The authors do not have competing financial interests to disclose.

<ol>
	<li>Boeckle, S., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+targeted+gene+delivery:+chemical+modification+of+viral+vectors+and+synthesis+of+artificial+virus+vector+systems.">Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems.</a> AAPS J. 8, E731-E742 (2006).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).</li><li>Bangari, D. S., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+and+future+directions+for+eluding+adenoviral+vector+immunity.">Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity.</a> Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).</li><li>Barry, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+therapeutic+viruses.">Systemic delivery of therapeutic viruses.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).</li><li>De Laporte, L., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrices+and+scaffolds+for+DNA+delivery+in+tissue+engineering.">Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).</li><li>Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-elastin-like+hydrogel+improves+the+safety+of+adenovirus-mediated+gene-directed+enzyme-prodrug+therapy.">Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy.</a> Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).</li><li>Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+hydrogels+for+lentiviral+gene+delivery+in+vitro+and+in+vivo.">Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo.</a> J Control Release. 157, 80-85 (2012).</li><li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+active+DNA/cationic+polymer+polyplexes+into+hydrogel+scaffolds.">Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).</li><li>Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+and+fibrin+hydrogels+with+concentrated+DNA/PEI+polyplexes+for+local+gene+delivery.">Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery.</a> J Control Release. 153, 255-261 (2011).</li><li>Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+biomaterial+systems+to+enhance+viral+vector+gene+delivery.">Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery.</a> Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).</li><li>Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+surface+immobilization+of+plasmid+to+tissue-engineering+scaffolds.">Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds.</a> Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).</li><li>Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advance Data. 191, (1991).</li><li>Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+from+biomaterials+and+implants:+a+race+for+the+surface).">Infections from biomaterials and implants: a race for the surface).</a> Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).</li><li>Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+biodegradation+of+polyurethanes:+from+classical+implants+to+tissue+engineering+materials.">Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials.</a> Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).</li><li>Tang, L., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+responses+to+biomaterials.">Inflammatory responses to biomaterials.</a> Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).</li><li>Zimmerli, W., Sendi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+implant-associated+infection:+the+role+of+the+host.">Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host.</a> Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).</li><li>Levy, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+adenovirus+gene+delivery+using+antiviral+IgG+complexation.">Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation.</a> Gene Ther. 8, 659-667 (2001).</li><li>Ma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchoring+of+self-assembled+plasmid+DNA/anti-DNA+antibody/cationic+lipid+micelles+on+bisphosphonate-modified+stent+for+cardiovascular+gene+delivery.">Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery.</a> Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).</li><li>Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+adenovirus+immobilization+strategies+for+in+situ+gene+therapy.">Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy.</a> J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).</li><li>Jang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+immobilization+of+hexa-histidine-tagged+adeno-associated+viral+vectors+for+localized+gene+delivery.">Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery.</a> Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).</li><li>Bengali, Z., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Delivery+by+Immobilization+to+Cell-Adhesive+Substrates.">Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates.</a> MRS Bull. 30, 659-662 (2005).</li><li>Holmes, C. A., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-mediated+gene+delivery+from+glycol-chitosan/hyaluronic+acid+polyelectrolyte+multilayer+films.">Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).</li><li>Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+polyethylene+glycol+enhances+substrate-mediated+gene+delivery+by+nonspecifically+immobilized+complexes.">Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes.</a> Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).</li><li>Wang, C. H., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-mediated+nucleic+acid+delivery+from+self-assembled+monolayers.">Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers.</a> Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117, 2096-2103 (2008).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector+tethering+to+metal+surfaces+via+hydrolyzable+cross-linkers+for+the+modulation+of+vector+release+and+transduction.">Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction.</a> Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).</li><li>Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+concentration+and+bioactivity+of+adenovirus+vectors+for+gene+therapy.">Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy.</a> J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).</li><li>Forbes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+NO+and+ROS+production+by+AdiNOS+transduced+vascular+cells+through+supplementation+with+L-Arg+and+BH4:+Implications+for+gene+therapy+of+restenosis.">Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis.</a> Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).</li><li>Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+new+metallic+alloys+for+biomedical+applications.">Development of new metallic alloys for biomedical applications.</a> Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).</li><li>Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+eNOS+gene+delivery+and+transfection+with+stents+for+the+treatment+of+restenosis.">Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis.</a> Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).</li><li>Egashira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+anti-monocyte+chemoattractant+protein-1+by+gene-eluting+stents+attenuates+in-stent+stenosis+in+rabbits+and+monkeys.">Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).</li><li>Ohtani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent-based+local+delivery+of+nuclear+factor-kappaB+decoy+attenuates+in-stent+restenosis+in+hypercholesterolemic+rabbits.">Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits.</a> Circulation. 114, 2773-2779 (2006).</li></ol>

Protocol development and studies presented in this paper were supported in part by American Heart Association Scientist Development grants (I.F. 0735110N and M.C. 10SDG4020003), U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute grant HL 72108 (R.J.L.), and U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute T32 007915 (S.P.F.). Angioplasty catheters were kindly donated by NuMED (Hopkinton, NY). The authors wish to acknowledge secretarial assistance of Ms. Susan Kerns.

<html> Sunulan protokol paslanmaz çelik yüzeyleri coatless için adenoviral vektörlerin geri dönüşümlü eki yoluyla elde tabaka aracılı gen aktarımı için operasyonel bir yöntem açıklanır. Vasküler restenoz stent dayalı gen terapisi için özel olarak geliştirilmiş olup, bu teknik biyomateryaller, biyomedikal implant ve gen terapisi alanlarında çok daha geniş bir uygulama alanı vardır. Sunulan çalışmalar sadece bir prototip, metal alt tabaka olarak paslanmaz çelik yararlanmasına rağmen, PABT gibi karşılaştırılabilir afinite ile kobalt / krom ve nitinolden gibi diğer metal alaşımlar bağlar (yayınlanmadı). Metallerle PABT arasında biyopsisindeki etkileşimi önemli ölçüde bu teknoloji 31 için potansiyel biyomedikal uygulamalar sayısını genişletir. Ayrıca, HC-gergin gen vektörlerin kullanımı, malzeme yüzeyi üzerine tiol tesisatın diğer yöntemleri gerektiren olsa, biyomateryal diğer türleri ile mümkündür. Reklam gen vektörlerin bir çok insan hücre tipi ve dokusunda sağlam transdüksiyonunu elde edilirken ontent &quot;&gt;, klinik önemi Adenoviridae 4 ile ortaya çıkarılan yüksek iltihaplı ve bağışıklıkla ilgili tepkilere ile sınırlıdır. Bu amaçla, formüle edilmiş gen ile kaplı stent (4 ay) arter sentezleme uzun süreli lusiferaz ifade adeno-ilişkili viral vektörler kullanılarak HC modifikasyonu son zamanlarda (yayınlanmamıştır) gösterilmiştir. Metodoloji sağlamdır. Ana protokol küçük sapmalar genellikle in vitro ve in vivo gen ekspresyonunun önemli değişikliklere yol yoktur. Bununla birlikte, sonuçlarını etkileyebilecek birçok kritik sorunlar tespit edilmiştir. Adından da anlaşılacağı gibi Birincisi, çapraz bağlama maddeleri, hidrolize edilebilir bağlı olarak zincir esterin hidrolizi, su ile tepkimeye girdiğinde bölünebilen. Ayrıca, amin-reaktif yarımı, K -sulfosuccinimidyl da hidrolize edilebilir. Çapraz bağlayıcılar u saklanmalıdırnder, -20 ° C&#39;de bir argon atmosferi faaliyetlerini korumak için. Aynı sebeplerden ötürü, HC (protokol bölüm 3.2) çözeltilerin hazırlanması sonra virüs preparatlarından HC çözeltilerin eklenmesinin hemen devam edin. İkinci olarak, sunulan bioconjugation sekansının bir çok ara aşamaları esnasında metal yüzey üzerinde oluşturulmuştur tiol grupları hızlı bir şekilde ortam havasının oksijen ile oksitlenir. Bunu önlemek için, her zaman gazı alınmış su batık savunmasız metal örnekleri tutmak. Üçüncü olarak, kuyunun altındaki ile örgü mükemmel bir hizalama başarılı iletimi için gerekli olduğu. Taşıma sırasında örgü Diskleri bükmeyin. Dördüncü olarak, yüzey-ilişkili Reklam vektörlerin yerinden oynatmamaya önlemek için stent yerleştirilmesi sırasında teflon kılıf ve damar duvarına karşı gen salınımlı stentlerin aşırı ovuşturma kaçının. Implante edilebilir biomateria yüzeyine bir gen vektörü kovalent bağlanmasıls vektörlerin kovalent olmayan zenginleştirici ile gerçekleşebilir daha vektör salınım kinetiği üzerinde daha iyi bir kontrol belirgin bir avantaja sahiptir. Stent platforma gen teslimat ortamda çalışmaların çoğu stent uygulanan 32-34 sonra, 1-7 gün içinde viral ve viral olmayan vektörlerin tam salınımını rapor. Öte yandan, HC ile Ad vektör hareketsizleştirici ilk ay içinde vektör yükün sadece% 20-45 salınmasını göstermektedir (Şekil 4A ve 4B). Ayrıca, serbest bırakma ve iletim kinetiği kısmi bir modülasyon farklı hidroliz kinetiklerini gösteren farklı HC kullanımı ile ya da virüs yüzey değişimi için de kullanmak HC konsantrasyonu değiştirilerek elde edilebilir. Ayrıca, bu çalışmada araştırılmıştır olmasa da farklı çapraz-bağlayıcı molekülleri ile eş zamanlı vektörünün bir ko-modifikasyonu, ince ayar vektörü serbest bırakılması ve dönüşüm için bir fırsat sağlamaktadır.

Bir tedavi yöntemi olarak gen tedavisinin etkinliği gen terapi vektörleri 1,2 fakir hedefleme kapasitesi ile engellenmektedir. Hedef bölgede transgen ekspresyonunun alt terapötik seviyelerinde uygun hedefleme sonuçları eksikliği ve vektör ve kodlanmış bir terapötik ürün 4, her iki karşı bağışıklık karşılıklarının monte edilmesi için sorumlu olanlar da dahil olmak üzere, hedef olmayan organlar 3 e vektörleri yayılmasına yol açar 5. Bir potansiyel transdüksiyon karışıklık dengelemek ve hedefleme kan ve lenf yolu ile serbest yayılmasını önleyen bir formunda, istenen konuma gen vektörlerin tanıtmaktır teşvik etmek anlamına gelir. Tipik haliyle, bu çabalar fiziksel th tutulmasıyla da enjeksiyon yerinde geçici olarak sürdürülmesi gen vektörlerin sahip olan fibrin, kollajen veya hiyalüronik asit hidrojel matrisler 6-10 ile karıştırılır, viral veya viral olmayan vektörler ya da lokal olarak oluşan enjekte edilebilir bir dağıtım sistemlerine bağlıBir polimerik ağ-em. Gen tedavisi için lokalize bir diğer genel olarak kabul edilen bir paradigma implante prostetik cihazların 11,12 yüzeyinde gen vektörlerin immobilizasyon kullanmaktadır. Kalıcı tıbbi implantlar (endovasküler, bronş, ürolojik ve gastrointestinal stentler, kalp pilleri, yapay eklemler, cerrahi ve jinekolojik kafesleri, vb.) Hastaların 13 on milyonlarca yıllık kullanılmaktadır. Genellikle etkili iken, bu cihazlar yetersiz güncel tıbbi uygulamalar 14-17 tarafından kontrol edilir komplikasyonlara yatkındır. Implante edilebilir protez cihazlar lokalize gen tedavi için proxy platformları olarak hizmet için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. Farmakokinetik açısından, thei kinetiklerini implant / doku arayüzde gen vektörlerin yüksek lokal konsantrasyonlarda alınmasında ve yavaşlayan gen vektörler sonuç nispeten düşük giriş dozlarda tıbbi implantlar yüzey türetilmesi kaynaktanBu konumdan r eliminasyon. Hedef alınan hücre popülasyonu ile uzun süreli bir ikamet sonucu ve daha iyi alınmasıyla olarak, vektör immobilizasyon gen vektörü yayılmasını minimize eder. Böylece, hedef dışı dokuların istenmeyen aşılama azalır. (Aynı zamanda alt-tabaka-aracılı gen aktarımı ya da katı faz gen aktarımı olarak adlandırılır) implante biyomalzeme gen vektörlerin yüzey birleştirme kullanılarak hücre kültürü ve hayvan deneylerinde uygulanmıştır hem spesifik (antikor-antijen 18-20, avidin-biyotin 21,22) ve 23-26 (şarj, van der Waals) etkileşimler spesifik olmayan. Yüzey ile aşırı güçlü bağlar, hedef hücreler tarafından vektör içselleştirme engel yana implante edilmiş cihazın yüzeyine vektörlerin kovalent bağlanması, daha önce fonksiyonel olmayan olarak kabul edilmiştir. Yakın zamanda, bu sınırlama tet olarak kullanılan hidrolize edilebilir kendiliğinden çapraz bağlayıcı kullanımı ile aşılabilir olduğu gösterilmiştiradenoviral vektör 27,28 arasında stent ve kapsid proteinlerinin değiştirilmiş metal yüzey arasında onun. Ayrıca, taşıyıcıda salım hızı ve in vitro ve in vivo olarak transgen ekspresyonunun zaman seyri hidrolizi 28 farklı kinetik sergileyen hidroliz olabilen bir çapraz-bağlayıcıların kullanımı ile modüle edilebilir. Bu makale aktif metal yüzeye adenoviral vektörlerin tersine çevrilebilir kovalent bağlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamakta ve anjiyoplasti, stent sıçan şahdamarı modelinde kültürlenmiş düz kas ve endotelyal hücrelerin in vivo ve in vitro olarak takip eden transdüksiyon olayları incelemek için uygun bir deney düzeneği getirmektedir .

<table><tbody><tr><td>316 stainless steel mesh disks</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>E200-SS</td><td></td></tr><tr><td>Generic 304-grade stainless steel stents</td><td>Laserage</td><td>custom order</td><td></td></tr><tr><td>Ad&lt;sub&gt;eGFP&lt;/sub&gt;</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>AD-5-PV0504</td><td></td></tr><tr><td>Ad&lt;sub&gt;Luc&lt;/sub&gt;</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>AD-5-PV1028</td><td></td></tr><tr><td>Ad&lt;sub&gt;EMPTY&lt;/sub&gt;</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>A858</td><td></td></tr><tr><td>Cy3(NHS)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23000</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>UV 96-well plates</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometry 96-well plates</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture 96-well plates</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20290</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-LC-SPDP</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>21650</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>1575R</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal airflow oven</td><td>Shel Lab</td><td>1350 FM</td><td></td></tr><tr><td>Centra-CL2 centrifuge&amp;nbsp;</td><td>International Equipment Company</td><td>426</td><td></td></tr><tr><td>Digital vortex mixerer</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE300 fluorescence microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>DC 500 CCD camera</td><td>Leica</td><td>DC-500</td><td></td></tr><tr><td>7500 Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystems</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum bioluminescence station</td><td>Perkins-Elmer</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dipotassium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin fraction V (BSA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>A10 cell line&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1476</td><td></td></tr><tr><td>Bovine aortic endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>BW-6002</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin, potassium salt</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1Ge</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>PBS without calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution</td><td>Gibco</td><td>11540-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Corning cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cephazolin&amp;nbsp;</td><td>Apotex</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Loxicom (Meloxicam)</td><td>Norbrook</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Ketavet (Ketamine)</td><td>VEDCO</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)&amp;nbsp;</td><td>Lloid</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Forane (Isoflurane)&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Curved Moria iris forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Curved extra-fine Graefe forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl suture (5-0)</td><td>Ethicon</td><td>J385</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread (4/0 silk)&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Michel suture clips</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Wound dilator (Lancaster eye specula)</td><td>KLS Martin</td><td>34-149-07</td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Michel suture clip applicator</td><td>Fine Science Tools</td><td>112028-12</td><td></td></tr><tr><td>Insyte Autoguard 24 G IV catheter</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>2F Fogarty catheter</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>120602F</td><td></td></tr><tr><td>Teflon tubing</td><td>Vention</td><td>041100BST</td><td></td></tr><tr><td>PTA catheter</td><td>NuMed</td><td>custom order</td><td></td></tr><tr><td>Gauze pads</td><td>Kendall Healthcare</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Cotton applicators</td><td>Solon Manufacturing</td><td>WOD1003</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>281321</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe (Luer-Lok)</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe (Luer-Lok)</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Clippers with #40 blade</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>78005-314</td><td></td></tr><tr><td>Transpore surgical tape</td><td>3M</td><td>MM 15271</td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Pharmaderm</td><td>not available</td><td></td></tr></tbody></table>

vascular gene transfer from metallic stent surfaces using adenoviral vectors tethered through hydrolysable cross-linkers

Stent restenoz yaygın koroner ve periferik arter kritik daralmış kesimleri ile yeniden kurmak kan akışı için kullanılan stent tabanlı revaskülarizasyon işlemlerinin önemli bir komplikasyon sunar. Alternatif bir strateji sunmak anti-restenotik aktiviteye sahip genlerin ayarlanabilir serbest bırakabilen Endovasküler stentler halen ilaç salınımlı stentler kullanılan. Tipik olarak, vektörün fiziksel olarak yakalanmalarında için kullanılan polimer kaplamalarla ilişkili aşırı bir enflamatuvar yanıtı kaçınarak klinik kullanımlarını elde etmek amacıyla, gen salınımlı stent, stent hareketsizleştirilmiş gen vektörü serbest bırakılması ve damar siteye özgü iletimi öngörülebilir kinetiklerle gösterirler. Bu çalışma, bisfosfonat (PABT) hidroliz olabilen bir çapraz bağlayıcıların (HC) ile paslanmaz çelik yüzeyi uğratılmış polialilamin için adenoviral parçacıklarının geri bağlanmasına dayalı stentlere adenoviral vektörlerin gen coatless bağlanması için ayrıntılı bir yöntem anlatılmaktadır. Bir aile5 ile 50 gün arasında değişen zincir içinde bir ester hidroliz reaksiyonuna ortalama t 1/2 ile iki işlevli (amın ve tiol-reaktif) HC stent vektör bağlamak için kullanıldı. Vektör hareketsizleştirme prosedürü, 9 saat içinde gerçekleştirilir ve çeşitli adımlardan oluşur: PABT (4 saat) bir sulu çözelti içinde metal numunelerin 1) inkübasyon; Tris (2-karboksietil) fosfin (20 dk) ile PABT yüklü tiyol gruplarının 2) korumanın giderilmesi; Pırıdıldıtıo (PDT) grup (2 saat) ile derive edilmiş polietilenimin ile reaksiyona sokulması ile numune metal yüzeyin tiol reaktif kapasite 3) genişlemesi; Ditiyotreitol (10 dakika) ile tioller PDT grupların 4) dönüştürülmesi; HC (1 saat) ile adenovirüslerin 5) değiştirilmesi; Boyut dışlama sütun kromatografisi (15 dakika) ve tiollenmiş çelik yüzeye (1 saat), tiyol-reaktif bir adenoviral parçacıkların 7) immobilizasyon ile modifiye edilmiş adenovirüs partiküllerinin 6), saflaştırma. Bu teknik, stentlerin ötesinde geniş potansiyel uygulanabilirliği vardırİmplante edilen yabancı maddelerin ara-yüz hücrelere tabaka aracılı gen aktarımı yoluyla biyolojik uyumluluğunun geliştirmek için biyoprotez cihazların yüzeyi mühendisliği kolaylaştırarak.

Vektör Yayın Deneyler Örneğin stentler gibi endovasküler girişimsel içeren implantlar, yüzeye adenoviral vektörlerin Bağ, kısmen vektörlerini fiziksel hedefleme eksikliği önüne geçmeyi, hastalık bölgesine vektör yakındır. Bununla birlikte, hedef doku transdüksiyonu yoluyla terapötik etkisini elde edebilmek için, vektör, yüzey (Şekil 2) serbest bırakılması gerekir. Hidroliz olabilen bir çapraz-bağlayıcıların kullanımı çapraz bağlayıcı, hidrolizi yolu ile aracılık ettiği 1 vektörlerin etkili bağlanma ile modifiye edilmiş polybisphosphonate için), tiol-Kurulu metal implantları ve 2) sürekli salıverilmesini sağlamak için varsayılmıştır. Türevlendirme işlemi sonuna kadar örgü diskleri ile ilişkili Reklam EGFP vektörü genomik kopya sayısı, EGFP-özgül primerler (Şekil 3), viral DNA PCR ile belirlenir. Bağlı olarak,Belirli bir çapraz-bağlayıcı bağlı Ad vektör miktarı / 10 gözlü 9 9 10 cm x 3,5 ile 5,7 x parçacıkları değişir gerekir, ikinci. Bu miktar, bir tek tabaka düzeninde 100-nm İlan parçacıkları barındırmak 0.25 cm 2 toplam alana sahip, tek bir kafes disk tahmini maksimal kapasite (2.5 x 10 9) ile adil yazışmalarda. Çapraz bağlayıcı modifikasyon adımında Ad vektör başlatıcı miktarı 5 x 10 11 parçacıklar, tadil edilmiş vektörünün sadece yaklaşık% 1 sonunda PABT üzerinde hareketsiz kılındığı olduğu / PEI PDT paslanmaz çelik yüzeyi -derivatized. Hem in zincirli ester hidroliz hızı ve vektör ve biyo materyal arasındaki bağlantıların sayısını yüzeyinden Ad vektör salınma kinetiği, genel etkilemesi beklenmektedir. Önce çapraz-bağlayıcı değişiklik yapılmasına için, serbest bırakma deneyleri kolaylaştırmak için, adenovirüs partikülleri Cy3 flüorofor (bölüm 1 Protokolü) ile önceden etiketleniryon ve yüzey immobilizasyon (Protokol; bölüm 3). Yüzey ile ilişkili floresans azalma fluorometri (Şekil 4A) ve floresan mikroskobu (Şekil 4B) ile eş zamanlı olarak değerlendirilen zaman içinde daha sonra fizyolojik tampon içine vektör salınmasını izlenmesi için dolaylı bir yöntem olarak kullanılabilir. SKK ve İHK bağlantılar yoluyla ekli İlan vektörler SHC- ve NHC bağlı meslektaşları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha hızlı salınımını göstermelidir. Verilen örnekte,% 45 ve yüzey ilişkili vektörünün bir 39% kayıp 30. günde SKK ve IHC-gergin vektör ile gözlenmiştir sırasıyla gergin vektörün en az% 20 gözlenmediğini SHC ve NHC açıklanacak -immobilized örnekleri (Şekil 4A). Buna ek olarak, bu şekilde muhtemelen Ad vektorlerı olmalıdır vektörü ve metal alt-tabaka arasında farklı sayıda hayvan ipleri olan farklı olan ve aynı HC konsantrasyonunu ve immobilizevektör sürüm farklı kinetik. Gerçekten de, 0.1 mM RHC kullanılarak portör modifikasyonu, 0.5 mM SKK (Şekil 4A) ile hareketsizleştirilir vektörü için gözlenenden daha önemli ölçüde daha hızlı salım oranları ile sonuçlandı. Floresan mikroskopi verileri (Şekil 4B) IHC-, RHC- ve özellikle de düşük konsantrasyon SKK-gergin vektörler kullanılarak formüle örgü örneği ile yüzey bağlantılı floresans daha hızlı ve daha derin bir düşüş göstererek fluorometri bağlı olarak nicel vektör salım analizi ile iyi korelasyon onların NHC- ve SHC-gergin meslektaşları ile karşılaştırıldığında. Örgü Hareketsizleştirilmiş Reklam vektörlerinin in vitro transdüksiyonu Nicel ekspresyon analizi (fluorometri) ve mekansal gözlemler (floresan mikroskobu) ile uyumlu varlık olarak, Reklam eGFP SMC ve endotel iletimini izlemek için tercih edilen muhabir vektörhücre kültürleri serbest ve kafes hareketsiz Reklam vektörlerinin her ikisi ile işlemden geçirildi. Kimyasal SKK (Şekil 5) olan reklam kapsid modifikasyonu aynı zamanda 75 uM aşan konsantrasyonlarda için diğer çapraz bağlama maddeleri, (gösterilmemiş olan) önemli ölçüde, in vitro olarak, yüksek ihtimalle fiber topuzu maskeleme ve yeniden yapılandırma olmayan hareketsiz vektörü iletim etkinliğini bozar etki Coxsackie-Adenovirüs reseptörleri (SYR) aracılığıyla hücrelere bağlanma için Ad tarafından kullanılan. Vektör substrat hayvan zinciri tarafından hedeflenen hücrelerin yakın tutulan Bununla birlikte, topuzu ARAÇ etkileşimlerinin rol alt-tabaka hareketsiz vektörle transdüksiyon için daha az önem taşımaktadır. Bağımsız olarak HC Çeşidi hücre kültürü deneylerinde, örgü ile ilişkili Ad vektorlerı uzamsal kafes sınırları (Şekiller 6A ve 6C) için 300-500 um içinde bulunan hücrelere transdüksiyonunu kısıtlama sürekli yeteneğine sahiptir. Transgen Tipik pik seviyeleriE sentezleme SMC&#39;sine kafes (Şekil 6A ve 6B) veya BAEC (Şekiller 6C ve 6 D) kültürleri -yüklü Reklam eGFP yerleştirilmesi 3-5 gün sonra elde edilir. Aynı vektör yükte, tepe EGFP ifade seviyeleri şu sırayla artış: NHC-, SHC-, IHC- ve SKK-gergin vektör, kendi salınım kinetiği profillerinde farklılıkları yansıtmaktadır (Şekil 4). Bundan başka, daha dayanıklı transgen sentezleme SKK formüle edilmiş muadilleri (Şekil 6D) ile muamele edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında IHC formüle kafesleri ile muamele edilmiş hücrelerde görülmektedir. Kullanılan hücre kültür sistemi gecikmeli iletim olayların araştırılması için uygun bir set-up ya da daha sonra 48 daha sa örgü yerleştirildikten sonra, metal yüzeyinden salınan vektör parçacıkların getirdiği sunuyor. Bu uygulamada, fluoromet ile EGFP ekspresyonu tespit edildikten sonraRy ve floresan mikroskobu transdüksiyon başlamasından itibaren 48 saat sonra, BAEC tripsinlendiler ve kafes bozmadan kuyulardan aspire edilmiştir. Taze olmayan transduse BAEC sonra kısmen serbest kafes içinde yeniden kaplanmıştır pasajlanmağa devam edildi. 2 günlük zaman noktasından sonra gözenekli taşıyıcıdan serbest virüs partiküllerinin neden olduğu &quot;yeni&quot; transdüksiyon olayları sonra, flüoresans mikroskopisi ve fluorometri ile değerlendirilir (Şekil 7A ve 7B). Kafes yerel ayar için karakteristik mekansal kısıtlama gösteren sağlam EGFP ekspresyonu, tipik olarak, hücre kültür ortamı tamamlamak için daha 48 saat maruz bırakıldıktan sonra, örgü bağlı Reklam vektörlerinin iyi korunmuş bir iletim kapasitesi teyit Bu &quot;yeni&quot; kültürlerinde (Şekil 7) görülmektedir 37 ° C&#39;de ilave edildi. In vivo Çalışmaları U ile ilgili olası etkilerini incelemek içinarter iletimi, Reklam Luc RHC-, IHC-, SHC- ile hazırlanmış stent -eluting implantlı hayvanlarda farklı HC se NHC-tadil edilmiş vektörünün 1 ve 8 gün stent uygulanan (Şekil 8) sonra, biyolojik olarak ışık veren görüntüler elde edildi. Görüntüleme luciferase lokal perivasküler verilmesini takip edilmesiyle gerçekleştirildi (2 mg), Pluronik jel ile birlikte formüle edilebilir. Bu formülasyon, buz üzerinde soğutulmuş, yapışkan bir sıvı, ancak, 37 ° C&#39;de doku ile temas ettirildiğinde jel hemen faz geçiş yapar. Ön deneyler, (gösterilmemiş olan) bir çok sistemik (periton içine veya damar içine) uygulamaya lusiferin ile karşılaştırıldığında Reklam Luc daha kararlı ve yeniden üretilebilir bir parlaklık sinyallerinin lusiferin sonuç perivasküler dağıtım vasküler doku -transduced gösterdi. Stent ve stent dağıtım cerrahi virüs bağlanma teknik ses olsaydı, iyi tanımlanmış bir sinyali stentli bölümüne karşılık gelensıçan karotid arter çıkar ve kaydedilir. Stent implantasyonu bir gün sonra, SKK formüle Reklam Luc stent ile muamele edilmiş hayvanlar genellikle IHC- ve SHC- alıcı sıçanların ile en yüksek parlaklık sinyali, stentler formüle (Şekiller 8A ve 8B) bulunmaktadır. Algılanabilir bir sinyal stent takılan sıçan grubunda gözlenir vasküler doku etkin iletimi için stentten engelsiz vektör verildiği öneminin altını çizerek NHC-gergin Reklam Luc kullanılarak hazırlandı (Şekil 8A ve 8B). Bu, sırasıyla 1,4-IHC- ve AVM formüle stentler, 1.8 kat (Şekil 8A ve 8B) arttırırken 8. günde tarafından RHC formüle stentler Lusiferaz ifadesi için bir ortalama şiddeti, çok sayıda kat düşer. Bu bulgu daha yavaş bir kin sergileyen gen salınımlı stentler ile daha dayanıklı vasküler transdüksiton hipotezi ile tutarlıStent yüzeyden vektör salınımının etik ile. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/51653/51653fig1highres.jpg" /> Açıklanan çalışmalarda kullanılan çapraz bağlayıcıların (NHC, SHC, İHK ve SKK) 1. Yapısal formüller Şekil (izni 28 ile değiştirilmiş). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/51653/51653fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Bir PABT için Ad vektör tethering&#39;i temsil eden bir şema / PEI PDT HC ve çapraz bağlayıcı hidroliz üzerine vektör sonraki sürümü ile paslanmaz çelik yüzeyi -değiştirilmiş (izni 28 ile değiştirilmiş). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51653/51653fig3highres.jpg" /> Şekil 3. PCR tabanlı kantPABT / PEI PDT yüzeyinde çapraz bağlayıcı zenginleştirici ile hareketsizleştirildi Reklam EGFP US-PS paslanmaz çelik kafes uğratılmış. paslanmaz çelik kafes, her durum için SKK, IHC SHC, ya da NHC (n = 3 ile hareketsizleştirildi Reklam eGFP ile formüle edildi ). Proteinaz K işleminden sonra, viral DNA, yıkanır ve MinElute sütunları kullanılarak saflaştırılmıştır. EGFP-özgü primerler kullanılarak viral DNA&#39;nın amplifikasyonu 7500 Real-Time PCR motoru gerçekleştirildiği ve SYBR Green ile tespit edildi. Veri normalleşme sabitlenmeyen Reklam eGFP bilinen bir miktarı ile hazırlanmış bir kalibrasyon eğrisine göre olan (28 izni ile değiştirilmiş). <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/51653/51653fig4highres.jpg" /> Ad vektör Şekil 4. Yayın kinetik HC metal yüzeylerde gergin. Stainless çelik kafes PABT bağlı ~ 2 x 10 9 Cy3 etiketli İlan parçacıklar ile işlevselleştirilmiştir / PEI PDT 500 iM NHC, SHC, İHK, SKK ve (SKK-L olarak belirlenmiş) 100 mcM SKK ile değişikliğinden sonra yüzey -değiştirilmiş. Reklam floresan-etiketli parçacıkları serbest bırakma, (A) ile belirtilen zaman noktalarında 550/570 nm&#39;de incelenmiştir ve (B) floresan mikroskobu (rodamin filtre grubu, orijinal büyütme 200x) en iyi tarama fluorometri. ± SEM, n = 8-10 olarak Fluorometri sonuçlar sunulmuştur; p &lt;NHC ve SHC IHK, SKK ve vs SKK-L gruplar arasındaki tüm karşılaştırmalar için 0.001 (izni 28 ile değiştirilmiş) bir post-hoc Tukey testi ile Anova tarafından belirlenmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/51653/51653fig5highres.jpg" /> Olmayan hareketsiz Reklam e Şekil 5. İletimi etkinliğiBelirtildiği gibi SKK ile modifikasyon, aşağıdaki GFP. Embriyonik aort türevi SMC (A10 hattı) Sıçan değiştirilmemiş veya SKK Reklam eGFP ile modifiye vektörün biri ile 1000 arasında bir MOI&#39;da transdüse edilmiştir. Bir muhabir ifade florometrik belirlenir (485/535 nm) 48 saat transdüksiyon sonra (izni 27 ile değiştirilmiş) edilmiş. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/51653/51653fig6highres.jpg" /> Paslanmaz çelik için hareketsiz Ad vektör ıle kültürlenen SMC ve BAEC Şekil 6. İletimi HC bağdaşmaktadır. Ağlar, NHC, SHC, IHC ile, ekteki ve RHC ~ 2 x 10 9 Reklam EGFP parçacıklar ile işlevselleştirilmiştir. Ağlar daha sonra ayrı ayrı alt konfluent A10 (A, B) ve BAEC (C, D) mono tabakaları üzerine yerleştirildi. Ad vektör-gergin kafesleri ile muamele edilmiş hücrelerin transdüksiyonu (EGFP ifade seviyeleri olarak ifade edilir), f değerlendirildiluorescence mikroskobu (A, C; FITC filtre seti; orijinal büyütme 100X) ve iyi-tarama fluorometri (B, D). Fluorometri sonuçlar, ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır n = 4 (izniyle 28 ile değiştirilmiş). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51653/51653fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/51653/51653fig7highres.jpg" /> Gecikmeli zaman noktalarında yüzey hareketsiz İlan vektörleri Şekil 7. İletimi yetkinlik. İlan eGFP çelik üzerinde hareketsiz bırakılmıştır NHC, AVM, İHK veya SKK hayvan iplerini yoluyla kafesleri. Kafesleri kaynaşma BAEC mono tabakaları üzerine yerleştirildi. İki gün sonra, yerleştirme, BAEC tripsinize edildi ve kafes bozmadan çıkarılır. Yeni, transdüksiyona BAEC daha sonra ağların üzerine ekilmiştir. Reklam(; FITC filtre seti; orijinal büyütme 100X A) ve fluorometri (B) eGFP iletim yeterlik floresan mikroskopi kullanılarak eGFP ifade ölçüldü. Ölçümler belirtilen güne alındı, temsili görüntüler kullanılmış ve fluorometri sonuçları SEM ± araçları, n = (izni 28 ile değiştirilmiş) 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51653/51653fig7highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/51653/51653fig8highres.jpg" /> In vivo. Reklam Luc (1.3 x 10 10 parçacıklar) stent-hareketsiz İlan Luc Şekil 8. İletimi verimliliği NHC, SHC, İHK veya SKK (tüm gruplar için n = 3-4) ile endovasküler stent bağlıydı. Reklam Luc İletimi verimliliği &lt;Stentler ayrıştırılmıştır / sub&gt; biyoparlaklık görüntüleme (IVIS Spektrum) 1 ve 8 gün sonrası stent dağıtım (A) ile ölçüldü ve (izni 28 ile değiştirilmiş) bir logaritmik ölçek (B). Kullanılarak çizilen <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51653/51653fig8highres.jpg" target="_blank">bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers at JoVE.com

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.

Hidrolize Çapraz bağlayıcılar yoluyla Adenoviral vektörler gergin kullanma Metalik Stent Yüzeylerden Vasküler Gen Transferi

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

vascular-gene-transfer-from-metallic-stent-surfaces-using-adenoviral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Görüntüleme.  The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania. These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries. 

Video: Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

Klinik öncesi Model İskemik Kalp Yetmezliği Gen Transferi

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Tıp

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Gelişim Biyolojisi

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Biyomühendislik

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Fare Arteriovenöz Fistül Endotelyumunun için intraluminal Drug Delivery

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Fabrication of Small Caliber Stent-grafts Using Electrospinning and Balloon Expandable Bare Metal Stents

Stent-grafts are widely used for the treatment of various conditions such as aortic lesions, aneurysms, emboli due to coronary intervention procedures and perforations in vasculature. Such stent-grafts are manufactured by covering a stent with a polymer membrane. An ideal stent-graft should have a biocompatible stent covered by a porous, thromboresistant, and biocompatible polymer membrane which mimics the extracellular matrix thereby promoting injury site healing. The goal of this protocol is to manufacture a small caliber stent-graft by encapsulating a balloon expandable stent within two layers of electrospun polyurethane nanofibers. Electrospinning of polyurethane has been shown to assist in healing by mimicking native extracellular matrix, thereby promoting endothelialization. Electrospinning polyurethane nanofibers on a slowly rotating mandrel enabled us to precisely control the thickness of the nanofibrous membrane, which is essential to achieve a small caliber balloon expandable stent-graft. Mechanical validation by crimping and expansion of the stent-graft has shown that the nanofibrous polyurethane membrane is sufficiently flexible to crimp and expand while staying patent without showing any signs of tearing or delamination. Furthermore, stent-grafts fabricated using the methods described here are capable of being implanted using a coronary intervention procedure using standard size guide catheters.

In the protocol, we present a method to manufacture a small caliber stent-graft by sandwiching a balloon expandable stent between two electrospun nanofibrous polyurethane layers.

Elektrospinning ve Balon Genişletilebilir Bare Metal stentler Kullanma Küçük Caliber Stent-greft Fabrikasyon

Stent-grafts are widely used for the treatment of various conditions such as aortic lesions, aneurysms, emboli due to coronary intervention procedures and ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

Vivo Gen transferi için tavşan ortak Karotid arter endotel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Tavşan manken dayanıklı Transgene ifade juguler ven ortak karotid arter interpozisyonu Greftler için

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Diyabetik tavşanların arka ekstremite Iskemi preklinik modeli

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.