünkü yerinde kromatin yapısı okumak içinfosfor ve azot ile elementel kompozisyon karakteristik oranların s avantajı, element bir bileşim, normal protein kompleksleri farklı popülasyonlar arasında ayrım yapmak için kullanılamaz. Nanometre aralığındaki küçük altın parçacıkları ile etiketlenmiş antikorlar yaygın tek tek moleküller yerini haritalandırmak için kullanılmıştır. Altın partikül genellikle İkincil antikora bağlı olduğu için, bu primer antikor ile tespit epitopa çapında yaklaşık 20 nm&#39;lik bir çevresi içinde görünür. Sonrası gömme örneklerde, antikorlar tek bölümlerin yüzeyinde ortaya epitopu algılar. Bu, elde edilen bilgileri bir antijenin varlığı ispat ve hücrenin belirli bir anatomik yapıya ilişkilendirilmesi mümkün olsa da epitop en reçine ile örtülü olduğundan, tam değildir. Boyunca antijenlere erişime izin, floresan mikroskop için kullanılanlara benzer protokollerini kullanan teknikleri, Ön-gömmenumunenin tamamı derinliği ancak genellikle lipid membranların çıkarılmasını gerektirebilir ve aldehitler ile sabit olamaz bileşenleri kaldırmak antikor hücresine nüfuz sağlamak için gerekli olan permeabilizasyon adımlar. Ayrıca, ultrastrüktür korunması, glutaraldehit için tercih edilen aldehit sabitleştirici, yaygın dolayısıyla paraformaldehit tipik gereklidir epitopları tahrip ve. Bu protein-protein çapraz bağlama az etkilidir. Altın bir nanopartikül ile etiketlenmiş antikorların başka bir dezavantajı, altın zayıf kontrast örnek, ilginç yapısal detayları belirsiz olabilir güçlü bir kontrast oluşturan bir çok elektron-yoğun malzeme olmasıdır. Bir ifade edilen protein etiketi gibi yeşil flüoresan protein (GFP) ortaya çıkması hücre biyolojisinde soruları cevaplamak için floresan mikroskopi kullanımını dönüştürdü. Küçük bir flüoresan alana sahip bir protein etiketleme in vivo dağılım eşleme sağlar </em&gt; yapısını değiştirebilir permeabilizasyon prosedürlere gerek kalmadan. Mikroskopi elektron bir hücrede protein dağılımlarını eşleştirmek için protein etiketleri kullanarak zarif prensibini çevirmek için, bir sistem ilgi yapısına sinyal yakın üretmek ve TEM kontrast oluşturmak mümkün olduğunu gerekiyordu. Polimerize diaminobenzidinin genellikle bağlayıcı antikor tespit etmek histoloji kullanılan bir leke olduğunu. Bu leke genellikle ikinci antikoruna konjüge edilmiş yaban turpu peroksidazı (HRP) ile bırakılır. Reaksiyon, güvenilir bir sonuç üretir, ancak HRP hücrelerinin 9 sitozolünde katalitik olarak aktif değildir. Kendi çözünürlük NanoGold yöntemi 10 daha kötü olduğunu, HRP, reaksiyon ürünleri de kuşak mevkiden uzağa yayılabilir. Bu sorunları aşmak için, flash / ReAsH sistemi 11 geliştirilmiştir. Bir Tetracysteine ​​motifine sahip olan yeniden birleştirici füzyon proteinlerinin oluşur. Bu motif bağlanmasını sağlarBir biarsenic fluorofor. Heyecan, ilişkili veya FLASH ya da ReAsH etiketli proteinlerin yerinde hemen çökeltilerin a polimere singlet oksijeni ve böylece photoconvert diaminobenzidin (DAB) üretebilir. DAB polimeri, elektron yoğun ve dolayısıyla TEM rekombinant füzyon proteininin dağılımının haritasının için kullanılabilir osmium tetroksit ile boyanmış olabilir. 2011 yılında, Shu ve ark. 10 floresan ve 448 nm mavi ışık ile uyarıldığı zaman birçok singlet oksijen radikallerini oluşturmak mümkün Arabidopsis bir flavoprotein türetilen küçük 106 amino asit füzyon etiketinin oluşan miniSOG sistemini sundu. Bu tekli oksijen radikalleri ve immünolojik etiketlenmiş antikorlar 11 önemli ölçüde daha yakın olan etiketli protein, yüzeyine yakın polimerleri oluşturmak için foto-oksidaz diaminobenzidin için kullanılabilir. Flaş / ReAsH sistem floro getiren gerektirirkenkrom ve Fotoçevrim yapmadan önce hücre içine diaminobenzidinin, miniSOG sistem sadece diaminobenzidin ve ışık gerektiren ve buna ek olarak diaminobenzidin polimerize yaklaşık iki kat etkilidir. Burada, miniSOG DNA tamir odaklarının ultra yapısını eşlemek amacıyla ESI ile bir arada kullanılmaktadır. DNA tamir odakları (DRF) Onlar translokasyonlarda ve genetik bilginin kaybına yol açabilir çünkü unrepaired DNA çift iplikli sonları hücreye ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Buna karşılık, bu yaşlanma, kanser ve hücre ölümüne yol açabilir. DNA çift iplikli sonu onarım katılan pek çok protein 12-14 kırmak DNA çift sarmalı etrafında bir araya odaklar birikir. Bunların işlevi kesin olarak bilinmemekle birlikte, bu DNA çift iplik sonu içeren ve DNA çift iplik kırılım onarımı edilir çekirdeğinde sitesini göstermektedir. DNA tamir foci (DRF) floresan mikroskobu ile karakterize edilmiştir ve DNA hasarı 12,15 için biyomarkerların olarak hizmet vermektedir. Onlar çift iplikli mola büyüklüğüne masif göreli ve son süper çözünürlük mikroskop çalışmaları her 16 odak içinde moleküllerin alt bölümlendirme bazı kanıtlar ortaya dek görece homojen olarak kabul edildi. Bu siteler organize anlamak için, birbirine yatan biyolojik yapıların tüm göreceli görselleştirmek için gereklidir. Bu floresan mikroskobu ile elde ancak elektron mikroskobu 17,18 ile mümkün olamaz. Burada bir yöntem DNA çift sarmallı mola onarım ultrastrüktür keşfetmek için bu kombine yaklaşımın potansiyelini göstermek için miniSOG yöntemi ile elektron spektroskopik görüntüleme birleştiren açıklanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Optik çözünürlük ve transmisyon elektron mikroskobu spesifik protein popülasyonlarını tanımlama meydan sınırları hücre biyolojisinde engeller olmuştur. Birçok fenomen basit sistemler, in vitro analizi ile açıklanabilir ve tam anlaşılması için, bilhassa 1 nm ve 0,1 um aralığında, yerinde ek yapısal bilgi mi edilemez. Burada, elektron spektroskopi görüntüleme, protein ve nükleik asitlerin dağılımının eşzamanlı eşleme sağlayan bir transmisyon elektron mikroskobu tekniği ve bir ekspresyon etiketi miniSOG DNA çift iplik kırılım onarımı odaklarının yapısını ve organizasyonunu incelemek için bir araya getirilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K Görüntüleme.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Video: Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...