This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan prosedürleri Sağlık 26 National Institutes Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. protokol (MO13M391) Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Yenidoğan Fare Kurban, Diseksiyon ve Fiksasyon <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla bir yenidoğan fare Kurban. </li><li> Hemen diz üstünde hindlimb kesti. Yaklaşık doğum sonrası güne kadar 7, bacak kemikleri bir kriostat sonradan bölüm büyük laboratuvar makas veya keskin bıçak ile kesmek için yeterince yumuşak ve. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit, 10 ml hindlimb yerleştirin. </li><li> Daldırma 4 ° C&#39;de 4-24 saat paraformaldehid hindlimb düzeltmek. Embriyonik doku sadece birkaç saat gerektirirtespitin s. <ol><li> Bu TÜNEL deneyi verimliliği azaltabilir gibi, 24 saat daha uzun tespit kaçının. </li></ol></li><li> Sukroz çözeltisi içinde daldırarak hindlimb cryoprotect. <ol><li> Aynı 15 ml tüp içinde, PBS içinde% 10 sakaroza paraformaldehit değiştirme, 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS içinde% 30 sakroz Change, 4 ° C &#39;de veya borunun alt arka bacak lavabolar kadar gece boyunca inkübe edilir. Doku sükroz steril olarak filtreden geçirilmiş olması koşuluyla, daha uzun bir süre için% 30 sukroz içinde bırakılabilir. </li></ol></li></ol> 2. Doku Gömme <ol><li> Orta gömme ile etiketlenmiş gömme kalıp yarım doldurun. </li><li> Bir kalıp duvarına mümkün olduğu kadar yakın kesilmiş yüzü, gömülü maddenin üzerine hindlimb yerleştirin. Kalıbın dışına hindlimb yönünü işaretleyin. <ol><li> Birkaç arka ayakların göm ve aynı blokta kesti. Ancak, tüm hin sağlamak için önemlidirblokta dlimbs bacak ekseni boyunca seviyeleri eşleşen en bölümleri elde etmek için birbirlerine paralel yönlendirilmiştir. </li></ol></li><li> Orta gömme arka ayakların örtün. Orta dökerken arka ayaklarında vardiya halinde, künt uçlu forseps veya bir kürdan ile yeniden yönlendirin. </li><li> En az 15 dakika boyunca oda sıcaklığında doku sızmaya gömme orta izin verin. </li><li> Doğrudan kuru buz veya kuru buz üzerinde izopentanın yerleştirin kalıpları orta gömme dondurmak için. Her zaman kalıpları seviyede tutmak ve gömülü doku kaymasını önlemek için emin olun. </li><li> Birkaç aya kadar için kesmek için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de dondurulmuş kalıpları tutun. </li></ol> 3. Cryosectioning Gömülü Uzuvlar <ol><li> -20 ° C&#39;ye ayarlayın kriyostat bölme sıcaklığı, -18 ° C malzeme sıcaklığında; Gerekirse aşağı nesne sıcaklığını ayarlamak. </li><li> En az 30 dakika boyunca kriyostat bölmesinde içindeki doku bloğu dengelenmesi. Doğru blok sıcaklığıerature bölümü kalitesi için çok önemlidir. </li><li> 10 um ya da daha az bir kalınlıkta enine kesitler halinde kesilmiştir. Kalın bölümler tamamen TUNEL reaktif nüfuz olmayacaktır. Anti-roll plaka, bıçak, bıçak ve açısını kullanın (tipik olarak 5 °) kriostat için tavsiye. </li><li> Oda sıcaklığında gelatin- veya vectabond kaplı cam lam üzerine bölümleri toplayın. Kuru buz üzerinde bir slayt kutuya hemen yerleştirin. Kol ulaşılabilecek kriostat yakınına yerleştirilen kuru buz ile ayrı bir kapta slayt kutusunu saklayın. <ol><li> 100-200 mikron atlama, ekstremitenin uzun ekseni boyunca enine seri bölümleri kesin. Her seri seviyesinde en az 3 komşu bölümleri toplayın. </li></ol></li></ol> Piyasada Satılan Kit kullanarak Arka ayağın Bölüm 4. TÜNEL Testi (oda sıcaklığında tüm adımları belirtilmediği sürece) <ol><li> Oda sıcaklığında ve kuru bir gecede ya da hafta sonu bölümleri ile slaytlar çözülme. </li><li> Immersin göre bölümleri rehydrateCoplin kavanoz, 2 x 10 dakika boyunca PBS g kayar. Bir laboratuarda Kuru mümkün olduğunca bölüm etrafında kadar sıvı kaldırarak, silin. </li><li> Permeabilize bölümler <ol><li> Olmayan bir proteolitik, saponin tabanlı ticari reaktif veya% 0.5 Tween20 ve% 0.05 PBS Triton X100 birini kullanın. </li><li> Bir nem odasına slayt yerleştirin. Yeterli su kutusunun alt kapağı için eklenen basit bir nem odası, sıkı kapaklı boş bir pipet ucu kutusu. </li><li> Bölümü kapsayacak şekilde slayt üzerine Pipet yeterli reaktif (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir). Tekrarlanan ajitasyon slayt kaldırın bölümüne neden olabilir, bölüm doğrudan pipetle etmeyin. </li><li> Künt uçlu forseps kullanarak, reaktif damla yaymak için bölümün üstüne parafilm küçük bir dikdörtgen koyun ve tamamen bölümü kapsamaktadır. Herhangi kabarcıklar parafilmle altında formu, hafifçe kuru, onu kaldırın ve yeniden. </li><li> Permeabili ile slaytlar inkübekapalı bir nem odası içinde 1 saat boyunca yattığı reaktifi. Bölümler slayt kaldırın başlarsanız, permeabilizasyon süresi 30 dakikaya düşürülebilir. </li><li> Bir Coplin kavanoz 2 x 5 dakika PBS slaytlar yıkayın. Parafilm dikdörtgenler yukarıda kalması gerekir ve daha sonra çıkarılır ve atılır edilebilir. </li><li> Bir laboratuar kullanarak, mümkün olduğunca bölümler etrafında kadar sıvı kurutun wipe. </li></ol></li><li> TdT-aracılı DNA sonu etiketleme <ol><li> (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir) doku bölümünü kapsayacak şekilde slayt üzerine 1x TdT etiketleme tampon, pipet yeterli etiketleme tampon yapmak için kit talimatlarını izleyin. 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Alternatif olarak, bir coplin kavanoza TdT etiketleme tampon slayt batırmayın. </li><li> TdT etiketleme karışımı yapmak için kit talimatlarını izleyin. Kit, kobalt, magnezyum ve manganez katyonları içerir; manganez katyonu iskelet kası, sinir sistemi Tiss de dahil olmak üzere, çeşitli dokuların üzerinde çalışırdaah karaciğer, deri ve kemik. </li><li> Bir pozitif kontrol için, TdT etiketleme karışımı DNase (kit etiketli &quot;Nukleaz&quot;) ekleyin. Seçenek olarak ise, kiti talimatlarına göre, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca nükleaz tamponu içinde DNase ile pozitif bir kontrol bölümü ön-muamele. Çapraz bulaşmayı önlemek için uzak diğer deneysel bölümlerden DNaz çözüm ve DNaz-tedavi bölümleri tutun. </li><li> Bir negatif kontrol için, etiketleme karışımından TdT enzimi atlarsanız. </li><li> Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar TdT etiketleme tampon kaldırmak için mendil kullanın. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle TdT etiketleme karışımı, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak, ve 1 saat süre ile 37 ° C&#39;de nem odasında inkübe edilir. </li><li> 1x durdurma tamponu yapmak için kit talimatlarını izleyin. Slayt TdT etiketleme karışımını uzaklaştırmak için bir temizleme laboratuar kullanın ve doku kesitinin 200-300 ul durdurma tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Al<html> ternatively, bir Coplin kavanoza durdurma tamponu slayt batırmayın. </li><li> PBS slayt 2 x 2 dakika yıkayın. Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar PBS kaldırmak için mendil kullanın. </li></ol></li><li> Floresan etiketleme <ol><li> DNA kırıkları en dNTPs etiketlemek için floresan etiketleme çözümü hazırlamak için kit talimatlarını izleyin. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle çözeltisi, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak ve 20 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. </li><li> Coplin kavanoza PBS içerisinde 2 dakika süre ile yıkayın kayar. Bir laboratuar slayt mümkün olduğunca PBS kaldırmak için mendil kullanın. </li><li> Slayt üzerine 1 mcg / ml PBS ve pipet Hoechst 33258 nükleer leke seyreltin (100-200 ul bölümünü kapsayacak yeterlidir). 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. </li><li> PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. </li><li> Antifade floresan montaj medya ile lamel ve tırnak cilası ile kenarları mühür. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Dijital Görüntü Alma <ol><li> DAPI, FITC, ve Texas Kırmızı filtreleri (veya eşdeğeri) ile geleneksel floresan mikroskop kullanılarak görüntü elde. Etiketleme başarılı oldu ve çekirdekler (bozulmamış veya parçalanmış) etiketli olduğunu doğrulamak için daha yüksek bir büyütme hedefi (20X veya 40X) kullanın. Bir 10X objektif TÜNEL pozitif puncta ölçülmesi için yeterlidir. </li><li> Bir görüntüde kombine üç ayrı yanlış renk kanalları gibi Hoechst boyama, TUNEL boyama ve autofluorescent sinyal görüntüleri toplayın. TÜNEL fluorofor etiketi ve kırmızı filtre, görüntü autofluorescent sinyali, yeşil ise tam tersidir. <ol><li> Sonraki eşikleme ve kantitatif için slaytlar arasındaki eşdeğer tüm görüntüleme ayarları saklayın. Her filtre, önceden ayarlanmış ve kayıt pozlama süreleri, kazanç ve binning için (hiçbir binning en iyisi); Otomatik pozlama veya kazanç ayarlarını kullanmayın. </li><li> En iyi niyet etme aralığını çekeceği pozlama ve kazanç ayarları bulmak için deneme-ve-hata kullanıntüm lekeli slaytlar arasında versiteler. Edinilen görüntülerde hiçbir doymuş piksel bu irade önyargı kantitatif olarak, olmadığından emin olun. </li></ol></li><li> Ilgi tüm kas grubunun görüntüleri çekmek. Bu arada &quot;dikişli&quot; olmak üzere birden çok görüntü gerektirebilir. </li></ol> 6. Görüntü Analizi <ol><li> TÜNEL boyama dijital görüntülerini analiz etmek piyasada mevcut görüntü analiz programları kullanın. Ticari yazılım kullanarak analiz burada gösterilmektedir. Alternatif olarak, NIH ücretsiz yazılım ImageJ TÜNEL boyama analiz etmek için kullanılabilir. </li><li> Hematoksilen ve eosin (H &amp; E) ile TÜNEL-lekeli bölümüne bitişik bir bölüm Leke ve geleneksel aydınlık mikroskop ile tam bölüm dijital görüntü almak. Sayısal olarak anatomik yapıları izlemek için bir anatomi atlası 5,18,19 ile birlikte bu H &amp; E görüntüyü kullanın. </li><li> TÜNEL kanalı kapalıyken, elle kullanırken, sayısal alanın anahat izHoechst ve rehberlik için otofloresansı kanalları. Bir maske içine izlenen alana dönüştürmek (seçilen piksel bir dizi analiz edilecek koordinatları). </li><li> TÜNEL kanalı açın. Görüntü analiz programı işlevini eşikleme yoğunluğu kullanarak, tüm otofloresans sinyalini dışlamak için alt eşiğini ayarlayın. </li><li> Çalışma kümesindeki tüm görüntüleri aynı eşik ayarlarını uygulayın. Maskeler içine eşiklenir seçimleri dönüştürün. </li><li> Her görüntü için, kas alanı maskesi ve maske TÜNEL birleştirir. Yeni kombinasyon maskesi sadece takip kas alanı içinde TÜNEL sinyalini temsil edecek. </li><li> Nesnelerin sayısını belirlemek ve takip kas alanı içinde TÜNEL sinyali alan nesne kombinasyon maske maske kantitatif gerçekleştirin. ImageJ Parçacık Analyzer işlevini kullanarak bu gerçekleştirin. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bir yöntem algılamak ve nicel olarak açıklanan fare iskelet kasında DNA hasarı ile ilişkili apoptozu analiz etmek. Prosedür doku hasadı, TUNEL boyama, dijital görüntü alımını ve görüntü analizi içerir. Ortak histolojik malzemeler ve aletler gereklidir, ve özel ticari TÜNEL kiti gereklidir. gerekli temel büyük ekipman öğeleri Kriyostaz, dijital görüntü özelliğine sahip epifluorescent mikroskop ve görüntü analizi için bir bilgisayar sistemi vardır. deneyci potansiyel tuzaklar farkında olmalıdır. Doku otofloresans floresan görüntüleme önemli bir husustur. Unperfused hayvanlarda, kırmızı kan hücreleri kalan oldukça yüksek autofluorescent sinyalini katkıda bulunacaktır. Endotel hücreleri, aynı zamanda önemli ölçüde otofloresan olabilir. Bu nedenle, bu otofloresans onaylamak için önemlidir TUNEL pozitif sinyal için yanlış değildir. Bu değerlendirme kolayca hiçbir fl olan bir kanalda bir görüntü alarak gerçekleştiriliruorophore, TÜNEL pozitif kanaldan karşılaştırmak ve olası çıkartma için kullanılır. Bu şekilde, flüoresan bazlı TÜNEL metodu arka plan boyaması için bir iç kontrol sunmaz kolorimetrik aydınlık mikroskopi yöntemlere üstündür. Doku tespit TÜNEL etiketleme başarısı üzerinde önemli etkileri olacaktır. Bu, paraformaldehid tespit süresini en aza indirmek için 24 saat geçmeyecek en iyisidir. Embriyonik ve yenidoğan doku 24 saat daha anlamlı kısa tespit süreleri gerektirir. TÜNEL etiketleme başarılı olduğunda bu sinyal kolaylıkla resim analiz yazılımı kullanılarak yoğunluk eşik gating izole edilebilir, böylece TÜNEL pozitif sinyal, arka plan otofloresansı çok daha yüksek olmalıdır. Sitrat tamponu 27,35 ısıtma standart protokol kullanılarak antijen alma hafif ısıtma süresi en az (5 dakika) tutulur, düşük TÜNEL sinyalini geliştirmek, ancak bu ön-muamele on olabilirısıtma (95 ° C &#39;de, örneğin 20 dakika) daha uzun süreler boyunca uzatılması halinde DS TÜNEL sinyalini azaltır. Antijen alma artan TÜNEL sinyali sinyal-gürültü oranı herhangi kazanımlar inkâr edebilir ve böylece arka plan otofloresans ve yanlış pozitif artırmak ve edecek. TÜNEL sinyal ölçümleri quantitated toplam kas alanına veya niceliksel alan başına çekirdeklerin sayısına ya normalize edilmelidir. TÜNEL apoptotik çekirdekleri ölçer Çünkü, ideal bir normalleşme toplam çekirdekler olacaktır. Ancak, hatta nispeten ince (10 mikron) kas bölümlerinde, myofibers ve çekirdekler o kadar çoktur ve otomatik eşikleme ve partikül ayırma algoritmaları tarafından Hoechst-lekeli çekirdekleri saymak imkansız olduğunu, çok yakından dolu. Manuel sayma da çok emek-yoğun ve yanlıştır. uygun alternatif toplam kas alanına normalleştirmek için olduğunu. Uygun doku işleme kullanılabilir TÜNEL deneyiteknikler ve pozitif ve negatif kontroller olarak, doku DNA hasarına ve hücre ölümünü tespit etmek için nispeten hızlı, tekrarlanabilir ve kantitatif bir yöntemdir. Bu, etkilenen hücre tiplerini tespit etmek ve terapötik tedavilerin etkisini değerlendirmek için, bir patolojik bir mekanizma olarak apoptozu teyit etmek için kullanılabilir. Bu prosedür SMA, ALS, müsküler distrofi, toksin kaynaklı miyopati dahil iskelet kası hastalığı ve yaralanma alanlarında araştırmacılara değerli ve fizyolojisini egzersiz olacaktır.

Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) dUTP 3 bağlamak için TdT enzim kullanılarak işlemidir &#39;çift ve tek bükümlü DNA 12,23 sonları arasında sona erer. Apoptoz ve DNA hasarının tespiti için TÜNEL metodu ilk Gavrieli ve ark. 1,12,24 tarafından, 20 yıl kadar önce bildirildi. O zamandan beri değerlendirilir ve farklı doku hazırlıkları 7,23,27,40 optimize edilmiştir. TÜNEL nöronlar 6,14,29 ve 43,44 kardiyomiyositlerde ve iskemiye bağlı hücre ölümü, eksitotoksik nöronal hücre ölümünü 30,31 incelemek için kullanılan ve artrit tedavisinde 39 bir biyolojik olarak edilmiştir. Aynı zamanda, çeşitli insan kanserlerinde 2,3,15,32,37,38,42 bir prognostik faktör ve tümör hücre markeri olarak kullanılmıştır. Alternatif yöntemler DNA hasarı ve hücre ölümü tespiti için var, ama onlar, teknik zorlukları ve uyarılar var. Southern lekeleme quantif için kullanılabilmektedirY bir DNA tam doku lysate&#39;lerin 7,9-11 hasar, ancak bu yöntem hücre düzeyinde çözümlemesi sağlamak ve ölçmek için zor değildir. kuyrukluyıldız tahlil hücrelerinden 4,20,28,36 korunmuş çekirdekleri ayıklanan gerektiren bir alternatif hücre tabanlı bir yöntemdir. Kuyrukluyıldız tahlil kültüre izole hücreler üzerinde iyi çalışır rağmen, iskelet kas dokusunda 8,21 den sağlam çekirdekleri hazırlamak için çok daha zordur. Güney blot gibi, kuyrukluyıldız tahlil bütün kas dokusu homojenattan hücre türüne özgü bilgi vermemektedir. TÜNEL yöntemiyle için başka bir alternatif, tek kordonlu DNA 25,33,41 karşı veya DNA hasarına ve hücre ölümü yolları (örneğin, p53, H2AX ve Kaspaz) 13,17,22,40 katılmak proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak immunohistokimyasal olup. Bu gibi antikor bazlı yöntemler, yüksek bir sinyal-arka oranını elde etmek için antikorların tam karakterizasyon ve mükemmel antikor özelliklerini gerektirir. Hatta zaman spectüpte antikorlar antijen alma prosedürleri 34,35 ile hedef proteinin denatürasyon gerektirebilir, mevcuttur. Burada tartışmak gibi, kabul edilemeyecek kadar yüksek otofloresans kas dokusu sonuçlarında antijen alma. Alternatif yöntemlerin aksine, TUNEL basit pozitif ve negatif kontroller, iyi doku penetrasyonu antijeni alma gerektirmez ve hücresel düzey çözünürlük ile test edilebilir bir yüksek sinyal ve düşük arka plan, mükemmel özgüllük ile DNA hasarı algılama ulaşır. Alternatif yöntemler, tipik olarak gece boyunca inkubasyon gerek duyması karşısında ek olarak, TÜNEL metodu, işlemin tamamlanması için yaklaşık 4 saat sürer. Biz Hsieh-Li ve arkadaşları 16 tarafından oluşturulan spinal müsküler atrofi (SMA) 10 bir fare modelinde iskelet kas hücresi ölümünü incelemek. Kas hücreleri apoptotik ölçmek için, farklı Skele genelinde sağlam çalışır doku hazırlanması, boyama ve kantitatif bir yöntem geliştirdikFarelerde farklı gelişimsel zaman noktalarında tal kas grupları. Biz piyasada mevcut TÜNEL-etiketleme kiti ve ticari olarak satılan görüntü analiz yazılımı kullanmak. Biz de başarıyla omurilik 10 immunofluorescent boyama birlikte TÜNEL tahlili kullandık. Burada tarif edilen yöntemler, iskelet kası, doku patolojisi, hastalığın mekanizmaları, yaşlanmanın mekanizmasını ve gelişim (uygulama öncesi ve sonrası), hücre ölümünü değerlendirmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. TÜNEL tekniği hücrelerinin sadece bir alt grubu, etkilenen ve hücresel düzeyde çözünürlüğü gereklidir modeli sistemlerinde DNA hasarı tamir ve hücre ölümünün çalışmalar için özellikle yararlıdır. Bu video diseksiyon, doku işleme, kesit ve fare iskelet kası flüoresan bazlı TÜNEL etiketleme tarif etmektedir. Aynı zamanda, yarı otomatik TÜNEL sinyal sayımı için bir yöntem tarif etmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Başarılı boyama ile, TÜNEL-pozitif sinyal yoğunluğu eşik ayarlayarak otofloresansı izole etmek yeterince parlak olmalıdır. Düşük büyütme TUNEL-pozitif nesneler iskelet kası (Şekil 1A) olarak parlak düzensiz parçaları görünebilir. Ilgili hücre ölümü türü apoptoz (Şekil 1B) ise, ancak daha yüksek bir büyütmede, klasik apoptotik morfolojisi olan bir TÜNEL pozitif amaçları, takip edilmelidir. pozitif kontrol (DNaz ilave edilir) bölümü (Şekil 1C) tüm dokular arasında düzgün bir şekilde dağılmış, bol TÜNEL pozitif sinyal sergilemelidir. negatif kontrol (reaksiyondan ihmal TdT enzim), düşük yoğunluklu arka plan ve autofluorescent sinyalini sadece (Şekil 1D) boyun eğmek zorundadır. Bu doku, normal apoptosis (Şekil 1A), yüksek bir oranı olarak deri, bütün bacak bölümlerinde bir dahili pozitif kontrol sağlamaktadır. Kırmızı kanhücreler, kemik ve endotelial hücreleri belirgin bir otofloresan sinyali (Şekil 2) katkıda bulunabilir. O otofloresans sağlamak için hiçbir floresan etiketleme ile ayrı bir kanalda her bölüm pozitif TÜNEL sinyalizasyon için yanlış değildir görüntüye tavsiye edilir. Görüntü yoğunluğu eşik (Şekil 2A, orta sıra) ayarlayarak izole edilebilir, böylece gerçek TÜNEL pozitif sinyal otofloresansı çok daha yüksek yoğunluğa sahip olmalıdır. Alternatif olarak, autofluorescent kanal dijital TÜNEL pozitif bir sinyal (Şekil 2A, alt sıra) elde TÜNEL kanaldan çıkarılır olabilir. Burada anlatılan TÜNEL etiketleme yöntemi SMA 10 sahip bir fare modelinde, iskelet kası hücre ölümü ölçmek için kullanılmıştır. TÜNEL etiketleme yavru kontroller (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında, 5 günlük SMA fareleri bacak kaslarında apoptotik profil sayısında bir artış gösterir. apoptoz artıştıryöntemi ile ölçülebilir çoklu kas gruplarında (Şekil 3B) &#39;de istatistiksel olarak önemli farklılıklar gösteren, yukarıda tarif edilen. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: fare bacak kaslarının Temsilcisi TÜNEL etiketleme. (A) tibialis anterior kas, tibia ve cildi gösteren fare hindlimb enine bölümü TÜNEL-etiketli. TA - tibialis anterior, FDL - fleksör digitorum longus, Edl - ekstansör digitorum longus. Yeşil - TÜNEL, mavi - çekirdekler, kırmızı - autofluorescent sinyali. Noktalı çizgiler kantitatif için kas alanları belirginleştiren. Hindlimb kasları bitişik Cilt TÜNEL etiketleme için bir iç pozitif kontrol sağlar. Ölçek çubuğu = 200 mikron. (B) Temsilcisi yüksek büyütme görüntüleri embriyonik TUNEL pozitif yapılar (yeşil) belirlenmesi<html> apoptotik çekirdekleri gibi gün 13 fare iskelet kası. Fayzullina ve Martin 2014 10 modifiye Ölçek çubuğu = 10 um. A ve B. Fare arka bacak (C) enine kesit bir pozitif kontrol olarak hizmet etmek için DNaz muamelesi sonrası TÜNEL etiketli. Çoğu çekirdekler parlak TÜNEL etiketleme var. Ölçü bar = 50 um. (D), C&#39;de gösterildiği gibi, aynı fare hindlimb enine kesit (C bölümü yarı bitişik) bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere çıkarılmıştır TdT enzimi ile TÜNEL etiketli. Hiç parlak TUNEL pozitif sinyal vardır; kırmızı kanalda sinyal ile ko tarafından tespit edilen sadece yeşil sinyal otofloresansı olduğunu. Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2 &quot;fo: içerik width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.211 / 52211fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Şekil 2: Doku otofloresansı kabul ve TÜNEL etiketleme analiz ederken kantitatif dışında tutulmalıdır. TÜNEL etiketleme ve otofloresans (A) Fare hindlimb enine kesiti: otofloresansı (kırmızı) kanal ile orijinal görüntü (üst satır), düzeltilmiş eşikleri ile aynı görüntüde (orta sıra), ve aynı görüntünün (alt satır) çıkarılır. Eşik en çok kırmızı kan hücresi ve endotel hücre otofloresans değil boyama artifakı (ok ucu, orta sıra) ortadan kaldırır. Kanal çıkarma da boyama artefaktını (ok ucu, alt sıra) ortadan kaldırır. Yeşil - TÜNEL, kırmızı - otofloresansı, mavi - çekirdekler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Gri dikdörtgen B büyütülmüş alanı çizer. (B) kırmızı otofloresans panelinin yüksek büyütme görüntüsünü A. Kırmızı kan hücreleri ve bazı endotel hücreleri (oklar) ve Tisshem kırmızı hem de yeşil floresan filtreleri vi boyama artefakt (ok başı) autofluoresce. Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: TÜNEL etiketleme yenidoğan SMA farelerin iskelet kası hücre ölümünü göstermektedir sonrası 5 gün SMA farelerden alt arka bacak kaslarının TÜNEL metodu ile etiketlenmiştir (A), TÜNEL etiketleme SMA farede birden fazla kas grupları birden fazla apoptotik profillerini göstermektedir.. yavru kontrol (sol) ile karşılaştırıldığında, kas (sağda). Yeşil - TÜNEL, mavi - Hoechst (çekirdekleri), kırmızı - otofloresans. Noktalı çizgiler sayısal kas alanları belirginleştiren. TA - tibialis anterior, FDL - fleksör kazmakitorum longus, Edl - ekstansör digitorum longus. Ölçek barlar = 200 mikron. (B) TÜNEL etiketleme kas toplam piksel alanına normalize TÜNEL sinyalinin toplam piksel alanı olarak belirlendi. 5 fareler - Means ± standart hatalar 4 gösterilen, n = edilir. Her kas grubu (tek kuyruklu t-testi) için SMA ve kontrol arasındaki istatistiksel anlamlılık: * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001. Bu rakam Fayzullina ve Martin 2014 10 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K Görüntüleme.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Video: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biyoloji

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.