Name: epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR at JoVE.com

The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

Not: kullan veri sayfaları protokol tüm adımları takip etmek; örnek veri sayfaları ek malzemeler Tablo S2-S4 verilmiştir. 1. Standart Eğri hazırlanması <ol><li> (Örneğin, EP-A-Zırhlı RNA 1615) 2.5 x 10 8 parçacık / ml (2.5 x 10 8 GC / ml) TSM kullanılarak bir konsantrasyona kadar üretici tarafından sağlanan konsantrasyondan seyreltilmesi ile standart eğri reaktifi çalışma stok hazırlama III tampon. -20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza kullanarak 250 ul kısma çalışma stok bölün. NOT: Alternatif standart eğri reaktifler olarak kullanılmak üzere hazırlanıyor çalışma virüsün hisse senetleri ve plazmidler ile ilgili talimatlar için ek malzemeler protokol Adım S1 bakın. </li><li> Bir çalışma stoğu alikotları bir veya daha fazla çözülme. , 2.5 x 10 7 konsantrasyonları veren 2.5 x 10 6, 2,5 x 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak beş 10-kat seri dilüsyonları hazırlayın10 5, 2.5 x 10 4, 2.5 x 10 3 GC / ml olmuştur. <ol><li> TSM III tampon 225 ul 2.5 x 10 8 GC / ml çalışma stokunun 25 ul ekleyerek ilk seyreltme hazırlayın. Bir vorteks mikser kullanılarak 5-15 saniye karıştırılır. </li><li> TSM III tampon 225 ul Adım 1.2.1 hazırlanan seyreltme 25 ul ekleyerek sonraki seyreltme hazırlayın. Tekrar karıştırın ve önümüzdeki üç 10 kat dilüsyonları hazırlamak için benzer bir işlem devam ediyor. </li></ol></li><li> Standart eğri çalışma stoktan RNA ve hemen Bölüm 3&#39;te yordamı kullanarak beş dilüsyonları ayıklayın. </li></ol> 2. Tersiyer Konsantrasyon <ol><li> Üst numune odasına 1x PBS en az 10 ml,% 0.2 sığır serum albümini (BSA) eklenmesi ile toplanarak her bir numune için bir santrifüj konsantratör (30.000 molekül ağırlıklı akış kesici) hazırlayın. Bu çözüm ince kanal konsantrasyon odasını doldurdu emin olun ve ardından 4 ° C&#39;de O / N tutun. <ol><li&gt; Sıvıyı atın. Aşırı BSA kaldırmak ve daha sonra su atmak için steril reaktif kalitesindeki su en az 10 ml yoğunlaştırıcı bir kez durulayın. </li></ol></li><li> S, ayrı Santrifügal konsantre halinde Deneyi Örnek Hacmi eşit, her bir test örneğinden ikincil su konsantresi bir miktarını ekleyin. <ol><li> Denklem 1 kullanılarak S hesaplayın <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> D Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğu durumlarda, TSV Toplam Örneklem Hacmi ve FCSV Final Konsantre Numune Hacmi olduğunu. S. hesaplama örneği için ek malzemeler S2 bakın </li></ol></li><li> Santrifüj 20, bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C&#39;de 3.000-6.000 xg, her bir test örneği - 30 dakika. İnce kanal konsantrasyon odasında seviyesini kontrol edin. <ol><li> Birim 20 dakika veya daha uzun süre daha fazla 400 ul, santrifüj değilse. Th numune kadar devam santrifüjE ince kanal konsantrasyon odası az 400 ul düşürüldü. Süpernatant çıkarmayın. </li></ol></li><li> Virüs geri kazanımı arttırmak, steril 0.15 M sodyum fosfat 1 ml, pH 7-7,5 olan santrifüjlü konsantre kenarlarını yıkayın. Tekrar santrifüj 3.000-6.000 xg ve 4 ° C &#39;de Örnek az 400 ul&#39;ye indirgendi kadar. Bu yıkama adımı ek süre tekrarlayın. </li><li> Bir 100-200 ul mikropipet kullanarak dikkatlice ölçün ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp (yani, mikrosantrifüj tüp 200 ul transferi ve kalan sıvı tamamen çizilebilir kadar sonra mikropipet ayarlayarak kalan konsantre ölçmek için her konsantre örnek aktarmak ) pipet ucu içine. 400 ± 2 ul nihai ses seviyesini ayarlamak için, 0.15 M sodyum fosfat, pH 7-7,5 ekleyin. </li><li> Hemen 3. Processe edilemez herhangi konsantre örnekleri tutun adıma geçmeden nükleik asit Özüd, hemen fazla 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de. </li></ol> 3. Nükleik Asit İzolasyon <ol><li> 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketli ayırmak için Aşama 1.3 Aşama 2.5 veya standart eğri çözücüden, her bir test örneğinden Aşama tertier konsantrenin 3.3 ve 200 ul tarif edildiği gibi hazırlanmıştır ekstraksiyon tamponu 200 ul ekle. Veya -70 ° C&#39;nin altında üçüncül konsantreleri kalan dondurun. Aşağıdaki istisnalar dışında kan örnekleri sıkma protokolü için nükleik asit ekstraksiyon kiti, üreticinin talimatlarına uygun olarak, her numune nükleik asitlerin ekstrakte edin. </li><li> Su numunelerine proteazı eklemek veya nükleik asit ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen ekstraksiyon tamponu kullanmayın. </li><li> Taşıyıcı RNA ile ekstraksiyon tamponu hazırlayın <ol><li> Taşıyıcı RNA 310 ug ihtiva eden bir şişeye, taşıyıcı RNA seyreltme tamponu 310 ul ekle. Çözülür ve daha sonra yaklaşık 50 ul ihtiva eden 6 kısma ayırmak için karıştırın. -20 ° C&#39;de saklayın° C. </li><li> 0,027 ug / ul bir taşıyıcı RNA konsantrasyonu elde etmek üzere, ekstraksiyon tamponunda ml&#39;si başına çözülmüş bir taşıyıcı RNA 28 ul ekle. Ekstraksiyon kiti ile birlikte bunun yerine taşıyıcı RNA tadil ekstraksiyon tampon kullanın. </li></ol></li><li> Ribonükleaz ekleyerek elüsyon tamponu, bir ana solüsyonu hazırlayın (RNaz) inhibitörler ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen elüsyon tamponuna 400 ünite / ml nihai konsantrasyona seyreltildi. <ol><li> Sütuna RNaz inhibitör ile elüsyon tamponu 50 ul yerleştirerek spin kolon bağlanma nükleik asitten Elute RNA. 1 dakika boyunca bekleyin ve daha sonra oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Tekrarlayın Adım 3.4.1 ve daha sonra çıkarın ve sütun atın. </li></ol></li><li> Adım 3.4.2 RNA ekstrelerinin hacimde hazırlayın. 6 standart eğri çalışma stok hacimde ve en az 15 ul her biri her bir standart eğri seyreltme hazırlayın. En az ihtiva eden diğer bütün RNA örneklerinin 4 alikotları hazırlayın22 ul, her. Bunlar, 4 saat içinde ters transkripsiyon ile işlenebilir halinde 4 ° C &#39;de her bir numune ve standart eğri kontrolleri bir kısım saklayın; Aksi takdirde, ya da -70 ° C altındaki tüm alikotları saklayın. </li></ol> 4. Ters Transkripsiyon (RT) <ol><li> On katına eşit (mikrolitre) bulunan oligonükleotid nanomol (nmol) sayısını bir miktar kullanılarak her bir şişeye PCR dereceli su hacmi eklenerek, Tablo 1 deki her bir oligonükleotid primer ve prob, 100 uM stok çözelti hazırlayın Flakon etiketinde veya örneğin üreticinin özellikler sayfasında (gösterildiği gibi flakon (,) 363 ul 36,3 nmol içeren bir astar tekrar süspansiyon. eritmek için karıştırın. <ol><li> Çözüm çalışan 10 mcM hazırlamak için PCR dereceli su ile 100 mcM çözümler 1:10 seyreltin. </li></ol></li><li> 2. Pipet Tablo kılavuzunu kullanarak bir temiz oda RT Maste 16.5 ul RT Master Mix 1 ve 2 hazırlayınHer PCR plakasına r Mix 1 de çok kanallı pipet kullanarak. </li><li> Çözülme, donmuş ise, her alan numune ve Lab Müstahkem Numune Matrix gelen nükleik asit ekstreleri (LFSM; yani numaralı seribaşı su matris örneği). <ol><li> RNaz inhibitörü 400 ünite / ml içeren elüsyon tamponu içinde 5 ve 01:25: her bir alan ve LFSM örnek 1 seyreltin. </li><li> Lab Reaktif Blank (LRB; yani reaktif dereceli su kullanılarak bir negatif kalite kontrol), Performans Değerlendirmesi (PE, Çözülme, donmuş, ama eğer Lab Müstahkem Blank (yani seribaşı reaktif dereceli su kullanarak olumlu bir kalite kontrol LFB) sulandırmak yok ; yani, numaralı seribaşı reaktif dereceli su numuneleri bir çalışmaya başlamadan önce laboratuvar performansını), Performans Testi (PT değerlendirmek için kullanılan; yani, çalışma sırasında laboratuvar performansını değerlendirmek için kullanılan bir analist bilinmeyen titrelerle seribaşı reaktif dereceli su numuneleri ), NA Toplu negatif çıkarma kontrolü, ya da standart eğri kümesinden çıkarılan RNA. </li></ol&gt; </li><li> , Ayrı PCR plaka kuyu içine her test numunesi, kontrol ve standart eğriden RNA 6.7 ul yerleştirin test örnekleri ve kontroller için üçlü kuyuların kullanma ve standart eğrileri (bir RT plaka örneğin Şekil S1 bakın) kuyu yinelenen. <ol><li> Hiçbir şablon kontrolleri (NTC) için ayrı PCR plaka kuyu içine elüsyon tamponu 6.7 ul yerleştirin. İlk örnek için iki ve her dördüncü ek numune için daha sonra iki tane daha kullanılarak RT plaka başına 2-8 NTC ekleyin. </li><li> Plaka boyunca negatif çıkarma ve NTC kontrolleri dağıtın. </li></ol></li><li> Isıya dayanıklı plaka kapatıcı ile PCR plaka mühür. 5-10 saniye örnekleri karıştırın ve daha sonra ≥ 500 xg kısaca santrifüj. </li><li> 99 ° C&#39;de 4 dakika süreyle plaka inkübe ve daha sonra, bir termal döngü içinde 4 ° C&#39;ye kadar hızlı bir şekilde soğutulur. Santrifüj tekrar ≥ 500 xg kısaca at. </li><li> Dikkatle levhası contasını çıkartın ve sonra her kuyuya RT Master Mix 2 16.8 ul ekleyin. Seal karıştırılması, ardından bir ısıya dayanıklı plaka kapatıcı ile tekrar plaka ve ≥ 500 x g&#39;de kısa bir santrifüjleme. </li><li> 4 ° C tutma döngüsü daha sonra, bir termal döngü plaka koyun ve 99 ° C &#39;de, 42 ° C&#39;de 60 dakika, ardından 25 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 5 dakika çalıştırılır ve. </li><li> Proses hemen veya qPCR (Aşama 5), ​​veya mağaza örnekleri ile 8 saat içinde veya altında -70 ° C de işleme tabi kadar. 4 ° C &#39;de 8 saat içerisinde işlenebilir mağazası örnekleri. </li></ol> 5. Gerçek zamanlı Kantitatif PCR (qPCR) <ol><li> Önce herhangi bir test örneklerini çalıştıran hepatit G reaktif her bir lot için ortalama hepatit G Cq değerini belirler. <ol><li> NTC kontroller (Aşama 4.1.1) için tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 10 nümuneyle bir RT deneyi çalıştırın. (5.5.3 için 5.2 Adımları) aşağıda tarif edildiği gibi hepatit G qPCR tahlil çalıştırın. 10 çoğaltır ortalama Cq değerini hesaplayın. </li><li> RT Master Mix 1 hepatit G reaktif miktarı (Tablo 2 ayarlayın), Gerekirse, 25 ve 32 birimleri arasında bir ortalama Cq değeri elde edilmiştir. Su hacmini değiştirerek yükseltilmiş ya da alçaltılmış miktar telafi deney başına 16.5 ul RT Master Mix 1 son hacim tutmak ekledi. </li><li> Ayarlanan miktarda yansıtmak için 5.1.2&#39;de ve değişim Tablo 2 Adımlar 5.1.1 tekrarlayarak ayarlamaları onaylayın. </li></ol></li><li> Enterovirüs için Tablo 3&#39;de kılavuzları kullanarak bir temiz oda qPCR usta karışımları hazırlayın, hepatit Tablo 4 ve fare norovirusa (norovirus genogroup V) norovirus genogroup II, Tablo 7 Norovirüs genogroup I, Tablo 6 Tablo 5 ve Tablo 8 G. Mix, her ana karışımı ve daha sonra ≥ 500 xg kısaca santrifüj. </li><li> Her qPCR deneyi için kuyu ve ayrı levhalar başına 14 ul kullanarak, etiketlenmiş bir optik reaksiyon plaka ihtiva eden uygun oyuklara PCR master karışımları ekleyin (bkz Şekil S2 </strong&gt; Şekil S1 RT düzeni dayalı bir qPCR tahlil) için olası bir düzen için. </li><li> Donmuş ise, oda sıcaklığında Adım 4.8 RT plakasını çözülme. Bir tabak karıştırıcı kullanılarak karıştırın ve daha sonra ≥ 500 xg kısaca santrifüj. </li><li> Optik reaksiyon plakasının uygun oyuklarına uygun cDNA 6 ul koyun. ≥ 500 xg kısaca optik reaksiyon plakası ve santrifüj örnekleri karıştırın. <ol><li> Diğer tüm qPCR tahlilleri çalıştırmadan önce, seyreltilmemiş ve sulandırılmış alan ve LFSM örneklerinde hepatit G qPCR deneyi çalıştırın. Alanın ya da LFSM numunesi &lt;Enterovirüs ve norovirus qPCR deneyleri için ortalama Hepatit G Cq değerinden daha büyük 1 Cq değeri düşük seyreltme kullanın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kantitatif PCR termal döngü yazılımını kurun. Standartlar gibi standart eğri örnekleri tespit ve her bir standart eğri seyreltme için, Tablo 9&#39;da gösterilmiştir genomik kopya değerlerini girin. </li><li&gt; 95 ° C ve 60 ° C &#39;de 1 dakika 15 saniye, 45 döngü, ardından 95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kantitatif PCR termal döngü plaka çalıştırın. </li></ol></li><li> Her bir standart eğri Tablo 10&#39;da verilen kabul edilebilir değerleri karşılayıp karşılamadığını belirlemek. Örnekler için ek malzemeler bölümüne S3 bakın. <ol><li> Denklem 2 kullanılarak standart eğri genel standart sapma (StandartSapma) hesaplayın, <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> Cq her standart eğri çoğaltmak için bildirilen değer olduğu, Cq çoğaltır her set için ortalama değer, #Cq toplam pozitif değerler (yani belirsiz değil) sahip tüm standart kontrol çoğaltır için Cq değerlerin sayısı ve # olduğunu CYBH pozitif değerler var standart kontrollerin sayısıdır. </li><li> Kantitatif PCR termal döngü yazılımı her standart eğri için eğimini hesaplar etmezse, Denklem 3 kullanılarak eğimi hesaplamak60; <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> Cq kullanılan yüksek ve en düşük dilüsyonlarının ortalama değeri ve log nerede GC Tablo 9&#39;dan kullanılan yüksek ve en düşük dilüsyonları için genomik kopya değerinin günlük olduğunu. </li><li> Denklem 4 kullanılarak R2 değerini hesaplayın. <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> Cq tüm Cq değerlerinin ortalaması ve Log GC her tekrar için ortalama Log GC değeridir. </li><li> Denklem 5 ile% Verimliliği hesaplayın: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Tablo 10&#39;da belirtilen kriterleri ve her bir numune için ortalama GC değerlerini karşılayan standart eğrileri dayalı tüm test numuneleri için termal döngü yazılımı tarafından hesaplanan GC değerlerini kaydedin. Içinde kriterlerine uymayan, standart eğrileri ile herhangi bir örnekleri yeniden <strong&gt; Tablo 10 ya da herhangi bir negatif kontrol (LRB, NA Toplu negatif çıkarma kontrolü veya NTC) pozitiftir. Rerun sırasında kriterlerini karşılamak için başarısız ya da yanlış pozitif kontroller herhangi bir numune reprocess. </li><li> Denklem 6 kullanılarak her test numunesi için GC litre başına (GC L) belirlenmesi: <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> GC Aşama 5.7 ortalama genomik kopya sayısıdır, faktör &#39;199&#39; tertier konsantrasyon sırasında meydana gelen hacim indirimleri için toplam seyreltme faktörü, RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR adım, DF inhibisyonu için telafi dilüsyon faktörü ve D litre cinsinden Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğunu. GC L hesaplama örneği için ek malzemeler bölüm S4 bakın. </li><li> 199 Adım 5.5 ortalama GC değerini çarparak ve 0.3 bölerek toplam LFB ve GC ve LRB örnekleri hesaplayınız. </li></ol>

<ol>
	<li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness.">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li><li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan,+China.">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li><li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources.">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li><li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems.">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li><li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus,+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa.">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li><li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater.">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li><li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort.">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li><li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort.">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus.">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li><li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria. , 1-63 (2012).</li><li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches:+a+prospective+cohort+study.">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66 (2010).</li><li>Fout, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , 1-91 (2012).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples.">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li><li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus,+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water.">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li><li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control.">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li><li>Sen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , 1-56 (2004).</li><li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus.">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li><li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enteroviruses+and+hepatitis+A+virus+in+environmental+samples+by+gene+probes+and+polymerase+chain+reaction.">Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction.</a> Proc. Water Qual. Technol. Conf. , 833-853 (1990).</li><li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR.">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li><li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples.">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li><li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment,+using+real-time+reverse+transcription-PCR:+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II.">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li><li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus.">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li><li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish.">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li><li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure.">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li><li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay,+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR.">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li><li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples.">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li><li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR.">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li><li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria,+MS2+and+murine+norovirus.">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , (1996).</li><li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR.">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li><li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+enteroviruses,+adenoviruses,+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters.">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li><li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters.">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li><li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples.">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li><li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water,+using+Salmonella+as+a+model+organism.">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li><li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt,+humic+acid,+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters.">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kaynak ve içme sularının viral bulaşma Büyük ölçekli ulusal çalışmalar birden analitik laboratuarlar kullanılmasını gerektirir. Bu koşullar altında standart bir yöntemdir birden laboratuvarlar tarafından üretilen veriler karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için gereklidir. Virüs tespiti için yayınlanmış birçok moleküler yöntemler, ama çok az standardize moleküler yöntemler vardır. EPA Method 1615, özellikle RT-qPCR su matrislerde Enterovirüs ve norovirusa tespiti için tasarlanmış standart bir yöntemdir. Standardize moleküler yöntemler gıdalarda virüs tespiti için mevcuttur; 16,17 (15216-2 CEN / ISO TS 15216-1 ve CEN / ISO TS 7 Nisan 2013) ve hepatit A virüsü tespit ve norovirus ilkbaharda uygulandı su 16. Tüm standart yöntemler kalite performans kontrolleri ve kriterleri arası en aza indirmek ve içi laboratuvar varyasyonu nedeniyle laboratuvar kontaminasyonu yanlış pozitif verileri içermelidir. Ayrıca, E yanlış veri azaltmak içinPensilvanya Yöntem 1615 işlemci ve tek yönlü iş akışı sırasında iş ayrılmasını öngören moleküler yöntemler üzerinde EPA&#39;nın rehberlik, 18 izler. Bir hepatit G 1,19 iç kontrol nedeniyle RT-qPCR 15 inhibitörleri yanlış negatif sonuç en aza indirmek için prosedürleri içermektedir. Tüm alan veri alanının litre veya su örneklenmiş içme başına genomik kopya ifade edilir, böylece analiz örneklenmiş su ve suyla standardize hacimleri ile birlikte niceliksel tahlilleri kullanır. Etkin tek bir tüp (tek-aşama) RT-PCR deneyleri, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu yöntem kasıtlı ayrı analizler kullanılır. Bu, her bir reaksiyonda analiz edilebilir numune miktarını minimize etme dezavantajına sahiptir, ancak birden fazla primer kümelerinin kullanımı daha fazla esneklik sağlar. Primerleri ve sondaları kullanılan ve büyük olasılıkla hiçbir astar seti bir grup dahilindeki tüm virüs türevlerini algılamak gibi RT-qPCR deneyleri ile ve sadece iyi sınırlıdır. Enterovirüs primer seti nedeniyle seçildiBu 20,21 enterovirüs serotiplerinin çeşitli algılar korunmuş 5 &#39;kodlamayan bölgeye hedef ve bunun ile tespit virüs, işlemden geçirilmemiş yer altı 1 tüketiminden sağlık etkileri ile ilişkilidir. Iki astar set I 22,23 Noroviruses genogroup saptanması için kullanılır. İlk küçük çocuklarda sağlık etkileri arasındaki güçlü korelasyon nedeniyle seçilmiş ve virüs 1. tespit edildi. Onlar suşları 24,25 geniş çeşitliliği tespit çünkü set edilen primer ikinci genogroup ve genogroup II Noroviruses için kullanılan primer seti seçildi. Su içinde viral RNA saptanması için qPCR RT-qPCR prosedürlerinin en önemli avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, dezenfektanlar tarafından inaktive de dahil olmak üzere, her iki bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüs parçacıkları, bu işlemler ile amplifiye edilebilir. Borchardt sonuçları bu tedavi edilmemiş yeraltı f bir sorun daha az olduğunu göstermektedirtopluluklarda benzer rom akiferler dezenfekte yüzey suları 1 den okudu. Kültürlenebilir virüs için bu sorun, kültür 26,27 ile birlikte PCR kullanılarak aşılabilir. Sorun, nükleik asit çapraz bağlama maddeleri 28-30 kullanımı ile, bazı virüs ele alınmıştır. Bu yaklaşım virüs hipokloritin inaktive edilmiş ve UV ile inaktive olanlar için etkili değildir için daha etkilidir. Bu moleküler prosedürlerin İkinci bir kısıtlama tipik olarak analiz edilebilir konsantre edildi numune hacmi kültürü prosedürler 6,31 için kullanılan daha küçük olmasıdır. Bu sorun, genellikle her iki örnek daha küçük bir hacimde yeniden asıldı ve bir üçüncül Örnek konsantrasyonu aşama 6,32,33 eklenerek sağlar Organik flokülasyon standart sekonder konsantrasyonu temin etmek üzere bir polietilen glikol tabanlı bir prosedür ile ikame tarafından işlenir . Yöntem 1615 Santrifüj kullanırugal ultrafiltrasyon tertier konsantrasyonu elde edildi. Santrifüj ultrafiltrasyon su ve test numunelerinde herhangi bir virüsün hem de konsantrasyon ve moleküler deneylerinin küçük molekül ağırlıklı inhibitörlerinin bir azalma ile elde edilen bileşenler daha az 30.000 Dalton kaldırır. Su içinde mevcut olan herhangi bir virüs için&gt; 10 5 genel bir yoğunlaşma katsayısına bu tertier konsantrasyon adımı sonuçları, test edilen. Üçüncü bir kısıtlama çevre numuneleri içinde molekül prosedürlerin önleyicileri varlığıdır. Inhibitörleri kaldırmak için çok sayıda yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen, hiçbir yaklaşım temel inhibisyon seviyesini tahmin etmek için tasarlanmıştır iç kontrollerin yararlanarak, tüm su matrisler ve virüs türleri 6,34,35 için etkilidir. Bu yöntemde kullanılan hepatit G reaktifi bütün reaksiyonlar ve inhibisyon tahmin edilmesi için bir RT-qPCR deneyinde viral RNA sabit bir seviyede sağlayarak bu gereksinimi karşılamaktadır. Ne zaman t iyiO örnek konsantreleri sürece virüs konsantrasyonları konsantrasyonları 14,15 inhibitörü daha yüksek olarak seyreltilmiş olabilir, kaldırma yaklaşımları inhibisyonu kaldırmak için başarısız inhibitör. Burada açıklanan standart eğri prosedürü avantaj ve büyük bir sınırlama hem de sahiptir. Bir avantajı, reaktif madde, tek bir kontrol Tüm deneyler için kullanılacak sağlayan tek bir reaktif içinde Sarf gerekli tüm bileşenlerin kullanılmasıdır. Bu reaktif, özellikle norovirus deneyleri için bir avantajdır. Norovirus partiküllerinin, sadece çok zor standartlar olarak kullanım için, viral parçacıklar elde etmek hale enfekte bireylerden elde edilebilir. En önemli avantaj, bir RNA, standart RNA 36 doğru ölçümü için gerekli olan gibi, tek bir reaktif içinde hedeflenen tüm RNA virüsleri için bir RNA standart sağlamasıdır. Ancak bunun yanında, virüs ölçmek için kabiliyeti matriks etkileri dikkate alınmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Bu, genomik kopyasını demektirsayısı değerler, mutlak değerler olarak kabul edilemez ve sadece göreli olarak dikkate alınmalıdır. Bu standart eğri çalışma stok alikotları yeterli sayıda (1.2 adım) tam çalışmaları kapsayacak şekilde hazırlanmış olması tavsiye edilir. Örneğin, her 250 ul alikot 6 RT plakaları için yeterli bir reaktif sağlar. Bir çalışmada, 500 numune analiz gerektirir olacağı biliniyorsa, 12 alikotları en az (500 numune RT plaka başına / 7 numune / alikotundan başına 6 RT plakaları) ihtiyaç olacaktır. EPA Method 1615 performansa dayalı bir yöntemdir. Birçok üretici, burada belirtilen eşdeğer reaktifler yapmak ve bu reaktifler sürece performans kriterleri karşılandığı gibi ikame edilebilir. Ayrıca pozitif bir RT-qPCR kontrol olarak hizmet vermektedir standart eğri, sorun performans sorunları değer taşımaktadır. Performans nedeniyle RNA bozulması, reaktif raf ömrü, dondurucular başarısızlığı, alet kalibrasyon ve teknik hata reddedebilirsiniz. Performans sorunları şüpheli olmalıonlar standart eğrileri için performans özelliklerini karşılamak değilse ed standart eğrileri Şekil 4&#39;te gösterilen bu farklı ya da eğer. RT-qPCR tahlil oldukça sağlamdır; tam bir başarısızlık nedeniyle RNA veya teknik bir hata (örneğin, bir eksik reaktif) yanlış kullanım muhtemeldir. Büyük bir dikkatle çıkarma ve ribonükleazlar RNA bozulmasını azaltmak için RT adım arasında RNA örnekleri ele alınmalıdır. Zemin ve reaktif dereceli suları ve yeraltı fare norovirus rücu Poliovirüs kazanımları EPA Method 1615 performans kabul kriterleri (Tablo 11) tanıştı ve diğerleri 33,37,38 tarafından bildirilen benzemektedir. LFB örneklerinden Murin norovirus kazanımları poliovirus oranla çok daha düşük olduğunu ve polio virüsünün özel kabul kriterleri yerine olmazdı. Reaktif dereceli sudan daha düşük fare norovirus kurtarma nedenleri bilinmemektedir. Bu tarifnamede sonuçlara benzer şekilde, Karim ve colleagues musluk suyu 39% 4 norovirus GI.1 bir iyileşme bildirmiştir. Lee et al. 37 sıçangil norovirusa ve% 18 insan norovirus GII.4 ve sırasıyla disk filtreleri kullanılarak damıtılmış su% 26 için ortalama geri kazanımını bildirilmiştir. Lee ve meslektaşları benzer şartları kullanarak, Kim ve Ko sırasıyla 38, bu virüsler için% 46 ve% 43 geri kazanımını gözlendi. Gibbons ve ark., 40, deniz suyundan, insan norovirus GII.4% 100 geri etrafında çevresel olarak elde ama Kim ve Ko 38 konsantrasyonları, benzer ya da murin virüs önemli ölçüde azaltılmış geri kazanımları deniz suyundan daha yüksek ve damıtılmış su tuz ilavesi sonuçlandığı bulunmuştur GII.4 kurtarma ile ilgili olarak iki kat azalma.

Kantitatif PCR (qPCR; Bu yazıda kullanılan terimlerin tanımları için tamamlayıcı malzemeler) ve transkripsiyon-qPCR (RT-qPCR) sular tespit ve çevre insan enterik virüsler miktarının ve içme değerli araçlardır ve özellikle bunu birçok virüs için ters çoğaltmak ya da hücre kültür sistemlerinde kötü çoğaltma değil. Her iki araç birçok virüs türleri dünyada 1-6 genelinde çevresel ve içme sularında mevcut olduğunu göstermiştir. Onlar içme suyunda bulunan virüs salgını hastaların 7-10 tarafından bu kulübe aynı olduğunu göstermiştir hastalık mihrak araştırmaları sırasında güçlendirilmiş genomik fragmanların sıralama ile birleştiğinde Bunların kullanımı, su bazlı virüs iletimi için kanıt sunmuştur. QPCR ve RT-qPCR Hem kullanışlı halk sağlığı araçlarıdır. Örneğin, ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından yürütülen çalışmalardan elde edilen veriler güçlü bir ilişki olması gösterdiqPCR ve eğlence sularında sağlık etkileri ile ara gösterge ölçümleri. Bunun bir sonucu olarak, EPA nihai 2012 Dinlenme Su Kalitesi Kriterleri dinlenme plajları 11,12 izlenmesi için bir qPCR yöntemi içerir. RT-qPCR 1 ile ölçülen Borchardt ve arkadaşları da yeraltı suları tedavi edilmemiş yeraltı ve virüs kullanılarak toplumlarda akut gastroenterit arasında güçlü bir ilişki bulunmuştur. Bu yazının amacı, EPA Method 1615 13,14 moleküler tahlil bileşenini tanımlamaktır. Bu deney, bir elektropozitif bir filtreden enterovirüs ve başarılı çevresel veya içme suyu orijinal hacmine dayalı olarak litre başına norovirus genomik kopyalarının (GC) nicel bir tahminde bulunmak için RT-qPCR kullanır. Moleküler prosedürün bir bakış standart eğri hazırlamak için 1. Protokol bölüm Şekil 1 ayrıntıları prosedürler gösterilir. Bu standartlar, RN içeren bir reaktif hazırlanırTüm primer / prob setleri için hedef dizinin bir kopyası. Bölüm 2 üçüncül konsantrasyon prosedürü anlatılmaktadır. Bölüm 3 konsantre su ve kontrol numunelerinin RNA çıkarmak için prosedürü vermektedir. Her bir test numunesi ile ilgili RNA ters üç kopyalı tahliller ve birinci transkripsiyon (Bölüm 4) rasgele primerler kullanılarak transkribe edilmektedir. (Şekil 2, Bölüm 5), her ters transkripsiyon reaksiyonu cDNA qPCR üç kopya halinde analiz edilir Beş ayrı virüse spesifik tahlilleri ayrılmıştır. Deney birçok enterovirüsleri ve Noroviruses RT-qPCR 15 inhibe eden test örneklerini tespit etmek hepatit G RNA ihtiva eden bir reaktif tespit etmek için tasarlanmıştır, bilimsel literatürde (Tablo 1) primerler ve problar kullanılır.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tube chamber</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;deg;C cool brick</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II and 25-mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130</td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Must be a manual defrost freezer</td></tr><tr><td>-70 &amp;deg;C or colder freezer</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96-well chamber</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Armored RNA EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Custom order</td><td>Used for quantifying the RT-qPCR assay</td></tr><tr><td>Armored RNA Hepatitis G virus</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Crystalline grade or better</td></tr><tr><td>Buffer AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Carrier RNA dilution buffer</td></tr><tr><td>Buffer AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Extraction buffer</td></tr><tr><td>Carrier RNA</td><td>Qiagen</td><td>Not applicable</td><td>Use carrier RNA supplied with Buffer AVL</td></tr><tr><td>Centrifuge bottles</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 or 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotors</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Cool safe box</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&amp;reg; 480 Probes Master kit</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;A&#039; film</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSA5001</td><td>Heat resistant</td></tr><tr><td>Microseal &#039;F&#039; film</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>Freezer resistant</td></tr><tr><td>Mini-plate spinner</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Multi-tube chamber</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Optical reaction plate</td><td>Life Technologies</td><td>4314320</td><td></td></tr><tr><td>PCR nucleotide mix</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR plate</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>PCR-grade water</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Plate mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit</td></tr><tr><td>Quantitative PCR thermal cycler</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Random primer</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515 or N2615</td><td></td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II or III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 or 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator units</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR at JoVE.com

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K Görüntüleme.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Video: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Çevre

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması<em&gt; In Situ</em&gt; Kurtarma Bleed Su ve Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, bir Geliştirilmiş INEX Yöntemi için<em&gt; In Situ</em&gt; Partikül Ölçümü ve Çözünmüş bileşikler Aktif Süspansiyon besleme üniteleri İşlenmiş

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of hospitalizations in children with a public health impact similar to that of Rotavirus. NoVs are RNA viruses of great genetic diversity and there is a continuous appearance of new strains. Five genogroups are recognized; GI and GII with their many genotypes and subtypes being the most important for human infection. However, the diagnosis of these two genotypes remains problematic, delaying diagnosis and treatment. 1, 2, 3
For RNA extraction from stool specimens the most commonly used method is the QIAmp Viral RNA commercial kit from Qiagen. This method combines the binding properties of a silica gel membrane, buffers that control RNases and provide optimum binding of the RNA to the column together with the speed of microspin. This method is simple, fast and reliable and is carried out in a few steps that are detailed in the description provided by the manufacturer. 
 Norovirus is second only to rotavirus as the most common cause of diarrhea. Norovirus diagnosis should be available in all studies on pathogenesis of diarrhea as well as in outbreaks or individual diarrhea cases. At present however norovirus diagnosis is restricted to only a few centers due to the lack of simple methods of diagnosis. This delays diagnosis and treatment 1, 2, 3. In addition, due to costs and regulated transportation of corrosive buffers within and between countries use of these manufactured kits poses logistical problems. As a result, in this protocol we describe an alternative, economic, in-house method which is based on the original Boom et al. method4 which uses the nucleic acid binding properties of silica particles together with the anti-nuclease properties of guanidinium thiocyanate.
For the detection and genogrouping (GI and GII) of NoVs isolates from stool specimens, several RT-PCR protocols utilizing different targets have been developed. The consensus is that an RT-PCR using TaqMan chemistry would be the best molecular technique for diagnosis, because it combines high sensitivity, specificity and reproducibility with high throughput and ease of use. Here we describe an assay targeting the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region; the most conserved region of the NoV genome and hence most suitable for diagnosis. For further genetic analysis a conventional RT-PCR that targets the highly variable N-terminal-shell from the major protein of the capsid (Region C) using primers originally described by Kojima et al. 5 is detailed. Sequencing of the PCR product from the conventional PCR enables the differentiation of genotypes belonging to the GI and GII genogroups.

A One-Step RT-PCR assay for detection and genogroup identification of Norovirus isolates from children&#x2019;s stools, that utilizes primers and TaqMan probes specific to the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region, the most conserved region of the Norovirus genome is described. A non-commercial, cost-effective RNA extraction method is detailed.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Tıp

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

Fosfonat adsorpsiyon taneli ferrik minyatürize fosfor belirleme yöntemini kullanarak hidroksit üzerine belirlemek için en iyi duruma getirilmiş yordamı

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15Azot Analizi için Mikroplot Tasarımı ve Bitki ve Toprak Numune Hazırlama

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler