Name: efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach at JoVE.com

We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

Bu çalışmada tarif edilen tüm prosedürler, Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kurallara göre gerçekleştirilmiştir. Öncesinde Zaman: 1. Araçlar, Reaktifler ve Yemekleri Hazırlama <ol><li> Yumurtalar hazırlanması: Bir yumurta kuluçka makinesi içinde 5 gün 37,5 ° C ve% 60 bağıl nemde döllenmiş Beyaz Legorn tavuk yumurtası inkübe edin. NOT: standartlaştırılması ve embriyonik gelişim senkronizasyonu için yararlı olabilir kapasitesi sallanan, ama sallanan bir inkübatör bu protokol sonucu için kesinlikle gerekli değildir. </li><li> Plazmid hazırlanması: <ol><li> Gerektiğinde tasarım plasmid (RNAi teknolojisinde 1,34 kullanımı yoluyla örneğin) geni aşırı ekspresyonu veya aşağı doğru düzenleme için yapılırlar. Mümkün olan her yapı içinde bir raportör gen (örneğin, EGFP, RFP veya LacZ gibi) içerir. Not: CMV gibi bazı yaygın olarak kullanılan promotörler, bir süre sonra susturulması hale gelebilir. CAG promoter (tavuk beta-aktin promoteri, CMV artırıcı ile) ilgi 35-37 genin etkin, uzun vadeli ifade sağlayan, çok iyi bir alternatiftir. </li><li> Şekilde steril PBS içerisinde 1.5 ug / ul bir konsantrasyonda bir plazmid çözeltisi hazırlayın. İSTEĞE BAĞLI: vaktinden plazmid çözüm hazırlayın ve dondurulmuş Kullanıma hazır olana kadar saklayın. NOT: Yüksek plazmid konsantrasyonları kullanılarak oysa alt plazmid konsantrasyonları transfeksiyon verimliliği 1 düşük, verimlilik önemli bir artışa yol açmaz. </li></ol></li><li> Elektrotlar: <ol><li> Anot kullanımı için kalın bir altın (Belirli Malzemeler / Ekipman Tablo) elektrodu uçlu. % 70 etanol ile silin. Not: altın İzolasyon maruz kalan yaklaşık 0,5 mm bırakarak, elektrot uçlu, elektrik akımının sızmasını en aza indirmek için tavsiye edilir. Yalıtım malzemesi için bilgiler Özgül Materyallerin Tablo bulunabilir. </li><li> 2.5 mm kare b dışında bir katot yapın(normalde Mikropipet Elcikler kullanılan) 4.5 mm genişliğinde öküz filament. Forseps yardımı ile, kare kutu geri almak ve uzun bir şerit haline filamanın düzeltin. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu ve bir kılavuz olarak bir cetvel kullanarak altında, tabanda 3 mm uzunluğunda kare &quot;U&quot; şekline filamanın bükülmesi ve diğer tarafta filament kalan uzunluğu (Şekil 1 ile birlikte, bir yandan 2 mm yükseklikte C - D). Forseps kullanarak,% 96 etanol ve alev elektrot sterilize etmek batırın. Sonra elektrot uzun koluna küçük bir timsah klibi ile bir elektrik kurşun takın. </li></ol></li><li> Elektroporasyon Odası Kurulumu: <ol><li> 100 mm Petri kabı kullanarak bant (Şekil 1E) için, aşağı, düz tarafı bunu steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı kesme ve yapıştırılması ile elektroporasyon odasını hazırlayın. Not: işe benzer büyüklükte bir oyuk şeklinde diğer bir kap; Ancak, bir mikrosantrifüj tüp kapağı kolayca erişilebilir ve otoklavlanabilir. Kuyuplazmid çözümün bir atık sonuçlanması bir civciv göz ve katot elektrot evine kadar büyük, ama çok büyük olmamalıdır. </li></ol></li></ol> 2. Ex ovo Elektroporasyon Prosedürü <ol><li> Araçların Hazırlanması: <ol><li> Mikro-diseksiyon araçları sterilize batırarak (yumurta kabukları açılması ve embriyolar, RPE kaldırmak için Dumont cımbız kavisli ince ucu 2 çift dışarı karıştırıyordu için büyük kavisli Moloney forseps 2 çift, Bonn bir çift kaldırma lens ve vitreus için forseps dişli) % 96 etanol ve alevli ipuçları. % 70 etanol batırılmış mendil kullanarak temizleyin diseksiyon kapsamı. Bir 37 ° C su banyosu içinde, steril Kalsiyum-Magnezyum içermeyen Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (CMF-HBSS) bir şişe ısıtın. Sıcak CMF-HBSS ile tam 3/4 100 mm steril Petri kapları doldurun. </li><li> Başka bir temiz diseksiyon mikroskobu altında elektroporasyon odasına yerleştirin ve plazmid çözüm 120 ul ile doldurun. Elektroporasyon aparatı elektrotları geç yapmaEmin ısmarlama elektrot negatif kutbuna bağlı olan ve altın pozitif kutup elektrodu uçlu. </li></ol></li><li> Embriyo Koleksiyon: <ol><li> % 70 etanol içinde ıslatılmış mendillere kabukları ile silerek yumurta temizleyin. Kültürleri kirlenmesini önlemek için taşıma protokolün geri kalanı boyunca steril prosedür koruyun. Büyük kavisli Moloney forseps kullanarak dikkatlice yavaşça (hava bölmesinin üstünde) bir yumurta yuvarlak ucunda dokunarak ve ardından sürükleyici ve kabuk parçaları çekerek yumurta kabuğunda bir delik açın. </li><li> Forseps başka çift membranlar kaldırmak ve yumurta dışarı karıştırıyordu embriyo toplamak ile (dikkatli olmak embriyo zarar vermemek için). CMF-HBSS ile bir tabak koyun. NOT: 2.4.4 belirtildiği gibi elektroporasyon için retina bardak istenen sayısını elde etmek için gerektiği kadar embriyolar toplayın </li><li> KRİTİK ADIM: Hamburger ve Hamilton 38 göre embriyolar Sahne. NOT: Optimum verimlilik embriyolar elde etmek içinevre 27 (Şekil 2A) olmalıdır. </li><li> Moloney forseps kullanarak kafaları kesilmek suretiyle embriyolar Euthanize. </li></ol></li><li> Retina Kupaları edinme: <ol><li> İnce Dumont cımbız kullanarak, dikkatle gözleri enükleasyon ve yeni bir CMF-HBSS çanak aktarın. </li><li> Optik sinir başı yakınında her göz, arka kısmından başlayarak, iki ince Dumont cımbız kullanarak, nöral zarar vermemeye RPE dikkatli olmak teşrih nöral retina ve RPE ve dikkatle arasındaki cımbız her çiftin bir ipucu tanıtmak Retina (Şekil 2B). NOT: RPE yardımcı olacaktır çözeltide Ca 2 + ve Mg 2+ eksikliği daha kolay nöral retina ayırmak. </li></ol></li><li> Elektroporasyon: <ol><li> 15 Volt, 50 msn süreli ve 950 msn aralığının 5 kare darbeleri teslim Electroporator parametreleri ayarlayın. Yer &#39;U&#39; elektroporasyon odası (mikrosantrifüj kapak dolgu içinde negatif elektrot şeklindeplazmid içeren çözeltinin 120 ul) ile ed. </li><li> Kullanımı kavisli Dumont cımbız (değil karıştırıyordu basarak) elektroporasyon odasına tek retina fincan aktarmak ve elektrodun alt ve yukarı bakacak objektif yönüne retinanın arka kısmı ile, &#39;U&#39; şekilli elektrodun içine yerleştirin ( Şekil 2B). </li><li> Bir sonraki lens, gözün ön kısmını dokunur ve Electroporator ayak pedalı elektrik atımları teslim kullanarak böylece anot yerleştirin. </li><li> CMF-HBSS ile yeni bir Petri kabı elektropore retina fincan aktarın ve kalan retina bardak her biri ile elektroporasyon prosedürü tekrarlayın. Not: 6 retina bardak kadar transfeksiyon verimi önemli bir azalma olmadan aynı plazmid çözeltisi ile elektropore edilebilir. </li><li> Bonn dişli forseps ile onları kavrama ve yavaşça t içinden çekerek her electroporated retina fincan lens ve vitreus vücuda kaldırkavisli Dumont cımbız arkası ile yerinde gözü tutarken o açılış öğrenciye. </li><li> Standart prosedürler izlenerek Electroporated retina hücreleri ayrışma ve kültür geçin. NOT: civciv retina hücreleri ayrışma ve kültürü üzerinde detaylı bir protokol için Vergara ve Canto-Soler, 2012, Ek dosyaya 4 21 bakın Bu protokolde hücreler poliornitin kaplı 6-kuyucuğu veya 35 düşük yoğunlukta numaralı seribaşı. -mm yemekleri (6 x 10 5 hücre / 35 mm çaplı kuyu veya çanak). Kullanılan ortam penisilin / glutamin, 10% fetal buzağı serumu (FCS) ve 100 ug / ml&#39;de, linoleik asit-BSA ile 199 ortamıdır. Kültürler,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde muhafaza edilir. Bu prosedürü kullanarak, 5-6 x 10 6 hücre genellikle her aşama 27 Electroporated göz başına elde edilebilir. NOT: İdeal olarak, en fazla 3 saat embriyo toplama ve hücre kaplama arasında geçmelidir, iyi hücre hayatta kalmasını sağlamak içinve stresi en aza indirmek. Gözlem ve daha fazla analiz için tipik bir zamanlama bu noktada hücreler, iyi bir morfolojik ve moleküler farklılaşma elde ettik ve hayatta kalma hala yüksek olduğu için, kültür içinde 4 gün sonra olur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells:+a+novel,+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures.">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li><li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).</li><li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture.">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li><li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations:+characterization+and+partial+purification.">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li><li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+survival:+identification+of+RdCVF.">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li><li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEDGF:+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells.">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li><li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture.">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li><li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors.">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li><li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro.">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li><li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons.">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li><li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1.">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures:+Effects+of+PNPF,+a+substratum-bound,+neurite-promoting+factor.">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo.">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li><li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis.">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li><li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures.">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li><li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures.">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li><li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro:+analysis+with+the+'window-labeling'+technique.">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li><li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures.">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li><li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells.">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22 (2012).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+types+in+the+retina.">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li><li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro.">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li><li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies,+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor.">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li><li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation.">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li><li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation.">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li><li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures.">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).</li><li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures.">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li><li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro.">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li><li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transfected+genes+by+differentiated,+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures.">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li><li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells.">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li><li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer.">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells.">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

Bu protokolün başarısı için en kritik adım embriyoların uygun sahne seçmektir. Önceki yayınlarda, embriyonik gelişim evrelerinin bir dizi tipik kuluçka veya embriyonik gün gün (ED) tarafından tanımlanan, bu kültürlerin verilir; Böylece genellikle ED 6 embriyolar ED 5 kullanarak eşdeğer sonuçlar verecektir varsayılmaktadır. Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi sahne 27 (ED 5) üzerine, transfeksiyon verimi, toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 22 olacak olduğunu bulmuşlardır; Henüz verim evre evre 29 28 embriyolar (ED 5.5) ve% 12 (ED 6) kullanıyorsanız% 16 azalma 1. edecektir Diğer kritik adımlar süreci boyunca steril koşullar muhafaza içerir; Gerekli el becerisi edinme diseksiyon ve elektroporasyon sırasında retina zarar görmemesi için; ve hücre kaplamanın zaman embriyo toplama zamanında uzun boşluklar kaçınılır. Bir diğer önemli husus iyi transfeksiyon efficien sağlamak içinleri plazmid içeren çözeltinin konsantrasyonu: önerilen 1.5 ug / ml, etkinlik ile bir azalmaya neden olmadığını test edilen en düşük konsantrasyondur. Retinal bardak bu çözelti içinde yıkanmış olduğunu göz önüne alındığında, bu konsantrasyon plazmid malzemenin yüksek miktarda anlamına gelir. (Böyle bir mikrosantrifüj tüpü kapağının gibi) göz karşılayacak küçük boyut kuyusu kullanarak bu sorunu en aza indirebilir. Buna ek olarak, pek çok gözün aynı çözelti kullanılarak elektroporasyona edilebilir; Aynı plazmid çözüm ardışık 6 retina bardak kadar electroporating biz verimliliğinde bir azalma görmedim, ve daha büyük olasılıkla yapılabilir ama biz bundan sonra verimlilik farkı kanıtı olamaz. Daha önce yayınlanmış protokoller genellikle kültür bu tür gen transferinin düşük verimlilik sağladık ve böylece genellikle bir hücre l üzerinde enzimatik reaksiyonların ürünü ölçen tekniklerine güvenmek zorundaduyarlılığını artırmak amacıyla ysate. Böyle bir yaklaşım, hücre tipi ayrımı için ve her zaman büyük bir hücre popülasyonunun davranışı yansıtıcı olabilir gözlenen sonucun sorumlu olan hücrelerin düşük sayıda güvenmek izin edilememesi gibi bir dezavantaja sahiptir. Düşük verimlilik sorunu aşmak için başka bir yolu önce göz enükleasyon ve kültür, in vivo gen transfeksiyon yapmaktır. Bu uygulanabilir bir yaklaşımdır ama plazmid elektroporasyon ve RCAS virüsü enfeksiyonu (civciv ortak bir gen iletim vektörü) hem tipik erken gelişim aşamalarında yapılması gerekir çünkü genellikle arasında bir zaman farkı yaratarak, sadece belirli deneysel paradigmalar uygulanabilir transfeksiyon ve kültür. Bu zaman süresince hücreler hücre dışındaki mikro yanı sıra hücre içi faktörlerin her ikisi de etkilerine maruz kalan, bu exp yorumlanmasında önemli etkileri olan, önemli bir hususturerimental sonuçlanır. Bunun aksine, elektroporasyon yaklaşımı ovo ex elde gen transfer etkinliğine önemli bir artış, bir hücre-içsel bir şekilde gen fonksiyonlarının araştırılmasında sağlar. Otomatik yüksek verimli hücre analizi 1 ile bağlantılı olarak kullanıldığında Ayrıca bu yüksek transfeksiyon oranı avantajı daha da arttırılabilir. Bu tekniğin gelişmenin ilk aşamalarında, biz farklı koşullar 1 ile elde elektroporasyon etkinliğini değerlendirmek için 24 saat kültürde RPE yoksun göz bardak elektropore sürdürdü. Biz kez daha uzun süre kültür onları girişimi yoktu, ancak bizim deneyim burada tarif edilen protokol de uygun uzun vadeli eksplant kültür koşulları kullanıldığında sağlanan retina organotipik eksplant güvenerek çalışmalara uygulanabilir belirtir. Son olarak, inci uygulanabilirliği genişletmek mümkün olacaktırdiğer hayvan modelleri elektroporasyon yaklaşımı ex ovo olduğunu. Bu protokol kullanılarak doğum sonrası gün 1 ya da 4 ° C&#39;de fare gözlerinin deneyim transfeksiyonu Örneğin eksplant kültürlerinde nitelik ölçüde iyi sonuçlar vermiştir, ancak ayrışmış hücre kültürleri teşebbüs edildiğinde transfeksiyon verimi diğer tekniklerin benzer% 6 düzeyinde olmuştur. Böylece, bu hayvan modelinde diğer protokollere basit bir alternatif olabilir, ancak yüksek verimlilik gerekiyorsa belirli bir sistem için optimize edilmesi gerekir. Unutmayın ki, yukarıda da belirtildiği gibi, elektroporasyon sırasında embriyonik aşama civciv elde edilen yüksek verim sonuca önemli olduğunu, bu yüzden diğer modellere tekniğini uygularken bu parametre dikkate alınmalıdır. Güçlü araçlar in vivo çalışmalar tamamlayıcı olarak Sonuç olarak, elektroporasyon tekniği ex ovo n sunan in vitro retina sistemlerin uygulanabilirliği genişletebilirsinizRetina araştırma için ew olasılıklar.

Embriyonik civciv retina gelen ayrışmış hücre kültürleri yaygın olarak kendi yaşam 2-9, farklılaşma 10-12, neurite akıbet 13, ve daha fazlasını içeren fotoreseptör hücre biyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Ruben Adler ve işbirlikçileri tarafından 1980&#39;li yıllarda geliştirilen ve onun ve diğer gruplar 14-20 tarafından mükemmelleştirilmiş bu sistemin avantajları, bir hayvan modelinde 21 olarak civciv içsel özelliklerinin bulunması. Hatta embriyonik aşamada civciv gözün büyük boy, kültürlerin için malzeme büyük miktarlarda sağlar. Kültürler embriyonik gün (ED) 5 kullanılarak yapılır Dahası, - 6 retinalar, 55 - Bu hayvanda fotoreseptör yaklaşık% 86 olduğu için kendi progenitör hücrelerin% 80 Fotoreseptörlerin 14,15,18,22,23 olarak ayırt ve koniler 24, bu kültürler, bu hücre tipi ilgili çalışma için özellikle uygundur. Biz son zamanlarda develo varped ve böylece, genetik missexpression çalışmaları 1 kolaylaştırarak bu sistem kullanışlılığı genişletilmesi, bu kültürlerde hücre yüksek verimli plazmid transfeksiyon sağlayan basit bir teknik ile karakterize edilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, bir hücre bağımsız bir şekilde gen fonksiyonlarının araştırılmasında izin vermek için transfeksiyon kabul edilebilir bir düzeyde sağlayacak yöntemler bilimsel literatürde bir boşluk kaynaklanmıştır. Primer nöronal kültürlerin 25,26 transfect herkesin bildiği zor, çünkü bu bölümünde yer almaktadır. Bu amaç için daha önce mevcut olan en yaygın olarak kullanılan tekniklerin bazıları 3-5% sırasına verim neden olur ve ciddi yan etkilere 27-32 uygulayabilir gibi lipofeksiyon veya kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon gibi kimyasal nakil yöntemlerini, dahildir. Enzimatik muhabir sistemi ile Plazmidlerin kullanılması sinyalini yükselterek yoksul transfeksiyon verimlilik sorunu aşmak olsa bile, onlar değilHücre-spesifik etkileri ayırt ve bunların sonuçları bütünün temsilcisi olmayabilir küçük bir hücre popülasyonu dayanmaktadır. Civciv Yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, RCAS virüsü enfeksiyonu, çoğalan hücreler için geçerlidir, bu primer retina kültür sistemine 33 dolayısıyla uygun değildir. Mevcut protokolde civciv embriyosu gözler evre 27 (ED 5), retinal pigment epitel (RPE) çıkarılır ve retina kap bir plasmid ihtiva eden çözelti ile doldurulmuş bir elektroporasyon odasına yerleştirilen en çıkarılmış ve kullanılarak, elektroporasyon bakımından güçlü ölçüye standart teknikler kullanılarak retina ayrışması 21 ve kültür izledi elektrotlar. Bu prosedürü optimize sonra hayatta kalma ve farklılaşma özelliklerini ödün vermeden sürekli, kültür hücreleri ve yalnız fotoreseptör nüfus içinde% 25 toplam sayısının% 22 mertebesinde transfeksiyon verimliliği elde etmek mümkün olmuşturKültürler 1. Burada bu tekniğin başarı ve yeniden üretilebilirlik sağlamak için, bu prosedür tüm önemli adımları gösteren bir detaylı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Electro Square Porator</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0115 model 512</td><td>Gold tipped electrode used as anode</td></tr><tr><td>Polyimide Tubing</td><td>Vention Medical</td><td>custom made</td><td>Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode</td></tr><tr><td>2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>Used to make cathode electrode</td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>Serrated; Slight Curve; 4.5&quot; Length</td></tr><tr><td>Dumont tweezers 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td></tr><tr><td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75&quot; Length; 0.3 mm Tip Width</td></tr></tbody></table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

Embriyonik civciv retina elde edilen koni fotoreseptör zenginleştirilmiş kültürler retinal nöronların, özellikle fotoreseptör biyoloji okuyan dünyadaki araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kolayca ilaç gelişimi için yüksek verimli teknolojileri için adapte edilebilir, bu sistemin uygulamalar temel araştırma ötesine geçmektedir. Bununla birlikte, bu kültürlerde retina fotoreseptörlerinin genetik manipülasyon sisteminin yararlılığını önemli bir sınırlandırma getirmeden, çok zor olduğu kanıtlanmıştır. Biz son zamanlarda geliştirilen ve diğer mevcut protokoller 1 ile karşılaştırıldığında beş kat bu kültürlerde retina hücrelerinin transfeksiyon hızını artırır plazmid elektroporasyon tekniği ovo bir eski valide. Bu yöntemde, civciv embriyosu gözler RPE çıkarılır, evre 27 de enükle edilir ve retina kap bir plasmid ihtiva eden bir çözeltiye yerleştirilmiş ve kolaylıkla inşa alışılagelmiş kullanılarak elektroporasyonayapılan elektrotlar. Retinalar sonra ayrışmış ve kültürlü standart prosedürleri kullanıyor. Bu teknik genel olarak, fotoreseptör nüfusunun% 25 transgen ekspresyonunu elde plazmit odaklı RNAi teknolojisinde kullanımı ile, örneğin, fazla sentezlenme çalışmaları yanı sıra, gen ekspresyonunda azalma uygulanabilir. Mevcut yayın video formatı primer retina kültürlerde gen fonksiyonu çalışma sağlayan, alanında araştırmacılara bu teknoloji kolayca erişilebilir hale getirecektir. Biz de başarılı bir sonuç ve tekrarlanabilirlik için bu prosedürün kritik adımlar ayrıntılı açıklamalar dahil ettik.

Burada daha sonraki ayrışmış hücre kültürü için çıkartılmış civciv retina bardak içine plazmid transfeksiyon için basit bir protokol mevcut. Transfeksiyon özel elektrotlar (- 2 Şekil 1) hazırlanması kolaydır kullanılarak elektroporasyon ile elde edilmektedir. Bu protokol açıklanan parametreler% 20 ila 27 (Şekil 3D) (% 22 ortalama ile) aralığında transfeksiyon verimliliği elde etmek için optimize edilmiştir. Yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, bu sonuçlar, kültür içinde 4 gün sonra nicelendirilir, dikkat edin. Bu bağlamda, transfeksiyon verimi, toplam hücre popülasyonu içinde transgen eksprese eden hücrelerin yüzdesini ifade eder. Sadece fotoreseptör nüfus olarak kabul edilirse, transfeksiyon verimlilikleri% 25 ortalama (Şekil 3D) artırmak. Kültürlerin bu tür öncelikle fotoreseptörleri incelemek için kullanılır, çünkü bu önemli bir özelliktir. Electroporat edilmiş hücre kültürleri<html> Bu teknik kullanılarak ed DIC aydınlatma, hücre hayatta kalması özelliklerine ve bu visinin (yaygın olarak kullanılan bir fotoreseptör belirteci) ile Pax6 1 moleküler markerlerin ekspresyonu altında morfolojisi kendi olmayan elektropore muadilleri ayırt edilemez. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52002/52002fig1.jpg" /> Elektrotların 1. Making Şekil. (A - D) katot kare &#39;U&#39; şeklinde içine forseps ile ilk doğruldu bir kare kutu filamanın (A), (B) ve daha sonra eğildi üzerinden yapılır (C - D). Anot kalın altın elektrot (D) uçlu olduğu; Ucu açık. (E) Elektroporasyon kurulumu sadece 0.5 mm bırakarak, anot elektrot çevresinde yalıtım dikkat edin. Ankastre kutulu alanın daha büyütülmüş olarak göstermektedir.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52002/52002fig2.jpg" /> Elektroporasyon için Retina kupalarında Şekil 2. hazırlanması. RPE dikkatle keskin Dumont cımbız kullanarak enüklee gözlerinden kaldırılır Hamburger ve Hamilton embriyonik evre 27. (B) (A) Civciv embriyo. (C) sağdaki retina fincan RPE yoksun ve elektroporasyon için hazırdır. (D ) katot elektrotu plazmid çözeltisi ile doldurulmuş 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü kapağın yapılmış bir elektroporasyon odasının içine yerleştirilir. Retina fincan dikkatle yukarı bakacak katot aktarılır ve anot elektrot lens yanında, üstüne yerleştirilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52002/52002fig2large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız</a>bu rakamın. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52002/52002fig3.jpg" /> Sonra Kültürlenmiş Hücrelerde transgen ekspresyonu Şekil 3. Verim Elektroporasyon (A - C). Retina bardak ayrılmış ve 4 gün süre ile kültüre, bir GFP ifade plazmidi ile elektroporasyona tabi tutulmuştur. Floresans mikrografları DAPI lekeli çekirdekleri (A) ve GFP eksprese eden retina hücrelerini (B) göstermektedir. Anti-Visinin antikor boyama (C) fotoreseptör hücreleri tanımlamak için yapıldı. (D) Grafik toplam hücre popülasyonunun (pozitif DAPI), aralarında veya fotoreseptör arasındaki ifade eden hücreler GFP yüzdesi olarak ifade elektroporasyon ovo ex elde transfeksiyon verimi, gösteren Özellikle nüfus (Visinin pozitif). Sonuçlar 5 bağımsız deneyin ortalama ± SEM temsil eder. Ölçek çubuğu <stRong&gt; (C) 100 mikron temsil eder ve uygulanır (A - C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52002/52002fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach at JoVE.com

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

8.1K Görüntüleme.  The Johns Hopkins University School of Medicine.  Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır. 

Video: Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Nörobilim

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biyoloji

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler