Name: a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

Koo BK ve Mustata RC Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) tarafından desteklenen Wellcome Trust ve Andersson-Rolf A Sir Henry Dale Bursu tarafından desteklenmektedir. Fink J Wellcome Trust 4 yıllık Doktora Programı tarafından desteklenmektedir.

Aşağıdaki protokole kullanılan farelerin belirli bir patojenden bağımsız koşullarda tutuldu ve tüm işlemler Birleşik Krallık Ofis düzenlemelerine uygun olarak yapıldı. 1. Hazırlık <ol><li> Kullanılmadan önce 1 saat süreyle ortam hazırlama en az 10 dakika kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma işlemi (Tablo 1 ve Malzeme Listesi daha fazla bilgi için bkz.) </li></ol> 2. Kültürleme Küçük Bağırsak (SI) Organoids NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm inkübasyonlar nemli bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile gerçekleştirilir. Canlı hücreler ile temas eden aletler ve tepkime maddeleri steril olması gerekmektedir. Ön ısınma o bodrum matris (Matrıgel veya BME) Yayımlarken dışarı yayılmasını engeller damla gibi doku kültürü plaka önemlidir. Ayrıca, taban matris her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. -20 ° C ve çözülme Mağazasıkullanımdan önce buz üzerinde. <ol><li> Kriptler Yalıtımlı <ol><li> Ince bağırsak izolasyonu için daha sonra, ulusal kurallar ve düzenlemelere göre fare kurban sırtında hayvan koyun ve% 70 etanol ile karın yıkayın. Sternum kasıktan bir uzunlamasına orta hat kesi gerçekleştirin. İlk olarak, deri ve deri altı doku daha sonra kesilir. Mideye çekumdan ince bağırsağı çıkarın. Duodenum, jejunum ve ileumdan izole kript organoid kültürü için de kullanılabilir. </li><li> Kalsiyum ya da magnezyum (PBS0) olmaksızın önceden soğutulmuş fosfat tamponlu serum fizyolojik ile, izole edilen ince bağırsağı yıkayın. </li><li> 3-5 cm uzunluğunda parçalar halinde doku kesmek ve uzunlamasına açık kesmek için makas kullanın. Forseps kullanarak doku yayıldı. </li><li> Lamel kullanarak villus kazımak. Dikkat, çok fazla kuvvet gözyaşı doku neden olur ve aşağıdaki adımları izleyerek kriptalarının verimini azaltacaktır. </li><li> Önceden soğutulmuş bir PBS0 usin içeren 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer dokug forseps. Kuvvetli çalkalama ile doku parçaları yıkayıp PBS0 değiştirin. 2-3 x tekrarlayın veya PBS0 az bulutlu dönene kadar. </li><li> Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile PBS0 30 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde doku inkübe edin. </li><li> Kuvvetlice çalkalanır tüp ve 5 mM EDTA ile PBS0 30 ml ihtiva eden bir 50 ml tüp doku aktarın. (Daha önce doku ihtiva etmektedir), 1 mM EDTA çözeltisi ve kript villi bir karışımını içerecektir. Genellikle villi yüksek bir oranda içerir, Bu fraksiyon organoids bir tohumlama için uygun değildir. </li><li> Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca doku daha inkübe edin. </li><li> Kuvvetlice tüp sarsıntı ve temiz bir 50 ml tüp içinde çözeltisinin toplanması. Kript varlığını doğrulamak ve ışık mikroskopisi ile 50 ul crypts sayarak, örneğin sayısını tahmin ediyoruz. 50-100 kriptaları almak ve 1.5 ml t aktarmak için gerekli hacmi hesaplayınube. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. , Supernatant Önceden ısıtılmış, 24 oyuklu bir plaka içerisinde temel matrisin 50 ul pelet ve tohum yeniden süspanse edin. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. </li><li> 500 ul ENR ortamı ile Yerleşimi (bakınız Tablo 1). Küçük, yuvarlak bir şekil gösterir kistik organoids tohumlama sonra filizlenen ve yapıları 2-3 gün sonra yaklaşık 24 saat görünür hale gelir. Her 3 günde bir, taze ENR medya değiştirin. </li><li> Geçiş 7 günde kültürler organoid. </li></ol></li><li> Pasajlanması ve bakımı Organoids <ol><li> Her 3 gün ve geçiş 1 medyayı tazeleyerek organoids koruyun: lümen ölü hücreler, yaklaşık her 7 gün ile dolu olur 5: 3 veya 1. </li><li> 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp kuyudan aktarın. </li><li> Mekanik pipetleme ile a organoids ayırmakpproximately 50x cezası (örneğin, 200 ul) ucu kullanarak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. </li><li> Süpernatantı atın ve bodrum matris 150-250 ul pelletini. Bir tohum 24-kaynaklı plaka (/ oyuk taban matris 50 ul) önceden ısıtılmış. Kaplamak için bir kez bodrum matris yukarı ve aşağı ucunun duvar pipet ekim önce. Pipet yavaşça yayılmasını önlemek için matris temel kuyunun orta kabarcıkları ve tohum önlemek için. Bu iyi merkezinde taban kalıbının bir kubbe almak için arzu edilir. </li><li> Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. Kuyu başına 500 ul ENR medya ile Yerleşimi. </li></ol></li></ol> 3. Ön enfeksiyon SI Organoids Tedavisi NOT: Şekil 1, iletim prosedürü görüntülemektedir. <ol><li> ENRWntNic Exchange, ENR ortamı (Tablo 1 e bakınız) ve t organoids büyür3 gün veya bir kistik morfoloji kabul kadar en az onun orta. Nikotinamid (Nic) kültür etkinliğini iyileştirir Wnt3a kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırır. </li></ol> 4. Virüs Üretimi <ol><li> Platin-E hücreleri bir 150 mm tabak başına enfeksiyona gereklidir. Tohum yaklaşık puromycin (1 ug / ml) ve blasticidin (10 ug / ml) varlığında, 15-18 ml&#39;lik ortam (DMEM +% 10 FBS) ile 5 x 10 6 hücre. Bunlar% 70-80 ulaştığı zaman, 2-3 gün sonra hücrelerin transfekte. Puromisin olmayan ve de transfeksiyon önce blastisidin, DEM +% 10 FBS ile orta değiştirin. </li><li> Opti-MEM 1 ml içeren tüpler ayırmak için polietilenimin (PEI) retroviral DNA yapısının, 30 ug ve 240 ul ilave edin. Karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Iki çözeltinin havuzu ve 20-30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. Platin-E hücrelerinin ortamına tam karışımı ilave edilip dikkatle plat sallamake DNA PEI komplekslerinin eşit dağılımını sağlamak için. </li><li> Gece boyunca transfeksiyon karışımı ile platin-E hücreleri inkübe ve ortam ertesi gün yenileyin. 2 gün boyunca, yeni bir ortam içinde hücrelerin tutun. </li><li> , 50 ml&#39;lik bir Falcon tüpüne sadece orta toplamak 12-16 saat boyunca 4 ° C&#39;de 8000 x g&#39;de, bir 0.45 um filtre ve santrifüj geçirin. Süpernatantı atın ve İletimi orta 250 ul pelet (bakınız Tablo 1). </li></ol> 5. organoid Fragman hazırlanması <ol><li> Bir enfeksiyonu için bir 24 oyuklu plaka bir de gereklidir. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp aktarın. </li><li> Ince bir ses ipucu (örneğin, 200 ul ipuçları) pipetle (30-50x) aracılığıyla organoids mekanik bozmaya kullanın. Çözelti bulanık hale ve herhangi bir tam organoids görünür olmalıdır. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje, 900 x g<html> . </li><li> Süpernatantı atın ve hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz (örneğin, TrypLE) 500 ul pelletini. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. İnkübasyondan sonra fragmanının başına hücre sayısının sayılması, ışık mikroskopisi kullanılarak organoid fragmanlarının boyutunu kontrol edin. 5-10 hücreleri içeren fragmanlar idealdir. Parçalarının çoğunluğu hücrelerinin daha yüksek bir sayı içeriyorsa inkübasyon süresi, aynı anda 2 dakika süre ile arttırılabilir. </li><li> ENR ortamının 500 ul ekleyerek ayrışma süreci sonlandırmak. </li><li> Oda sıcaklığında santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g. Süpernatantı ve buz ya da 4 ° C pelet tutmak. </li></ol> 6. retroviral İletimi <ol><li> Bir 48-yuvalı plakanın bir çukuruna (bölüm 4.5 &#39;dan itibaren) retroviral çözeltisi 250 ul organoid parçaları birleştirin. 1 ml pipetman ucu kullanarak yavaş pipetle hafifçe karıştırın. </li><li> Parafilm plaka mühür. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation ve Kaplama <ol><li> 1 saat boyunca, 32 ° C, 600 x g&#39;de santrifüje plaka. Parafilm dikkatlice çıkarın ve 6 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. </li></ol> Enfekte organoid Fragments 8. Tohumculuk <ol><li> 5 dakika boyunca 900 xg&#39;de 1.5 ml tüp, ve spin kuyudan enfekte organoid fragmanlarını ve iletim ortamı aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve serin 5 dakika buz üzerinde pelet içeren tüp koymak. Bodrum matris 100 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme pelletini. </li><li> Yeni 24-oyuklu bir plaka içerisinde 50 uL &#39;karışımı cell temel matris &quot;Tohum düşer. Matris taban katılaşıncaya kadar 5-15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Oyuklara polibren olmayan iletim ortamı ilave edin ve bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edin. 2-3 gün medya değiştirin. </li></ol> 9. Seçim <ol><li> Başlangıç ​​seortama puromisin (1 ug / ml) ilave edilerek 2-3 gün sonra lection. </li><li> Fragmanlar oluşturan organoids puromycin (1 mcg / ml) ile desteklenmiş, ENR medya ile İletimi ortamı değiştirmek için ne zaman başlıyor. </li></ol> 10. post-enfeksiyon SI Organoids Tedavisi <ol><li> Kültür göre, &quot;Pasajlanması ve organoids muhafaza&quot; protokolü (bölüm 2.2.1) organoids transdük. 1-2 hafta sonra SI organoids yeni kurdukları yapıları geri kazanacak. </li><li> 1 uM&#39;lik bir konsantrasyonda çalışma 4-OH (4-OHT) eklenerek miRNA ya da DNA ekspresyonunu tomurcuklanan yapıların görünüşünü ardından. Bu aşama Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) ve ikinci pMSCV, retroviral vektörler kullanılarak halinde geçerli olduğuna dikkat ediniz -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) ve kre-ERT2 ifade organoids. </li></ol> Enfeksiyon ve Expr 11. Onayıİlgi geninin salgılamanın ardından / bastırılması <ol><li> Addgene (32702, 32703 ve 32704) için, retroviral vektörler kullanılarak Eğer iletim verimliliği DsRed ifade gözlemi ile teyid edilebilir. Koo ve arkadaşlarına 4 de örneklendiği gibi Buna ilaveten, ilgi konusu genin ifade veya bastırılması, GFP veya (gen demonte için) 3xHA (gen aşırı ifadesi için) epitopu ve QPCR kullanılarak, Western Blot ile teyit edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Yüksek transdüksiyon verimi bazı yönleri kritik ulaşmak. Bir yuvarlak Kistik şeklinin benimsenmesi kadar bir ENRWntNic ortamı ile organoids öncesi bir tedavi yöntemidir. Bu kök hücrelerin sayısını ve transgenin kararlı entegrasyonu elde edilmesi, hem de transdüksiyon işlem boyunca SI organoids hayatta kalma oranının artması, dolayısıyla da olasılığını artırır. Diğer bir parametre spinoculation izleyen inkübasyon zamanı. Sırasıyla yoksul iletim verimliliği ve organoids kötü sağkalım, çok kısa veya çok uzun kuluçka sonuçları. Önemli ölçüde transduse organoids yüzdesini arttırdığı halde spinoculation aşaması esas teşkil etmemektedir. Son olarak, yüksek-titreli bir virüs başarılı iletimi için anahtardır. Bu paketleme hücre hattı ve virüs tipine bağlıdır. Platin-D hücre hattı ve murin stem hücre virüsü (MSCV) kombinasyonu, organoids transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titreye ürettiği bulundu. ve_content &quot;&gt; Aşağıda başarılı iletimini elde etmek için yardımcı olabilir giderme için ipuçları. paketleme hücre hattının transfeksiyon düşük olup olmadığına, hücrelerin% 70-80 konflüansa ile kuluçkalama süresi bu olduğundan emin olmak Havuza alınan PEİ-DNA karışımı, 20-30 dakika arasındadır. iletimi aşamasında organoids hayatta kalması oldukça parçası boyutuna bağlıdır. çok uzun tripsinizasyon az 3 hücrelerinin oluştuğu parçalarının çoğunluğu neden olmakta ve böylece organoid hayatta kalma azaltır. bir başka etmen Wnt kıvamlandırılmış ortam aktivitesi, etkinliği çok düşük hayatta kalma oranları için 5 uM konsantrasyonda bir çalışma CHIR99021 ilavesi yoluyla da artırılması ise. CHIR99021 artmış Wnt sinyal ile sonuçlanır GSK3 inhibe eder. Ayrıca, Y&#39;nin-27362, burada önler organoids önce iletimine parçaları (1-10 hücresi içeren) için bozulur çünkü anoikis, organoid hayatta kalma artırmak için transdüksiyon ortama ilave edilir. gibi60, yukarıda belirtildiği gibi, spinoculation sonraki kuluçka süresi 6 saat geçmemelidir. Kötü iletim gözlenmesi halinde Son olarak, viral titresi ve retroviral vektör için ek parçanın boyut sınırını etkileyen belirtilen faktör dikkate alınmalıdır. Nakavt etkinliği miRNA son derece bağlıdır. Verimi, hedef gen ve miRNA kombinasyonu ile değiştiğinden dolayı, en iyi işlev yapanlardan belirlemek için bir ekran verim performans değerdir. Bu teknik alan organoid sisteminin epitel fenomeni ile sınırlandırılmıştır. Gelecekte sırasıyla, bağışıklık sistemi kaynaklı bileşenleri olan patojenlere ya da yeniden kurma ko-kültür ile enfeksiyon ya da bağışıklık aracılı hastalıklar çalışma mümkün olabilir. Ayrıca, retrovirüsler sadece nispeten küçük bir boyutta insertleri taşıyabilir. Sonuç olarak, doğal olarak ortaya çıkan düzenleyici bölgeleri hariç tutulması ve dolayısıyla transgen sentezleme bu taklit edilemezendojen gen. Yukarıda zikredildiği gibi, portatif verimi, hedef geni ve miRNA bağlıdır. Uygun Knockdown verimlilik ile hiçbir MiRNA bulunabilir Eğer o belirli hedef geni için tekniğin kullanımını sınırlayabilir. Teorik olarak, organoids hücre çizgileri için kullanılan tüm standart manipülasyonu teknikleri ile uyumludur. Retroviral transdüksiyon 4 rapor edilecek ilk yöntem oldu ve son zamanlarda BAC (bakteriyel yapay kromozom) -transgenesis 5 kullanılabilir hale gelmiştir. 2-3 haftalık bir toplam üretim süresi ile, paketleme hücre hattı viral plazmid transfeksiyonundan sonra, bir transgenik (TG) fare üretimi önemli ölçüde daha hızlıdır. Kök hücrelerin yanı sıra bağırsak epiteli tüm farklılaşmış hücre soyları içeren iken, in vivo crypt-villus mimarisini koruyarak, organoid kültür sistemi tg hayvan ve önceden kullanılan hücre kültürü arasındaki köprüdür. <psınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada açıklanan protokol, bir gain- yoluyla in vitro endodermal epitel fenotipik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem ve fonksiyon testleri kaybı: içerir. Bu tg farelerde asgari ihtiyacı olan, yetişkin kök hücre biyolojisi fizyolojik ilgili soruları mümkün olur. Örneğin, koşullu nakavt farelerinin kuşak perinatal öldürücülüğü 6, yeni doğan mutantlardan türetilen organoids kullanılarak önlenebilir. Buna ek olarak, teknik, ilave, yok etme 7,8 gerçekleştirerek paralogues rolünü incelemek için, daha önce belirlenmiş knockout farelerden türetilen organoids uygulanabilir. Ince bağırsak organoids kurulmasından sonra, orijinal kültür protokol adaptasyon pankreas, karaciğer, kolon ve mide epiteliyalarının 9-11 kültürlenmesini izin verdi. Bundan başka, insan bağırsak organoids ve tümör organoids primer Aden, normal insan biyopsilerinden elde edilmiştiroma ve kolorektal kanser 10 biyopsisi. Viral enfeksiyon protokolü kolay organoids bu tür genişletilmiş ve insan kaynaklı dokularda fonksiyonel çalışmalar yapmak görülmemiş bir yol sağlar. Birlikte ele alındığında, küçük bağırsak organoids retroviral transdüksiyon kök hücre bakım, farklılaşma ve hücre kader kararı, yanı sıra hücre sinyalizasyon ve hücre-hücre etkileşimleri araştırmak için değerli bir kaynaktır.

Yüksek verim fonksiyonel genetik mevcut temel bilimleri ve tıp artırmak için, vücudun biyolojik anlayışı artırmak için gereklidir. Fare genetiği zaman alıcı ve masraflı hem de olmasına rağmen, in vivo gen fonksiyonlarını araştırmak için altın standart olmuştur. Daha az pahalı olmak için diğer yaygın bir seçim olan hücre çizgileri, daha yüksek bir randıman kapasitesine sahiptir. Ancak, in vivo olarak görülen uygun mikroçevresinin ve böylece fizyolojik cevapları yeniden kendi yetersizlik tarafından aksýyor. Dolayısıyla, maliyet / zaman verimli, yüksek verim analizi süre verir kolay bir-kolu model sistemi için kesin bir ihtiyaç vardır in vivo olarak transgenik (TG) fare deneylerde tespit edilen ve fizyolojik yanıtlar taklit edebilir. Endodermal epiteli böyle bir model sistem 2009 1 çıktı. Bilgisi Lgr5-pozitif bağırsak kök hücrelerin keşfinden elde Arasında edildikök hücre bakımı için gerekli ekstra-hücresel matris ve büyüme faktörlerine tekabül niş hakkında bilgi. O da organoids 2 olarak bilinen &#39;mini cesareti&#39; kurmak mümkün oldu bu bilgiyi kullanmak. En son organoids &#39;enteroids &quot;olarak adlandırılmaktadır, in vitro kültürler, için bir fikir birliği adlandırma 3 önerilmiştir. Hücre hatları gibi, organoids sürekli genişleyen ve ligandlar ve inhibitörlerle tedavi etmek kolaydır. Ancak, bunun yerine iki boyutlu olmanın üç-boyutlu kendi kendini düzenleyen crypt-villus düzenini korur yapılarının yanı sıra kök hücreler ve küçük bağırsak (SI) farklılaşmış hücre soyları vardır. Organoids bir lümen alanını çevreleyen epitel hücreleri, tek bir yüzeyden oluşmaktadır. Çıkıntılı tomurcuklanan yapılar kök hücre bölmesini içeren ince bağırsak crypts gelmektedir. Bunlar, akut MI ile tomurcuklanan yapının ucundan başlayarak projenitör hücrelerinin farklılaşmasınaterminal açıdan farklılaşmış hücreleri, lümenin içine dökülür epitelial doğru rendelenir. Hücre hatlarına kıyasla bu ex vivo olarak daha yakından sistem normal fizyolojisi tekrarlar ve bu nedenle, ince bağırsak epiteli için umut verici bir model sistem. Retroviral transdüksiyon Bu video protokolü, biz bu yeni organoid kültür sistemi ex vivo gen fonksiyon çalışmalarını sağlayan bir yöntem mevcut. Bu adım-adım bir şekilde tarif kültür organoid ile başlar ve transdüksiyon prosedürü takip retrovirüslerin üretimi gösteren devam edin. Son olarak, sorun giderme için ek tavsiye için bir bölüm vardır. Bu tekniğin bir avantajı, bağırsak epitel homeostazı, hücre hayati kararlan ve hücre-hücre etkileşimini incelemek canlı görüntüleme ve ilaç taraması ile birleştirilebilir olmasıdır. Nedeniyle, basit mimarisi ve hızlı ciro oranı, organoids ideal bir model s temsilyetişkin kök hücre biyolojisi çalışmaları için istem. Buna ek olarak Retroviral transdüksiyon, önceden belirlenmiş bir transgenik farelerin yanı sıra insan hasta örneklerinden türetilmiş organoids uygulanabilir. In-knock knock-out yaklaşımlar insanlara uzatılamaz gibi, insan SI organoids cazip bir alternatif oluşturmaktadır. Özetle, retrovirütik iletimi yoluyla gen manipülasyonu insan kaynaklı dokularında çalışmalar için yeni yollar açarken, böylece fare genetiğini ve tamamlayıcı hücre soyları, fare ya da insan doku örnekleri türetilmiş küçük bağırsak organoids fenotipik analiz sağlar. Retroviral transdüksiyon, gain- sağlar ve zarar fonksiyon-çalışmaları organoid 4 kültür sistemi içinde gerçekleştirilmelidir. Bu üç Rs (azaltma, arıtma, ve yedek) uyarınca olurken gen işlevi, yetişkin kök hücre biyolojisi ve hastalığı araştırmak için değerli bir kaynak haline getirmektedir.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylcysteine 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse EGF 500 &amp;micro;g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &amp;micro;g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin conditioned medium</td><td></td><td></td><td>The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Wnt conditioned medium</td><td></td><td></td><td>The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &amp;micro;M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (8 &amp;micro;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02)&lt;br/&gt; supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E cells</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-pozitif kök hücreler gerekli büyüme ile takviye edilebilir EGF Noggin, kültür ve in vitro birincil 3D epitel yapıları sürekli genişleyen için bize izin verir R-Spondin, faktörleri. Hem de organoids denilen bu &#39;mini cesaret&#39;, mimarisi ve fizyolojik özellikleri, yakından in vivo çok benzeyen. Bu onları küçük bağırsak epiteli için cazip bir model sistem yapar. Retroviral transdüksiyon ile fonksiyonel genetik hemen koşullu gen aşırı ifadesi ya da devirme ile gerçekleştirilebilir. Bu video organoid kültür prosedürü, retrovirüslerin üretimi ve in vitro olarak küçük bağırsak epiteli fenotipik analizi yardımcı olmak için organoids retroviral iletimini göstermektedir. Retroviral aracılı gen ekspresyonu ile kombinasyon halinde bu yeni Organotipik model sistemi costl gerek olmadan, in vitro olarak gen fonksiyonunun hızlı analiz için değerli bir araç sağlarTransjenik hayvanlar için, y ve zaman alıcı üretimi.

Organoids merkezi lümen bağlı olarak ölü hücreleri (Şekil 2) varlığı karanlık bölme zaman hazırdır. Tedavi öncesi organoids 2-3 gün sonra bir yuvarlak kistik morfoloji (Şekil 3) benimsemelidir. Bu stabil entegrasyonunu elde şansını arttıran kök hücrelerin sayısını artırır. Viral pelet boyutu nedeniyle topak boyutuna hücre artıkları arasında değişen katkısı, viral süpernatanın santrifüjleme ile en muhtemel değişebilir. Transdüksiyon verimliliği net bir korelasyon gözlenmiştir. Olanlar istikrarlı bir entegrasyon kalacaktır yerken seçim prosedürü sırasında sigara transdüksiyonlu organoids, ölecek. MSCV-EGFP retrovirüslerden floresan proteini (Şekil 4) transdüksiyonu takip eden 2-3 gün içinde kistik morfolojiye sahip kalan organoids gelen bu hücrelerde görülmektedir. <img alt<html> = &quot;Şekil 1&quot; fo: İçerik-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Şekil 1. retroviral transdüksiyon işlemin şematik bir çizimi. Önceki enfeksiyon organoids için önceden muamele edilmiş bir kistik yapı (aşama 1) ile uyum sağlayıncaya kadar ENRWntNic bulunmaktadır. Platin-E, hücreler paketleme hücre hattı olarak kullanılan, ve% 70-80 gelinceye kadar büyütülür. Bundan sonra, PEI ile retroviral yapı ile transfekte edilir. Virüsler 2 gün sonra (aşama 2) hasat edilmiştir. Organoids 1-10 hücreleri (aşama 3) ihtiva eden fragmanlar elde etmek, tripsinize edilir, ve daha sonra (adım 4) enfekte edilir. Kararlı bütünleşmesi (adım 7) yapılabilir ile spinoculation takiben enfeksiyon verimliliği (adım 5) artırmak için, enfekte organoid fragmanlar pozitif klonlar için (adım 6) ve 2-3 gün sonra seçim ekilir. 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil kültür 4-6 gün sonra organoids 2. Temsilcisi görüntü. Lümen, ölü hücreleri ile dolu karanlık görünür yapıyor. Bu aşamada Organoids geçişli hazırdır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> 3-4 gün boyunca ENRWntNic medyada kültüre ince bağırsak organoids Şekil 3. Temsilcisi görüntü. Organoids kistik morfoloji benimsenmesi. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Ince bağırsak organoids Şekil 4. Temsilcisi görüntüsü (a) viral transgen ifade (b eGFP) gösteriyor ki. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaAdvanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotikler 100x </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 mL </td></tr><tr><td> B27 takviyesi (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (500 mM) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> fare EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin, fare (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R Spondin conditbahsettiğimiz orta </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td> Wnt3a koşullandırılmış ortam </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> Nikotinamid (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transdüksiyon ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Taze hazırlayın </td></tr><tr><td> ENRWntNic orta </td><td> 20 mi </td></tr><tr><td> -Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polibren (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 mi </td></tr><tr><td> B27 takviyesi (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (500 mM) </td><td> 50 ul </td&gt; </tr><tr><td> fare EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin, fare (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R Spondin koşullu ortam </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td colspan="2"> Platin-E hücreleri için ortamı (500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 12 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 mi </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> 50 mi </td></tr><tr><td> Puromisin (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blastisidin (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Platin-E hücreleri için Gelişmiş DMEM / F12 +++, ENRWntNic orta, Transdüksiyon orta, ENR orta ve orta Tablo 1. Medya bileşimi.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar model sistem.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Görüntüleme.  University of Cambridge.  Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar model sistem. 

Video: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Tıp

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Gelişim Biyolojisi

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Nörobilim

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an in vitro culture system that recapitulates the conditions in the host is needed. Organoids, which closely resemble the tissues of their origin, are ideal for studying host-parasite interactions. Organoids are three-dimensional (3D) tissue-derived structures which are derived from adult stem cells and grow in culture for extended periods of time without undergoing any genetic aberration or transformation. They have well defined polarity with both apical and basolateral surfaces. Organoids have various applications in drug testing, bio banking, and disease modeling and host-microbe interaction studies. Here we present a step-by-step protocol of how to prepare the oocysts and sporozoites of Cryptosporidium for infecting human intestinal and airway organoids. We then demonstrate how microinjection can be used to inject the microbes into the organoid lumen. There are three major methods by which organoids can be used for host-microbe interaction studies&#8212;microinjection, mechanical shearing and plating, and by making monolayers. Microinjection enables maintenance of the 3D structure and allows for precise control of parasite volumes and direct apical side contact for the microbes. We provide details for optimal growth of organoids for either imaging or oocyst production. Finally, we also demonstrate how the newly generated oocysts can be isolated from the organoid for further downstream processing and analysis.

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

We describe protocols to prepare oocysts and purify sporozoites for studying infection of human intestinal and airway organoids by Cryptosporidium parvum. We demonstrate the procedures for microinjection of parasites into the intestinal organoid lumen and immunostaining of organoids. Finally, we describe the isolation of generated oocysts from the organoids.

Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived from all sections of the GI tract (gastric, jejunum, duodenum, ileum, colon, rectum) and, upon differentiation, contain most of the cell types that are naturally found in each individual section. For example, intestinal organoids contain nutrient-absorbing enterocytes, secretory cells (Goblet, Paneth, and enteroendocrine), stem cells, as well as all lineage-specific differentiation intermediates (e.g.,&#160;early or immature cell types). The greatest advantage in using gastrointestinal tract-derived organoids to study infectious diseases is the possibility of precisely identifying which cell type is targeted by the enteric pathogen and to address whether the different sections of the gastrointestinal tract and their specific cell types similarly respond to pathogen challenges. Over the past years, gastrointestinal models, as well as organoids from other tissues, have been employed to study viral tropism and the mechanisms of pathogenesis. However, utilizing all the advantages of using organoids when employing highly pathogenic viruses represents a technical challenge and requires strict biosafety considerations. Additionally, as organoids are often grown in three dimensions, the basolateral side of the cells is facing the outside of the organoid while their apical side is facing the inside (lumen) of the organoids. This organization poses a challenge for enteric pathogens as many enteric infections initiate from the apical/luminal side of the cells following ingestion. The following manuscript will provide a comprehensive protocol to prepare human intestinal organoids for infection with enteric pathogens by considering the infection side (apical vs. basolateral) to perform single-cell RNA sequencing to characterize cell-type-specific host/pathogen interactions. This method details the preparation of the organoids as well as the considerations needed to perform this work under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions.

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 BSL-3 Conditions

This protocol describes how to infect human intestinal organoids from either their apical or basolateral side to characterize host/pathogen interactions at the single-cell level using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology.

Gastrointestinal Organoidlerin Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) Koşullarında Patojen Enfeksiyonu ve Tek Hücre dizilimi için uyarlandırılması

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Virüsle Enfekte İnsan Bağırsağı Organoid Tek Tabakalarının Kalsiyum Görüntülemesi

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Yazar Spotlight: Bağırsak Epitel Sinyalizasyonunun Viral Bozulmasının Araştırılması – Araştırma Öngörüleri ve Gelecekteki Yönergeler 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması

Gastrointestinal Organoidlerin Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) Koşullarında Patojen Enfeksiyonu ve Tek Hücre dizilimi için uyarlandırılması

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi