Name: efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
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We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

Todos os procedimentos descritos neste trabalho foram realizadas de acordo com as orientações recomendadas pelo Animal Care e do Comitê Use da Universidade Johns Hopkins. 1. Ahead of Time: preparação de instrumentos, reagentes e pratos <ol><li> Preparação de Ovos: ovos de galinha fertilizados Incubar Leghorn branco a 37,5 ° C e 60% de humidade relativa durante 5 dias numa incubadora de ovos. NOTA: Uma incubadora com capacidade de balanço pode ser útil para padronizar e sincronizar o desenvolvimento embrionário, mas de balanço não é estritamente necessário para o resultado do presente protocolo. </li><li> O plasmídeo Preparação: <ol><li> Design O plasmídeo para construir a sobre-expressão ou infra-regulação de genes (por exemplo, através da utilização de tecnologia RNAi 1,34), conforme necessário. Incluir um gene repórter (por exemplo, EGFP, RFP ou LacZ) na construção, sempre que possível. Nota: Alguns promotores vulgarmente utilizados tais como CMV, pode tornar-se silenciado após o tempo. O promot CAGer (beta-actina de galinha com promotor de CMV) é uma boa alternativa, proporcionando a expressão eficiente a longo prazo do gene de interesse 35-37. </li><li> Prepara-se uma solução de plasmídeo a uma concentração de 1,5 mg / mL em PBS estéril. OPCIONAL: Preparar a solução de plasmídeo antes do tempo e armazená-lo congelado até que esteja pronto para uso. NOTA: Superior concentrações plasmídeo não resultar num aumento significativo da eficiência, enquanto que utilizando concentrações mais baixas de plasmídeo diminuir a eficiência de transfecção 1. </li></ol></li><li> Eletrodos: <ol><li> Para o uso ânodo uma grossa de ouro com ponta do eletrodo (ver Tabela de Específico materiais / equipamentos). Limpe com etanol 70%. NOTA: Isolamento do eléctrodo de ouro derrubado, deixando cerca de 0,5 mm expostos, é aconselhável minimizar o vazamento da corrente eléctrica. Informações para material isolante podem ser encontrados na tabela de materiais específicos. </li><li> Faça um cátodo de um 2,5 milímetros quadrados bfilamento boi, 4,5 mm de largura (normalmente usado em puxadores micropipeta). Com o auxílio de uma pinça, desfazer a caixa quadrada e endireitar filamento em uma longa faixa. Em seguida, sob microscópio de dissecção e utilizando uma régua como guia, dobrar o filamento em um quadrado &#39;U&#39; 3 mm de comprimento na base e 2 mm de altura num lado, com o outro lado do restante comprimento do filamento (Figura 1 , C - D). Utilizando uma pinça, mergulhe o arame em etanol a 96% e chama para esterilizar. Em seguida, anexar um condutor eléctrico com um pequeno jacaré para o braço mais comprido do eletrodo. </li></ol></li><li> Setup Eletroporação Câmara: <ol><li> Preparar a câmara de electroporação por corte da tampa de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e aposição, o lado plano para baixo, para uma placa de Petri de 100 mm utilizando uma fita (Figura 1E). NOTA: Outro recipiente sob a forma de um poço de tamanho semelhante funciona; No entanto, um tubo de microcentrífuga de tampa é facilmente acessível e autoclavável. O bemdeve ser o suficiente para abrigar um eletrodo pintinho olho e cátodo grande, mas não tão grande quanto a resultar em uma perda de solução de plasmídeo. </li></ol></li></ol> 2. Ex ovo Eletroporação Procedimento <ol><li> Preparação de instrumentos: <ol><li> Esterilizar ferramentas micro-dissecção (2 pares de grandes pinças Moloney curvas para abrir cascas de ovos e escavar para fora embriões, 2 pares de fine-ponta curvada pinças Dumont para a remoção de RPE, um par de Bonn dentada pinças para remoção da lente e vítreo) por imersão do dicas em etanol a 96% e flamejante. Escopo de dissecação limpa usando lenços mergulhados em etanol a 70%. Aquecer uma garrafa de Solução Salina Equilibrada de cálcio e de magnésio estéril livre de Hank (HBSS-CMF) em um banho de água a 37 ° C. Preencha 100 mm placas de Petri estéreis para 3/4 com warm-CMF HBSS. </li><li> Coloque câmara de eletroporação sob outro microscópio de dissecação limpa e encha com 120 ml de solução de plasmídeo. Conectar eléctrodos para electroporação aparelho, tornandoCertifique-se eletrodo feito sob medida está ligado ao pólo negativo e eletrodo de ouro derrubado ao pólo positivo. </li></ol></li><li> Colheita de embriões: <ol><li> Limpe os ovos, limpando conchas com toalhetes humedecidos em etanol a 70%. Manter procedimento estéril em todo o resto do protocolo para evitar contaminação levando para as culturas. Usando grandes pinças Moloney curvas abrir cuidadosamente um buraco na casca do ovo batendo suavemente na ponta arredondada de um ovo (através da câmara de ar) e, em seguida, agarrando e puxando pedaços de casca. </li><li> Com outro par de fórceps remover membranas e coletar embriões escavando-lo para fora do ovo (tomando cuidado para não danificar o embrião). Coloque-o em um prato com CMF-HBSS. NOTA: como coletar muitos embriões conforme necessário para obter o número desejado de copos da retina para eletroporação, conforme especificado no 2.4.4 </li><li> Passo crítico: Estágio os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton 38. NOTA: Para obter máxima eficiência embriõesdeve estar na fase 27 (Figura 2A). </li><li> Euthanize os embriões por decapitação usando uma pinça Moloney. </li></ol></li><li> Obtenção de Copas da retina: <ol><li> Com uma pinça Dumont finas, enuclear cuidadosamente os olhos e transferir para um novo CMF-HBSS prato. </li><li> A partir da parte posterior de cada olho, perto da cabeça do nervo óptico, e usando duas pinças Dumont finas, introduzir uma ponta de cada par de pinças entre a retina neural e RPE e dissecar cuidadosamente para fora do RPE sendo cauteloso para não danificar o neural retina (Figura 2B). NOTA: A falta de Ca 2+ e Mg 2+ na solução vai ajudar a separar EPR da retina neural mais facilmente. </li></ol></li><li> Eletroporação: <ol><li> Configurar os parâmetros de electroporador para entregar 5 pulsos quadrados de 15 Volts, 50 ms, duração e intervalo de 950 ms. Place &#39;U&#39; em forma eletrodo negativo interior da câmara de eletroporação (microcentrifuge tampa de enchimentoed com 120 ul de solução contendo plasmídeo-). </li><li> Usando uma pinça Dumont curvas transferir uma xícara de retina para a câmara de eletroporação (por escavar, não prensagem), e colocá-lo dentro do eletrodo em forma de &quot;U&quot;, com a parte posterior da retina para a parte inferior do eléctrodo e a lente virada para cima ( Figura 2D). </li><li> Coloque o ânodo de modo que toque a parte anterior do olho, próximo da lente, e usando o pedal do electroporador entregar os impulsos eléctricos. </li><li> Transferir electroporadas copo da retina para uma nova placa de Petri com CMF-HBSS e repete procedimento de electroporação com cada um dos restantes copos da retina. NOTA: Até 6 copos da retina pode ser electroporada com a mesma solução de plasmídeo sem uma diminuição significativa da eficiência da transfecção. </li><li> Retire a lente e corpo vítreo de cada copo de retina electroporated agarrando-os com uma pinça de Bona dentadas e puxando suavemente através de tele pupila abertura, mantendo o olho no lugar com a volta das pinças Dumont curvas. </li><li> Proceder à dissociação e cultura das células da retina electroporated seguintes procedimentos padrão. NOTA: Para obter um protocolo detalhado sobre a dissociação e cultura de células da retina pintinho referem-se a Vergara e Canto-Soler, 2012, arquivo adicionais 4 21 Neste protocolo, as células são semeadas a baixa densidade em placas de 6 poços revestidos por poliornitina ou 35. pratos -mm (6 x 10 5 células / 35 mm de diâmetro bem ou prato). O meio utilizado é o meio 199 com penicilina / glutamina, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), e ácido linoleico-BSA a 100 ng / ml. As culturas são mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Utilizando este procedimento, a 5 - 6 6 x 10 células podem ser obtidas tipicamente por cada fase 27 do olho electroporadas. NOTA: O ideal é não mais do que 3 horas devem passar entre colheita e chapeamento de celular, para garantir uma boa sobrevivência celulare minimizar o estresse. Um tempo típico para observação e análise posterior é após 4 dias em cultura, uma vez que neste momento as células têm alcançado boa diferenciação morfológica e molecular e sobrevivência ainda é alta. </li></ol></li></ol>

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	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells.">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

O passo mais crítico para o sucesso deste protocolo é a selecção do estágio apropriado dos embriões. Em publicações anteriores, uma série de estágios embrionários é dada para estas culturas, tipicamente, definida pelos dias de incubação ou embrionárias dias (ED); portanto, é geralmente assumido que a utilização de ED de 5 a 6 ED embriões irá produzir resultados equivalentes. No entanto verificou-se que na fase 27 (ED 5), a eficiência de transfecção será de cerca de 22% da população total de células, tal como indicado acima; Ainda eficiência diminuirá para 16% se estiver usando o estágio 28 embriões (ED 5.5), e para 12% na fase 29 (ED 6) 1. Outros passos críticos incluem a manutenção de condições estéreis por todo o processo; adquirir a destreza manual necessária para evitar danificar a retina durante a dissecção e eletroporação; e evitando aberturas de comprimento a partir do momento da colheita de embriões com o tempo de chapeamento celular. Outra consideração importante para garantir a boa efficien transfecçãocas é a concentração da solução que contém o plasmídeo: a recomendada de 1,5 mg / mL é a concentração mais baixa testada que nós que não resultou numa diminuição da eficiência. Isto traduz-se numa concentração elevada quantidade de material de plasmídeo quando se considera que os copos da retina são banhadas em solução que. Utilizando o menor tamanho bem que vai acomodar o olho (tal como um tubo de microcentrífuga de tampa) pode minimizar este problema. Além disso, vários olhos pode ser electroporadas utilizando a mesma solução; não temos visto uma redução na eficiência quando electroporating até 6 xícaras de retina consecutivamente na mesma solução plasmídeo, e mais poderia ser realizado, mas não podemos atestar a diferença na eficiência depois. Protocolos anteriormente publicados normalmente fornecida a baixa eficiência da transferência de genes para este tipo de cultura, e, portanto, eles muitas vezes que recorrem a técnicas que medem o produto de reacções enzimáticas em uma célula Lysate, a fim de aumentar a sensibilidade. Esta abordagem tem a desvantagem de não permitir a discriminação do tipo de célula e de depender de um número reduzido de células que são responsáveis ​​pelo resultado observado, o que nem sempre pode ser um reflexo do comportamento da população de células maior. Outra forma de contornar o problema da baixa eficiência é realizar a transfecção de genes in vivo, antes da enucleação dos olhos e da cultura. Esta é uma abordagem viável, mas geralmente pode ser aplicada apenas a paradigmas experimentais específicos, uma vez que ambos eletroporação plasmídeo e infecção pelo vírus RCAS (um gene vector de transdução comum no pintainho) normalmente precisam ser realizados em fases de desenvolvimento anteriores, a criação de um espaço de tempo entre a transfecção e cultura. Esta é uma consideração importante, pois durante esse tempo de latência, as células são expostas aos efeitos de ambos o microambiente extracelular, bem como factores intracelulares, que tem implicações significativas na interpretação da experimental resultados. Em contraste, o aumento substancial na eficiência da transferência de genes conseguido com a abordagem ex ovo electroporação permite o estudo da função de genes em células de modo intrínseco. Além disso, a vantagem de esta elevada taxa de transfecção pode ser aumentada quando utilizado em conjunto com a análise de alto rendimento de células automatizado 1. Nas fases iniciais do desenvolvimento desta técnica, mantivemos a electroporação copos olho RPE-desprovido em cultura durante 24 horas para avaliar a eficiência da electroporação conseguido com diferentes condições 1. Embora nós não tentar cultura los por longo período de tempo, a experiência indica que o protocolo aqui descrito também pode ser aplicado a estudos que dependem de explantes de retina organotípicas, fornecida a longo prazo condições de cultura de explantes adequados são usados. Finalmente, seria possível alargar a aplicabilidade do thé ex ovo abordagem eletroporação para outros modelos animais. Por exemplo, na nossa experiência de transfecção de olhos de ratinhos no dia pós-natal 1 ou 4, utilizando este protocolo produziu qualitativamente bons resultados em culturas de explantes, mas quando as culturas de células dissociadas foram tentadas a eficiência de transfecção foi da ordem de 6%, semelhante à de outras técnicas. Assim, esta poderia ser uma alternativa simples para outros protocolos para este modelo animal, mas terá de ser optimizada para o sistema em particular se forem necessárias eficiências elevadas. É de notar, como indicado acima, estágio embrionário no momento da electroporação foi fundamental para o resultado alta eficiência obtida no pintainho, de modo que este parâmetro deve ser cuidadosamente considerada quando se aplica a técnica a outros modelos. Em conclusão, a técnica de electroporação ex ovo possível alargar a aplicabilidade dos sistemas in vitro da retina como poderosas ferramentas para complementar os estudos in vivo, n oferecendoew possibilidades para a investigação da retina.

Culturas de células dissociadas de retinas de pintainho embrionário têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia celular de fotorreceptores, incluindo a sua sobrevivência 2-9, 10-12 diferenciação, crescimento de neuritos 13, e mais. As vantagens deste sistema, desenvolvido na década de 1980 por Ruben Adler e colaboradores e aperfeiçoados por suas e de outros grupos 14-20, residem nas características intrínsecas do pinto como um modelo animal 21. O grande tamanho do olho do pintainho, mesmo em estádios embrionários, fornece grandes quantidades de material para culturas. Além disso, quando as culturas são realizadas utilizando dia embrionário (ED) 5 - 6 retinas, 55 - 80% das suas células progenitoras diferenciam como fotorreceptores 14,15,18,22,23, e desde cerca de 86% dos fotorreceptores nesse animal são 24 cones, estas culturas são particularmente adequados para estudos que focalizam o tipo de célula. Temos recentemente desenPED e caracterizada uma técnica simples que permite um processo de alta eficiência de transfecção de plasmídeo das células nestas culturas, alargando assim a utilidade deste sistema, facilitando estudos missexpression genética 1. O desenvolvimento desta técnica resultou de um vazio na literatura científica de métodos que proporcionem um nível aceitável de transfecção para permitir o estudo da função dos genes de uma maneira autónoma da célula. Isto é em parte porque as culturas primárias neuronais são notoriamente difíceis de transfectar 25,26. Algumas das técnicas mais comumente usadas anteriormente disponíveis para o efeito métodos de transfecção incluiu químicos, tais como lipofecção ou cálcio transfecção mediada por fosfato, que resultam em eficácia na ordem de 3-5% e pode exercer toxicidade considerável 27-32. Embora a utilização de plasmídeos com um sistema de repórter enzimático pode contornar o problema da falta de eficiência de transfecção por amplificação do sinal, eles não fazemdiscriminar efeitos específicos de células, e os seus resultados são baseados em uma população de células pequenas que podem não ser representativas do conjunto. Outro método amplamente utilizado na pintinho, infecção por vírus RCAS, só é aplicável a células em proliferação e, portanto, não é adequado para este sistema de cultura de retina primário 33. No protocolo de corrente pintainho embrionário olhos são enucleados na fase 27 (ED 5), o epitélio pigmentado da retina (RPE) é removido, e o copo da retina é colocado numa câmara de electroporação preenchido com uma solução contendo o plasmídeo e electroporadas utilizando feito por encomenda eléctrodos, seguido pela dissociação da retina e de cultura usando técnicas convencionais. 21 Depois de optimizar este procedimento, temos sido capazes de conseguir de forma consistente eficiências de transfecção na ordem de 22% do número total de células em cultura e de 25% na população de fotorreceptores por si só, sem comprometer as características de sobrevivência e diferenciação de aculturas 1. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado descrevendo todas as etapas importantes deste processo, a fim de garantir o sucesso e reprodutibilidade desta técnica.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Electro Square Porator</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0115 model 512</td><td>Gold tipped electrode used as anode</td></tr><tr><td>Polyimide Tubing</td><td>Vention Medical</td><td>custom made</td><td>Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode</td></tr><tr><td>2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>Used to make cathode electrode</td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>Serrated; Slight Curve; 4.5&quot; Length</td></tr><tr><td>Dumont tweezers 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td></tr><tr><td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75&quot; Length; 0.3 mm Tip Width</td></tr></tbody></table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

As culturas enriquecidas com cone fotorreceptoras da retina derivadas de bico embrionárias tornaram-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores de todo o mundo que estudam a biologia dos neurônios da retina, particularmente fotorreceptores. As aplicações deste sistema excede investigação fundamental, uma vez que podem ser facilmente adaptados às tecnologias de elevado rendimento para o desenvolvimento de drogas. No entanto, a manipulação genética de fotorreceptores da retina nestas culturas tem provado ser muito desafiador, que levanta uma importante limitação para a utilidade do sistema. Temos recentemente desenvolvido e validado um ex ovo técnica de electroporação plasmídeo que aumenta a taxa de transfecção de células de retina nestas culturas por cinco vezes em comparação com outros protocolos actualmente disponíveis 1. Neste método pinto embrionário olhos são enucleados no estágio 27, o RPE é removido, ea taça da retina é colocado em uma solução contendo plasmídeo e electroporado usando custom- facilmente construídosfeitos eléctrodos. As retinas são então dissociados e cultivadas utilizando procedimentos padrão. Esta técnica pode ser aplicada a estudos sobre-expressão, bem como para a regulação negativa da expressão do gene, por exemplo, através da utilização de tecnologia RNAi-driven plasmídeo, geralmente atingir a expressão do transgene em 25% da população de fotorreceptores. O formato de vídeo da presente publicação irá tornar esta tecnologia de fácil acesso para os pesquisadores da área, permitindo o estudo da função dos genes em culturas de retina primários. Incluímos também explicações detalhadas sobre as etapas críticas de este procedimento para um resultado de sucesso e reprodutibilidade.

Aqui apresentamos um protocolo simples para o plasmídeo transfecção em copos de bico da retina enucleados para posterior cultura de células dissociadas. Transfecção é obtida por eletroporação usando fácil de fazer eletrodos personalizados (Figuras 1 - 2). Os parâmetros descritos neste protocolo foram otimizados para obter eficiências de transfecção que variam entre 20 e 27% (com uma média de 22%) (Figura 3D). Note-se que, pelas razões acima expostas, estes resultados são quantificados após 4 dias em cultura. Neste contexto, a eficiência de transfecção refere-se à percentagem de células que expressam o transgene dentro da população total de células. Se apenas a população de fotorreceptores é considerado, aumentar eficiências de transfecção para uma média de 25% (Figura 3D). Esta é uma característica importante uma vez que estes tipos de culturas são usadas principalmente para estudar fotorreceptores. As culturas de células que foram electroporat<html> Ed usando esta técnica são indistinguíveis dos seus homólogos não-electroporadas na sua morfologia, sob iluminação DIC, características de sobrevivência celular, e a expressão dos marcadores moleculares, tais como visinin (um marcador amplamente utilizado de fotorreceptores) e Pax6 1. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52002/52002fig1.jpg" /> Figura 1. Making of os eletrodos. (A - D) O cátodo é feito de um filamento caixa quadrada (A), que é esticado primeiro (B) e, em seguida dobrado com uma pinça em um quadrado &#39;U&#39; (C - D). O ânodo é uma grossa de ouro com ponta do eletrodo (D); Observe o isolamento ao redor do ânodo, deixando apenas 0,5 mm da ponta exposta. Configuração (E) Eletroporação. O encarte mostra maior ampliação da área de box.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52002/52002fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de Copas da retina para Eletroporação. (A) Pintinho do embrião no Hamburger e Hamilton fase embrionária 27. (B) O EPR é cuidadosamente removido dos olhos enucleados usando uma pinça Dumont afiadas. (C) A taça da retina à direita é desprovido de RPE e pronto para eletroporação. (D ) O eléctrodo de cátodo está posicionado dentro de uma câmara de electroporação feita de uma tampa de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo cheio com a solução de plasmídeo. A taça da retina é cuidadosamente transferido para o cátodo virado para cima, eo ânodo é colocado no topo, ao lado da lente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52002/52002fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior</a>desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52002/52002fig3.jpg" /> Figura 3. Eficiência de Expressão transgénica em células em cultura após a electroporação (A - C). Copos retinianas foram electroporadas com um plasmídeo de expressão de GFP, dissociados e cultivadas durante 4 dias. Micrografias de fluorescência mostram DAPI núcleos corados (A) e GFP expressando células da retina (B). Coloração com anticorpo anti-Visinin foi realizada para identificar as células fotorreceptoras (C). (D) gráfico que ilustra a eficiência de transfecção obtida por ex ovo electroporação, representada como a percentagem de GFP expressando células na população celular total (DAPI positivo), ou entre os fotorreceptores população em particular (Visinin positivo). Os resultados representam a média ± SEM de 5 experiências independentes. Barra de escala em <strong&gt; (C) representa 100 mm e se aplica a (A - C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52002/52002fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

8.1K visualizações.  The Johns Hopkins University School of Medicine.  Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema. 

Vídeo: Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Biologia do Desenvolvimento

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologia

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An

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