This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة 26. وتمت الموافقة على البروتوكول (MO13M391) من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز. 1. حديثي الولادة ماوس النحر، تشريح، والتثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية ماوس الأطفال حديثي الولادة عن طريق CO 2 الاستنشاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على الفور من على hindlimb فوق الركبة. حتى اليوم ما بعد الولادة حوالي 7، وعظام الساق هي لينة بما يكفي لقطع طريق مع مقص مختبر كبيرة أو شفرة حادة وقسم في وقت لاحق على ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع hindlimb في 10 مل من الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغمر إصلاح hindlimb في امتصاص العرق ل4-24 ساعة في 4 درجات مئوية. الأنسجة الجنينية تتطلب عدة ساعات فقطالصورة للتثبيت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب تثبيت أطول من 24 ساعة، وهذا قد يقلل TUNEL كفاءة الفحص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect في hindlimb عن طريق غمر في محلول السكروز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير بارافورمالدهيد إلى 10٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في نفس أنبوب 15 مل، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التغيير إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو حتى المصارف hindlimb إلى أسفل الأنبوب. الأنسجة قد يكون غادر في 30٪ سكروز لفترة أطول، شريطة أن يكون السكروز كانت عقيمة-تصفيتها. </li></ol></li></ol> 2. الأنسجة التضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء المسمى تضمين العفن في منتصف الطريق مع تضمين المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع hindlimb على أعلى من المتوسط ​​التضمين، مع الجانب قطع أقرب وقت ممكن لجدار واحد من العفن. بمناسبة توجه hindlimb في الخارج من القالب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين عدة hindlimbs وقطع في نفس الكتلة. ومع ذلك، فمن المهم التأكد من أن كل هينموجهة dlimbs في كتلة موازية لبعضها البعض للحصول على الأقسام في مطابقة المستويات على طول محور من أطرافهم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية hindlimbs مع تضمين المتوسطة. إذا hindlimbs SHIFT أثناء صب المتوسطة، وإعادة توجيه، منهم بالملقط حادة ذات الرؤوس أو المسواك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح تضمين المتوسطة التسلل إلى الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قوالب مباشرة على الثلج الجاف أو في isopentane على الثلج الجاف لتجميد تضمين المتوسطة. تأكد للحفاظ على مستوى قوالب في جميع الأوقات وتجنب التحول من الأنسجة المضمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ قوالب المجمدة في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لقطع، لمدة تصل إلى عدة أشهر. </li></ol> 3. Cryosectioning جزءا لا يتجزأ من أطرافه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة الغرفة ناظم البرد إلى -20 ° C، درجة حرارة الجسم إلى -18 ° C. ضبط درجة حرارة الكائن أسفل عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن كتلة الأنسجة داخل غرفة ناظم البرد لمدة 30 دقيقة على الأقل. درجة الحرارة كتلة الصحيحةerature هو أمر حاسم لقسم الجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع العرضية في سمك 10 ميكرون أو أقل. لن يتم اختراقها أقسام سمكا بالكامل من قبل الكواشف TUNEL. استخدام لوحة مكافحة لفة، شفرات، وزاوية شفرة (عادة 5 °) الموصى بها لناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطع على gelatin- أو الشرائح الزجاجية المغلفة vectabond في درجة حرارة الغرفة. وضع على الفور في مربع الشريحة على الثلج الجاف. الاحتفاظ مربع الشريحة في وعاء منفصل مع الثلج الجاف وضعت بالقرب من ناظم البرد في متناول الذراع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأجزاء المتسلسلة عرضية من خلال محور طويل من أطرافه، وتخطي 100-200 ميكرون. جمع لا يقل عن 3 أقسام المجاورة في كل مستوى التسلسلي. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL الفحص على أقسام Hindlimb باستخدام أدوات المتاحة تجاريا (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الشرائح مع أقسام لدرجة حرارة الغرفة، وبين عشية وضحاها الجاف أو خلال عطلة نهاية الاسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب أقسام كتبها immersinز الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 2 × 10 دقيقة في جرة Coplin. الجافة مع مختبر مسح، وإزالة أكبر قدر من السائل حول القسم ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام Permeabilize <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إما غير بروتين، كاشف القائم على سابونين تجاري أو 0.5٪ Tween20 و 0.05٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. غرفة الرطوبة البسيطة هي مربع ماصة فارغة مع غطاء محكم، مع يضاف الماء ما يكفي لتغطية الجزء السفلي من مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة كاشف كافية على الشريحة لتغطية القسم (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). لا ماصة مباشرة على الباب، والتحريض المتكرر قد يؤدي القسم لرفع قبالة الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط حادة ذات الرؤوس، ضع مستطيل صغير من parafilm على رأس القسم لنشر قطرة من الكاشف وتغطي كامل القسم. إذا تشكل أي فقاعات تحت بارافيلم، ورفع بلطف تشغيله، الجافة، وتطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح مع permeabilization كاشف لمدة 1 ساعة في غرفة الرطوبة مغطاة. إذا بدأت أقسام لرفع الخروج من الشرائح، وربما يتم تخفيض الوقت permeabilization إلى 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني في Coplin جرة 2 × 5 دقائق. يجب المستطيلات بارافيلم تطفو إلى الأعلى، ويمكن بعد ذلك إزالتها والتخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مختبر قضاء، وتجفيف الكثير من السائل حول أقسام ممكن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TDT بوساطة الحمض النووي كسر الوسم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لجعل 1X TDT عازلة وضع العلامات، وماصة المخزن ما يكفي من وضع العلامات على الشريحة لتغطية قسم الأنسجة (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، تزج الشريحة في TDT عازلة وضع العلامات في جرة coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لجعل TDT وضع العلامات المزيج. وتشمل هذه المجموعة الكوبالت والمغنيسيوم والمنغنيز والكاتيونات. والموجبة المنغنيز يعمل بشكل جيد على مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، TISS الجهاز العصبيUES والكبد والجلد والعظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحكم إيجابية، إضافة الدناز (المسمى &quot;نوكلياز&quot; في المجموعة) إلى وضع العلامات مزيج TDT. بدلا من ذلك، قبل علاج قسم مراقبة الإيجابي مع الدناز العازلة في نوكلياز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وفقا لتعليمات الطقم. حافظ على حل الدناز وأقسام المعالجة الدناز بعيدا عن أقسام تجريبية أخرى لمنع انتقال التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لسيطرة سلبية، حذف TDT انزيم من مزيج العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مختبر محو لإزالة أكبر قدر من TDT عازلة وضع العلامات من الشريحة ممكن. ماصة TDT وضع العلامات مزيج على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لجعل عازلة توقف 1X. استخدام مختبر مسح لإزالة TDT وضع العلامات مزيج من الشرائح، وإضافة 200-300 عازلة توقف ميكرولتر لتغطية قسم الأنسجة، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. آل<html> ternatively، تزج الشريحة في المخزن توقف في جرة Coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل دقيقة الشريحة 2 × 2 في برنامج تلفزيوني. استخدام مختبر محو لإزالة PBS قدر من الشريحة ممكن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العلامات الفلورية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لإعداد حل التوسيم فلوريسئين لتسمية dNTPs في فواصل DNA. حل ماصة على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشريحة لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني في جرة Coplin. استخدام مختبر محو لإزالة PBS أكبر قدر ممكن من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع هويشت 33258 صمة عار النووية إلى 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني وماصة على الشريحة (100-200 ميكرولتر كافية لتغطية القسم). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة مع antifade مضان وسائل الإعلام تصاعد وختم حواف مع طلاء الأظافر. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. اقتناء الصور الرقمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية مع دابي، FITC، والمرشحات تكساس الأحمر (أو ما يعادلها). استخدام الهدف التكبير العالي (20X 40X أو) للتحقق من أن العلامات كانت ناجحة وكانت وصفت نوى (سليمة أو مجزأة). والهدف 10X كافية لتحديد الكميات من نقاط وTUNEL إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور من تلطيخ هويشت، TUNEL تلطيخ، وإشارة autofluorescent كما ثلاث قنوات كاذبة اللون منفصلة مجتمعة في صورة واحدة. إذا كانت التسمية fluorophore TUNEL خضراء، إشارة الصورة autofluorescent في مرشح أحمر، والعكس بالعكس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع جميع إعدادات التصوير يعادل بين الشرائح لالعتبة والكميات اللاحقة. لكل مرشح، وأوقات محددة مسبقا والتعرض قياسية، ربح، وbinning (أي binning هو أفضل)؛ لا تستخدم إعدادات التعرض أو كسب التلقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التجربة والخطأ للعثور على التعرض وزيادة الإعدادات التي سوف أفضل التقاط مجموعة من intensities عبر كافة الشرائح الملون. ضمان أنه لا توجد بكسل المشبعة في الصور المكتسبة، وهذه الإرادة التحيز الكميات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور لمجموعة العضلات كامل من الفائدة. وهذا قد يتطلب عدة صور إلى أن &quot;مخيط&quot; معا. </li></ol> تحليل 6. صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المتاحة تجاريا برامج تحليل الصور لتحليل الصور الرقمية من النفق تلطيخ. ويظهر التحليل باستخدام البرمجيات التجارية هنا. بدلا من ذلك، برنامج يماغيج خالية من NIH يمكن استخدامها لتحليل TUNEL تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار قسم مجاور لقسم الملطخة TUNEL مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) واتخاذ القسم كامل الصورة الرقمية مع المجهر brightfield التقليدية. استخدام هذا H &amp; E الصورة في تركيبة مع أطلس التشريح 5،18،19 لتتبع الهياكل التشريحية ليكون كميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع تحول قناة TUNEL قبالة، يدويا تتبع الخطوط العريضة للمنطقة ليكون كميا، وذلك باستخدامهويشت وقنوات تألق ذاتي للاسترشاد بها. تحويل المنطقة تتبع إلى قناع (مجموعة من بكسل اختيار ينسق ليتم تحليلها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على قناة TUNEL. باستخدام شدة العتبة وظيفة في برنامج تحليل الصور، تعيين عتبة أدنى لاستبعاد كل إشارة تألق ذاتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الإعدادات عتبة نفسها لجميع الصور في مجموعة الدراسة. تحويل التحديدات thresholded إلى أقنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صورة، والجمع بين القناع منطقة العضلات وقناع TUNEL. سوف قناع تركيبة جديدة تمثل إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبع فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قناع الكميات على القناع تركيبة لتحديد عدد الكائنات وجوه مجال إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبعها. تنفيذ هذا باستخدام وظيفة الجسيمات محلل في يماغيج. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وهناك طريقة لكشف وتحليل كمي DNA المرتبط ضرر الخلايا في الماوس العضلات والهيكل العظمي وصفها. ويشمل الإجراء الحصاد الأنسجة، TUNEL تلطيخ، واقتناء الصور الرقمية، وتحليل الصور. هناك حاجة إلى إمدادات وأدوات النسيجية المشتركة، وTUNEL عدة التجارية الخاصة أمر ضروري. بنود المعدات الكبيرة الأساسية اللازمة لناظم البرد، المجهر epifluorescent مع القدرة الصورة الرقمية، ونظام الكمبيوتر لتحليل الصور. وينبغي أن يكون المجرب علم المزالق المحتملة. الأنسجة تألق ذاتي هو مصدر قلق كبير في مجال التصوير مضان. في الحيوانات unperfused، وخلايا الدم الحمراء المتبقية المساهمة عالية نسبيا إشارة autofluorescent. ويمكن أيضا أن الخلايا البطانية autofluorescent بشكل كبير. ولذلك، من المهم للتأكد من أن تألق ذاتي ليس مخطئا لإشارة TUNEL إيجابية. يتم إنجاز هذا التقييم بسهولة عن طريق اتخاذ صورة في قناة بدون فلوريداuorophore، لاستخدامها للمقارنة واحتمال الطرح من قناة TUNEL إيجابية. في هذه الطريقة، طريقة TUNEL القائم على مضان متفوقة على الطرق brightfield المجهري اللونية التي لا تقدم الرقابة الداخلية لتلوين الخلفية. سوف الأنسجة التثبيت يكون لها آثار كبيرة على نجاح وضع العلامات TUNEL. فمن الأفضل لتقليل وقت التثبيت في امتصاص العرق، لا تتجاوز 24 ساعة. سوف الأنسجة الجنينية وحديثي الولادة تتطلب تثبيت مرات أقصر بكثير من 24 ساعة. عندما وضع العلامات TUNEL ناجحا، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة أعلى بكثير من تألق ذاتي الخلفية، بحيث إشارة يمكن عزلها بسهولة عن طريق الكثافة عتبة النابضة باستخدام برمجيات تحليل الصور. استرجاع مستضد باستخدام بروتوكول قياسي للتدفئة في المخزن سترات 27،35 قد تحسن قليلا منخفضة إشارة TUNEL إذا بقيت الوقت التدفئة إلى الحد الأدنى (5 دقائق)، ولكن هذه المعالجة عشرةس للحد من إشارة TUNEL إذا تم تمديد التدفئة لفترات أطول (على سبيل المثال 20 دقيقة في 95 ° C). سوف استرجاع مستضد زيادة تألق ذاتي الخلفية وايجابيات كاذبة، وبالتالي قد ينفي أي مكاسب في نسبة الإشارة إلى الضوضاء من زيادة إشارة TUNEL. يجب تطبيع القياسات إشارة TUNEL إما إلى منطقة العضلات إجمالي quantitated أو إلى عدد من النوى في منطقة quantitated. لأن TUNEL يقيس نوى أفكارك، فإن التطبيع المثالي هو أن يكون مجموع نوى. ومع ذلك، وحتى في رقيقة نسبيا (10 ميكرون) أقسام العضلات، وmyofibers ونوى كثيرة جدا ومعبأة بشكل وثيق، وأنه من المستحيل أن العد نوى هويشت الملون وقبل العتبة وفصل الجسيمات خوارزميات تلقائيا. دليل العد هو أيضا جدا والعمل المكثف وغير دقيقة. البديل الممكن هو تطبيع لمنطقة العضلات الإجمالية. الفحص TUNEL، وتستخدم مع معالجة الأنسجة المناسبالتقنيات والضوابط الإيجابية والسلبية، هو، قابلة للتكرار، طريقة الكمي السريع نسبيا للكشف عن الحمض النووي من التلف وموت الخلايا في الأنسجة. ويمكن استخدامه لتأكيد موت الخلايا المبرمج كآلية المرضية، لتحديد أنواع الخلايا المتضررة، وتقييم فعالية من العلاجات العلاجية. وهذا الإجراء تكون ذات قيمة للباحثين في مجالات أمراض العضلات والهيكل العظمي والإصابة، بما في ذلك SMA، ALS، ضمور العضلات، التي يسببها السم اعتلال عضلي، وممارسة علم وظائف الأعضاء.

محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP وضع العلامات نهاية نيك (TUNEL) هو عملية استخدام انزيم TDT إرفاق dUTP إلى 3 &#39;ينتهي من مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل DNA يكسر 12،23. وذكرت وطريقة TUNEL للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر لأول مرة منذ أكثر من 20 عاما من قبل Gavrieli وآخرون. 1،12،24. ومنذ ذلك الحين تم تقييمها والأمثل في الأعمال التحضيرية الأنسجة المختلفة 7،23،27،40. وقد استخدم TUNEL لدراسة موت الخلايا الناجم عن نقص التروية من الخلايا العصبية 6،14،29 والعضلية 43،44، excitotoxic المواد موت الخلايا العصبية 30،31، وكما العلامات البيولوجية في علاج التهاب المفاصل 39. كما تم استخدامه كعامل النذير وعلامة الخلايا السرطانية في مختلف السرطانات البشرية 2،3،15،32،37،38،42. وتوجد طرق بديلة لالحمض النووي من التلف والكشف عن موت الخلايا، ولكن لديهم التحديات التقنية والمحاذير. النشاف الجنوبي يمكن أن تستخدم لquantifذ الحمض النووي من التلف في الأنسجة لست] كاملة 7،9-11، ولكن هذه الطريقة لا توفر الدقة المستوى الخلوي ويصعب قياسها كميا. الفحص المذنب هو طريقة خلية القاعدة البديل الذي يتطلب استخراج نواة من خلايا الحفاظ 4،20،28،36. على الرغم من أن الفحص المذنب يعمل بشكل جيد على خلايا معزولة مثقف، هو أكثر صعوبة لإعداد نواة سليمة من أنسجة العضلات والهيكل العظمي 8،21. كما هو الحال مع اللطخة الجنوبية، ومقايسة المذنب لا يقدم معلومات الخلية من نوع محددة من كله جناسة الأنسجة العضلية. وثمة بديل آخر لطريقة TUNEL هو المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد احد الذين تقطعت بهم السبل DNA 25،33،41 أو ضد البروتينات التي تشارك في الحمض النووي ردا الضرر وموت الخلايا مسارات (مثل البروتين p53، H2AX، وcaspases) 13،17،22،40. مثل هذه الأساليب القائمة على الأجسام المضادة تتطلب توصيف دقيق للالأجسام المضادة والأجسام المضادة خصوصية ممتازة لانتاج نسبة عالية الإشارة إلى الخلفية. حتى عندما المواصفاتالأجسام المضادة IFIC موجودة، وأنها قد تتطلب تمسخ من البروتين الهدف من خلال إجراءات استرجاع مستضد 34،35. ونحن نناقش هنا، استرجاع مستضد في نتائج الأنسجة العضلية في تألق ذاتي عالية بشكل غير مقبول. وخلافا للطرق البديلة، TUNEL يحقق DNA الضرر الكشف مع إشارة عالية وخلفية منخفضة، والنوعية الممتازة التي يمكن اختبارها مع ضوابط بسيطة الإيجابية والسلبية، اختراق الأنسجة الجيدة التي لا تتطلب استرجاع مستضد، والدقة المستوى الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة TUNEL يستغرق حوالي 4 ساعات لإكمال، في حين أن الطرق البديلة تتطلب عادة حضانات بين عشية وضحاها. نقوم بدراسة الهيكل العظمي موت الخلايا العضلية في نموذج الفأر من ضمور العضلات الشوكي (SMA) 10 التي تم إنشاؤها بواسطة هسيه لى وزملاؤه 16. لتحديد الخلايا أفكارك في العضلات، قمنا بتطوير طريقة التحضير الأنسجة، وتلطيخ، والكميات التي تعمل بقوة عبر skele مختلفةمجموعات العضلات التل على مختلف النقاط الزمنية التنموية في الفئران. ونحن نستخدم المتاحة تجاريا عدة TUNEL وضع العلامات ومتاحة تجاريا البرمجيات تحليل الصور. وعلينا أيضا أن تستخدم بنجاح الفحص TUNEL في تركيبة مع تلوين مناعي في الحبل الشوكي 10. الأساليب المذكورة هنا هي مفيدة للمحققين الذين يريدون لتقييم أمراض الأنسجة، وآليات المرض، وآليات الشيخوخة، والتنموية (قبل وبعد الولادة) موت الخلايا في العضلات والهيكل العظمي. تقنية TUNEL مفيدة بشكل خاص للدراسات الحمض النووي من التلف وإصلاح وموت الخلايا في نظم نموذج حيث لا يوجد سوى مجموعة فرعية من الخلايا هي قرار مستوى المتضررين والخلوية ضروري. هذا الفيديو يصف تشريح، معالجة الأنسجة، باجتزاء، ووضع العلامات TUNEL القائم على مضان من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويصف التقرير أيضا وسيلة لشبه الآلي إشارة الكميات TUNEL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

مع تلطيخ ناجحة، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة مشرق بما فيه الكفاية لعزل من تألق ذاتي من خلال وضع عتبات كثافة. الأجسام TUNEL إيجابية في التكبير المنخفض قد تظهر أجزاء غير منتظمة كما مشرق في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 1A). ومع ذلك، في أعلى التكبير، وبعض الكائنات TUNEL الإيجابي مع التشكل أفكارك الكلاسيكي ينبغي أن تراعى، إذا كان نوع موت الخلايا المعنية هو موت الخلايا المبرمج (الشكل 1B). مراقبة إيجابية (المضافة الدناز) يجب أن تظهر وفيرة-TUNEL إيجابي إشارة، موزعة بشكل متجانس في جميع الأنسجة في قسم (الشكل 1C). سيطرة سلبية (TDT انزيم حذفت من رد فعل) ينبغي أن تسفر خلفية منخفضة الكثافة وإشارة autofluorescent فقط (1D الشكل). يوفر الجلد عنصر تحكم إيجابية الداخلية في أقسام المحطة بأكملها، وهذا النسيج لديها نسبة عالية من الخلايا العادية (الشكل 1A). الدم الحمراءالخلايا والعظام والخلايا البطانية يمكن أن تسهم كبيرة إشارة autofluorescent (الشكل 2). فإنه من المستحسن أن صورة كل قسم في قناة منفصلة مع أي وضع العلامات الفلورية لضمان تألق ذاتي ليس مخطئا لإشارات TUNEL إيجابية. وينبغي أن يكون الحقيقية-TUNEL إيجابي إشارة كثافة أعلى بكثير من تألق ذاتي، بحيث يمكن عزلها من خلال وضع عتبات كثافة الصورة (الشكل 2A، الصف الأوسط). بدلا من ذلك، القناة autofluorescent قد تطرح رقميا من قناة TUNEL أن تسفر-TUNEL إيجابي إشارة (الشكل 2A، الصف السفلي). طريقة وضع العلامات TUNEL الموصوفة هنا قد استخدمت لقياس موت الخلايا العضلات والهيكل العظمي في نموذج الفأر من SMA 10. يظهر وضع العلامات TUNEL زيادة في عدد محات أفكارك في عضلات الساق من 5 أيام الفئران SMA القديمة، مقارنة مع الضوابط littermate (الشكل 3A). الزيادة في موت الخلايا المبرمج هوقابلة للقياس الكمي التي كتبها الطريقة الموصوفة أعلاه، مشيرا إلى فروق ذات دلالة إحصائية في مجموعات العضلات متعددة (الشكل 3B). <img alt="الشكل (1)" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1: وضع العلامات TUNEL الممثل العضلات hindlimb الماوس. وصفت TUNEL (A) المقطع العرضي من الماوس hindlimb تظهر الظنبوبي الأمامي العضلات، والساق، والجلد. TA - الظنبوبي الأمامي، إف دي إل - المثنية لأصابع إبهام اليد، مؤسسة كهرباء لبنان - الباسطة للأصابع الطويلة. الأخضر - TUNEL والأزرق - نوى، الحمراء - إشارة autofluorescent. الخطوط المنقطة ترسم مناطق العضلات لتحديد الكميات. الجلد المجاور العضلات hindlimb يوفر مراقبة إيجابية الداخلية لوضع العلامات TUNEL. شريط النطاق = 200 ميكرومتر. (B) التمثيلية صور عالية التكبير تحديد TUNEL إيجابية الهياكل (الأخضر) في الجنينية<html> يوم 13 الماوس العضلات والهيكل العظمي كما نوى أفكارك. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. A و B معدلة من Fayzullina ومارتن 2014 10. (C) المستعرض قسم من الماوس hindlimb TUNEL المسمى بعد العلاج الدناز لتكون بمثابة مراقبة إيجابية. معظم نواة لها وضع العلامات TUNEL مشرق. شريط النطاق = 50 ميكرومتر (D) المقطع العرضي من نفس الماوس hindlimb كما هو مبين في C (شبه المتاخمة للقسم في C) TUNEL المسمى مع TDT انزيم حذفت لتكون بمثابة سيطرة سلبية. لا يوجد أي إشارة TUNEL إيجابية مشرقة. إشارة خضراء الوحيد هو تألق ذاتي كما الكشف عنها بواسطة colocalization مع إشارة في القناة الحمراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 6in &quot;SRC =&quot; / الملفات / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg &quot;العرض =&quot; 600 &quot;/&gt; الشكل 2: الأنسجة تألق ذاتي يجب النظر ويستثنى من الكميات عند تحليل وضع العلامات TUNEL. (A) ماوس hindlimb المقطع العرضي مع وضع العلامات TUNEL وتألق ذاتي: الصورة الأصلية (الصف العلوي)، وبنفس الصورة مع عتبات المعدلة (الصف الأوسط)، ونفس الصورة مع تألق ذاتي (الحمراء) قناة تطرح (الصف السفلي). العتبة يزيل خلايا الدم الحمراء أكثر وتألق ذاتي الخلايا البطانية ولكن ليس قطعة أثرية تلطيخ (رأس السهم، الصف الأوسط). الطرح القناة أيضا يلغي قطعة أثرية تلطيخ (رأس السهم، الصف السفلي). الأخضر - TUNEL والأحمر - تألق ذاتي والأزرق - نوى. على نطاق وبار = 100 ميكرون. المستطيل الرمادي يحدد منطقة تضخيم في (ب). (ب) ارتفاع تكبير الصورة من لوحة حمراء تألق ذاتي في A. خلايا الدم الحمراء وبعض الخلايا البطانية (الأسهم)، وTISSرق تلطيخ قطعة أثرية (رأس السهم) autofluoresce في كل من المرشحات مضان الحمراء والخضراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> الشكل 3: وضع العلامات TUNEL يظهر موت الخلايا في العضلات والهيكل العظمي من الفئران SMA حديثي الولادة وصفت العضلات hindlimb انخفاض من الفئران SMA في يوم ما بعد الولادة 5 من طريقة TUNEL (A) وضع العلامات TUNEL يظهر ملامح أفكارك متعددة في مجموعات العضلات متعددة في SMA الماوس. العضلات (يمين) مقارنة مع السيطرة littermate (يسار). الأخضر - TUNEL والأزرق - هويشت (النواة) والأحمر - تألق ذاتي. الخطوط المنقطة ترسم المناطق العضلات كميا. TA - الأمامية الظنبوبي، إف دي إل - حفر المثنيةitorum الطويلة، مؤسسة كهرباء لبنان - الباسطة للأصابع الطويلة. الحانات النطاق = تم كميا 200 ميكرون وضع العلامات. (B) كما TUNEL مجموع مساحة بكسل إشارة TUNEL تطبيع إلى إجمالي مساحة بكسل من العضلات. وترد يعني ± الأخطاء المعيارية، ن = 4-5 الفئران. دلالة إحصائية بين SMA والسيطرة على كل مجموعة العضلات (وحيد الطرف اختبار t): * ف &lt;0.05، ** p &lt;0.01، *** P &lt;0.001. تم تعديل هذا الرقم من Fayzullina ومارتن 2014 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K Views.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Video: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

إجراءات الجرذ<em&gt; في الموقع</em&gt; خصائص العضلات الهيكلية مقلص

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.