Biz, kamera çalışması için Tripti Gupta ve Frederike Alwes hücre ablasyon tekniği rafine yardım için, ve veri, video ve yazının geri bildirim için Extavour laboratuvar üyeleri Reyhan Arif ve Hassaan Shahawy teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Harvard Kök Hücre Enstitüsü tarafından desteklenmiştir (Tohum Hibe numarası SG-0057-10-00) Ellison Tıp Vakfı (New Scholar Ödülü numarası AG-NS-07010-10) JFMO için, ve Harvard Üniversitesi Araştırma Programı ödül için ARN.

Bazı adımları yürütülmesi faydalı olabilir görmediniz italik olarak gösterilmiştir. 1.. Gün 1: Malzemelerinin Hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki malzemeleri (Malzeme ve Ekipmanları bkz. Tablo) hazırlayın: <ul><li> 15 cm ve 22 cm Pasteur pipetler </li><li> Elmas kâtip </li><li> Süzülen yapay deniz suyu 1 mg / ml Amfoterisin B (100 mg / ml stok çözeltisi 1:100), 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (stok çözeltisi ihtiva eden 01:50 (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk) penisilin 5000 ünite / ml streptomisin ve 5.000 mg / ml ihtiva eden) </li><li> katkı maddesi olmadan filtrelenmiş yapay deniz suyu (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk) </li><li> Konut çiftler için büyük bir plastik kap (en az 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> Sylgard ile kaplı küçük (3 cm veya 5 cm) petri </li><li> küçük (3 cm veya 5 cm) Petri kapları </li><li> bir gözlem ya da cam, çok oyuklu plaka </li><li> forseps (Kullandığımız künt forseps sağa sola türetilmişbiz yanlışlıkla forseps uçları iki çatal dişleri aynı uzunlukta olduğunu, pürüzsüz olmasını sağlamak için bileme taşı bir forseps kullanarak, ve artık sahip olduğu ile değiştirdikleri diğer laboratuvar prosedürleri, hasar gören m eski Dumont # 5 forseps kindir. Böyle yeni Dumont # 5 forseps gibi son derece ince forseps, bunlar embriyo ve / veya dişileri yaralayabilir olarak istenmemektedir.) </li><li> Sonunda bir Pasteur pipet (aşağıya adım 1.2) genişledi </li><li> Pasteur pipet ince ucu içine gömülü ince, kavisli tungsten telinin oluşan bir embriyo alma aracı (uygulamak alternatif yerini olabilir; aşağıya 1.3 bakınız) </li><li> küçük bir açıklığı olan bir ağız pipet (aşağıya adım 1.4) </li><li> Bir cam kapiller çekti yapılmış bir cam iğne (aşağıya adım 1.5 &#39;e bakınız) </li></ul> Insanlar için toksik malzemeler yoktur bu protokol kullanılır. Risk yönetimi Guidel gereği Ancak, araştırmacılar eldiven veya diğer koruyucu kıyafetleri giymek emin olmalıdırkurumlarının ines. </li><li> Daha sonra genişletilmiş Pasteur pipet, pipet, bir elmas çizici ile dar parmaklarını korumak için bir Kimwipe&#39;dan veya kağıt havlu pipet attı bölgeyi sarmak başlar noktada 15 cm Pasteur pipeti etrafında ilk puanını ve dikkatle yapmak için skor çizgisinde ucunu kırın. Kenarlarını düzeltmek için birkaç saniye için bir Bunsen beki alev üzerinde pipet kırık ucunu tutun. Açılış pipet maksimum genişliğinden az daha dar olmalıdır. </li><li> Tungsten tel kesme aletini yapmak için, 15 cm cam Pasteur pipet ucunu bir tungsten teli ve cam eritmek için bir Bunsen beki alev üzerinde kısa bir süre tutun, yerinde tel sabitleme. Bir çengel şekil için hafifçe eğri telin ucu forseps kullanın. Bu araç için uygun bir şekle sahip bir örnek için Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Ağız pipet için küçük bir açılış yapmak için, iki parça ov içine 22 cm Pasteur pipet ince ucunu çekinbir alev, ve küçük sonu ucu koparak er. Ağız pipet tutucu ucuna yerleştirin. </li><li> Bir iğne çektirmenin kullanılarak ablasyon prosedürü sırasında, ilgi konusu blastomerlerdir delmek için kullanılacak olan cam iğne yapın. Uygun bir biçimde şekillendirilmiş bir iğne, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Bu iğne 2x parametreleri ile bir program kullanarak bir Sutter P97 iğne çektirmesi çekildi (ısı = 566, = 100 çekin, hız = 20 = 250, zaman) + 1X (ısı = 566, çekin = 100, hız = 100, zaman = 250). Ama aynı zamanda embriyo koryon karşı itilir kırmaya yeterli sağlam olması, iğne yapmak için kullanılan belirli bir program ve alet değişebilir, ancak ince bir iğne noktası olması gerekir. </li></ol> 2. 1. Gün: Gathering Parhyale Çiftleşme Çiftler <ol><li> P. çiftleşme toplamak için genişletilmiş Pasteur pipet (adım 1.2 yukarıda) kullanın hawaiensis büyük kültür kabından çiftler ve ayrı bir kap içeren bir c aktarmakYapay deniz suyu eğiliyorum. Bu tuzlu su filtre edilmesi gerekli değildir. Bu, daha sonra öğleden sonra eşleşme çiftleri toplamak ve ertesi sabah, en son döllenmiş embriyolar ve biriken ve dolayısıyla erken bölünme edilmiş, böylece, (20-23 ° C) bir karışımı, oda sıcaklığında gece çiftler bırakmak için en iyi uygun aşamaları ablasyon. Bazı kadın ertesi sabah erken bölünme aşamasında embriyo taşıyan olmasını sağlamak için en az 20 çiftleşme çiftleri toplamak. </li></ol> 3. 2. Gün: Gathering Parhyale Embriyolar <ul><li> Ertesi sabah, CO 2 ile süzülmüş yapay deniz suyu (FASW) demlenmeye. Kadınlarda Bazı gece boyunca kendi erkeklerden ücretsiz swum olacak, bunlar ayrılmış kadın toplamak ve FASW / CO 2 onları uyutmak. Kalan eşleştirilmemiş erkek çiftleşme çifti kaptan çıkarıldı ve büyük kültüre geri döndürülebilir. Kalan çiftleşme çiftleri daha sonra embriyo toplanması için kaydedilebilirgün veya ertesi gün. </li><li> FASW / CO 2 saat camı embriyo taşıyan tek Aneztezi kadın aktarın. Tüm ayrılan kadın büyük olasılıkla kadın şeffaf coxal plakaları (Şekil 1A) ile soluk pembe ya da mor küremsilerden gibi gözle görülebilir olacak, yumurta yatırılır olacak. Embriyoların erken bölünme aşamalarında ve blastomer ablasyon için bu nedenle uygun olup olmadığını belirlemek için, araştırmacı kuluçka torbadan embriyolar kaldırmak ve bir mikroskop altında incelemek gerekir. </li><li> Bir mikroskop altında prosedürü görüntülerken, forseps ile vücudun bir tarafında coxal plakaları kavramak. Embriyolar bu coxal plakaları (Şekil 1B) arasındaki ventral yavru kese görünür olacak. </li><li> Damızlık kese arka ucunu, yavaşça damızlık ayırmak için kuluçka kesesinin ön sonuna doğru kabloyu kaldırın, ince, kavisli tel aracı (yukarıdaki adım 1.3 Şekil 3) takınkese kaplamaları (bu 30 oostegites denilen ventral uzantıları modifiye), keseyi açıp embriyolar gevşeterek. Bu membran Yumurtlayarak sonra yaklaşık 2-3 saat kaybolur ve embriyolar bağlı değildir, tüm kolayca tel aracı tarafından bozulacak bir çok ince, şeffaf bir zar içine konur atılmaktadır ilk saat içinde embriyolar birbirleriyle ya da herhangi bir şekilde dişi embriyojenez boyunca bu noktadan itibaren. Araştırmacılar bu rahatsız edici ya da zor damızlık torbadan embriyolar kaldırmak için kavisli tel aracı manevra bulursanız, alternatif bir sürece hareketler yumuşak ve hiçbir sert basınç embriyolar veya damızlık kese uygulanır olarak kullanılabilir uygulamak. Damızlık kese embriyolar kaldırmak için uygun diğer araçlar köreltilmiş forseps ya da mühürlü ve düzeltti sonunda bir cam kılcal bulunmaktadır. </li><li> T dışarı iterek, açılan yavru kese ile su temizlemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanıno saat camın altına yerleşmek gerektiğini, hangi embriyoların. Ana kültürün onu reintroducing önce kurtarma izin (CO 2 olmadan) FASW temizlemek için kadın aktarın. Birden fazla kadın aynı kurtarma çanak içine yerleştirilmiş, ancak onlar hala kısmen anestezi eğer diğer hayvanlar tarafından yemiş olabilir gibi kadın, ana kültürüne onları dönmeden önce tamamen kurtarmak için izin olabilir. </li><li> Temiz FASW ile bir Petri kabı embriyo transferi, ve embriyonik evresini belirlemek için mikroskop altında görüntülemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanın. Bu işlem için uygun olan üçüncü bir bölünme (aşama 4 5), en vardır ayrı embriyolar. Ayrıca önceki germ disk oluşumuna herhangi bir bölünme aşamasına bu protokolü uygulamak mümkün olmalıdır (07-08 Mayıs aşamaları). </li></ul> 4. 2. Gün: Kesip Tek Hücreler <ol><li> FASW sığ bir tabaka ile Sylgard kaplı Petri çanak doldurun. Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pi kullanınpette plakasına tek bir embriyo transfer etmek. </li><li> Künt forseps kullanılarak, hafifçe ablasyon edilecek olan hücre (Şekil 2A ve 2B) tanımlamak için embriyo döndürün. Germ hattı ön g küçük macromere Mav üstüne oturur micromere küçük olarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, doğrudan g mezoderm ön micromeres ml mr payı olarak embriyonun ortasında bir sınır hücre. Mr g sağındaki blastomere olup, bunun üzerine doğrudan karşısında micromere olan en hücreyi temas ve etmez mi g solundaki micromere olduğunu. Mr, ml, ve EN kardeş macromeres ektoderm öncüleri sırasıyla Er, El ve Ep vardır. </li><li> LEF forseps ilearaştırmacı sağ elini ise t el (veya sağ elinde araştırmacı sol elini ise), sağa ilgi hücre ile embriyo şark (veya sola araştırmacı sol elini ise), ve yavaşça stabilize forseps arasında embriyo kavramak. </li><li> Çekilmiş bir cam iğne (yukarıdaki adım 1.5, Şekil 4) kullanılarak, yumuşak, ilgi konusu bir hücreyi delinme. Komşu hücrelere veya ilgi hücrenin altında iğne itin şekilde değil, çok uzak iğne takmayın. İğne sadece koryon ve temel hücre zarı delinme vardır ve ablasyon üzere hücre içine derin uzatmak gerekmez. </li><li> Alışverişi para cezası ile bir ağız pipet cam sonu için embriyo delmek için kullanılan iğne Pasteur pipet (yukarıdaki adım 1.4) çekti. Ilgi hücrede oluşturulan deliğe yakın pipet ucu tutun ve çok hafif bir emme uygulanır. </li><li> Çok hafifçe forseps ile embriyo sıkmak. Blasto içeriği itibariylesadece, adım 4.4 oluşturulan delikten koryon dışına itti embriyo engelsiz bir görünüm sağlamak için ağız pipet içine emmek. Delik yeterince büyükse, delinmiş bir hücrenin çekirdeğinde de ortaya görülebilir. Bu tüm hücre içeriğini kaldırıldı ve rejenere olamaz emin olmak için iyi bir kontroldür. </li><li> Ilgi blastomere kaldırılır dikkatle embriyo gözlemlemek. Delinmiş hücrenin sınır görünür yatan hücrelerinin kavşak yapım, koryon delikten doğru kayacaktır. Ilgilenilen blastomer tüm kaldırıldı kadar basınç uygulamaya devam edilir. Yan yana gelen embriyo rulo forseps kullanın ve görsel ilgi blastomer hepsi gitti olduğunu onaylayın. </li><li> Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pipeti kullanılarak, (FASW + 1 mg / ml amfoterisin B, 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin) FASW + temizlemek için embriyo transferi. </li><li> Bireysel kuyularda blastomere-ablasyon embriyolar kaldırınFASW + temiz bir 48-çukurlu plaka içinde, günlük antibiyotik takviye FASW +% 50 değiştirilmesi. Elimizde embriyo hayatta ve 18-28 ° C arasında bir sıcaklık aralığında, daha iyi takip ablasyonu geliştirmek Araştırmacılar minimal rahatsızlık ile embriyolar yükseltmek için bir temiz (ama mutlaka steril değil) bir yüzeye sahip olduğu için bir sıcaklıkta kendi embriyolar yükseltmek gerekir. Kontrolleri ile blastomer ablasyon embriyoların gelişimsel olayların zamanlamasını karşılaştırma yapabilmek için, 18 º C 4, 25 º C 4 yetiştirilen embriyo için kullanılabilir detaylı gelişimsel hazırlama bilgilere okuyucu bakın, ve 26 º C 5,6. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz manuel ablasyon ve amphipod P. erken bölünme aşamalarında tek blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması için bir protokol açıklar hawaiensis. Biz bir sekiz-hücreli aşamada embriyo tek germ hattı öncü hücre g kaldırarak bu protokolün kullanımını göstermek ve ablasyon sonra embriyojenezinde g &#39;nin kızı hücrelerin yokluğunu teyit başarılı olduğunu gösteriyor. Bu protokol, erken aşamalarında bölünme embriyo micromeres herhangi kaldırmak için kullanılabilir. Birinci veya ikinci bölünme aşamalarında bu aşamada macromeres veya blastomerlerdir kaldırmak için bu protokolü kullanmak için, kullanıcıların sadece adım 4.4 de koryon biraz daha büyük bir delik oluşturarak, ve uzun bir süre basınç ve emme uygulayarak hafif değişiklikler uygulayabilirsiniz adımında 4.6 hücre içeriğinin daha büyük bir hacim kaldırın. Bu protokol kullanımından sonra, ayırma sonra kalan blastomerlerin un geliştirilmesi olduğunu bulduken az 23 gastrulasyon zamanına kadar bölünmesi ve hücre hareketi kalıpları ile ilgili olarak etkilemiştir. Bu protokol, bu amphipod erken bölünme blastomer gelişim potansiyeli de devam soruşturma için yararlı olabilir. Birçok soru bazı hücreler değil, diğerleri ablazeydi blastomerlerin olanlar yerine kaderlerini değiştirmek neden dahil, bu alanda cevaplanması gereken kalır, ve bu düzenleyici değişikliklerin hassas zamanlama ve mekanizmaları. Bu protokol, aynı zamanda, sadece ilgi konusu blastomerlerde ardışık adımları 4,2-4,7 tekrarlayarak, birden fazla hücrenin ablasyon uyum sağlamak için modifiye edilebilir. Bu erken bölünme blastomerlerdir görüntülemek ve doğru bir şekilde tespit etmek amacıyla, uygun aydınlatma ile, yüksek kaliteli bir stereomikroskop kullanılması önemlidir. Biz bir fiber optik soğuk ışık kaynağı yanal gelen beyaz ışık, bu amaç için en yararlı olduğunu bulmak. Doğrudan specim yukarıda Olay ışıkiletilen ışık embriyoların blastomer ve yoğun sarısı nüfuz başarısız olurken tr, hücresel morfoloji ve sınırları belirsiz olabilir yansımalar oluşturur bu nedenle ayırt etmek zordur. Bu soluk embriyolar için en iyi kontrast sağlar gibi, saat camı veya siyah bir yüzeyi yerine beyaz veya şeffaf bir cam yüzey üzerine yerleştirilmek üzere embriyoları içeren bir Petri kabı için en faydalı olacaktır. Bu protokol bir sınırlama ilgi blastomere doğru ve net bir şekilde prosedürü başlamadan önce tanımlanmış olmasıdır. Photoablation teknikleri araştırmacılar sistemine yeni için embriyolar floresan boya 28 enjeksiyonu takiben bir kaç bölünme devir için geliştirmek için bırakılabilir ve enjekte blastomer kimlik sonrası enjeksiyon teyit beri, daha yararlı olabilir, ancak fotoablasyonundan önce, olur de, önceki hücre hattı olarak tarif edilmiştir hücre soyundan, bir örüntüye göreyaş 6,23 analizleri. Araştırmacılar P. öğrendiğinizde hawaiensis embriyo ve güvenle tüm blastomerlerdir belirleyebilir, burada açıklanan manuel ablasyon daha çok embriyo ölü hücre gövdesi çıkarmadan hücreyi öldürmek daha blastomer tam bir fiziksel kaldırılması, istenen uygulamalar için kullanılabilir. Bu prosedür, ilke olarak, diğer holoblastically yaran kabuklular bölünme aşamasındaki embriyolar ya da kimin chorions veya gübreleme zarlar kolayca silinemez diğer deniz veya tatlı su omurgasız tek blastomerlerdir kaldırmak için uygulanabilir. Değişiklikler, uygun özelliklere sahip tuzluluk kuluçka ortamını kullanarak ve daha hassas membranlar (daha uzun ve daha ince iğneler) veya daha sağlam embriyonik kaplamaları (daha kısa, hızlı bir şekilde iğne konik) uyum sağlamak için iğne şeklini değiştirerek içerebilir.

Amphipod kabuklu Parhyale hawaiensis evrimsel gelişim biyolojisi araştırmalarında 1 kullanım için büyük potansiyeli olan bir gelecek vaat eden bir model organizma olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Meyve. D. Drosophila melanogaster uçuyordu eklembacaklılar arasında, çoğu modeli sistemleri böceklerdir ve en yaygın olarak bu okudu melanogaster böcek Diptera takımının bir üyesi olan ve bazal biçimde dallanma böceklerin 2 kişilerce ilgili olarak elde edilen bu tür görüntüler çok embriyolojik özellikler gibi. Ayrıca, böcekler böcekler pancrustaceans denilen uzun ayakta &quot;doğal&quot; grup içinde kendi yakın akrabaları var, yani Subphylum Pancrustacea 3 iç içe olan, ve bu grup paraphyletic olduğunu vardır. Bu ek dorsalde böcek modelleri dallanma önerir, diğer kabuklular çalışmalar gelişimsel özelliklerin evrimsel tarihinin daha geniş bir görünüm kazanmak için gerekli olan birçok iyi D. çalışılmıştır nd moleküler mekanizmalar melanogaster. Ancak, çok az kabuklular iyi gelişme deneysel laboratuar analizi için kurulmuştur. Amphipod P. hawaiensis deneysel teknikler bir dizi için uygun son derece uysal bir laboratuar model sistemidir. Amphipods kendi ana superorder Peracarida (plaj siloları, scuds, ve de karides) içinde birçok benzersiz özellikleri görüntülemek ve bu nedenle nispeten kabuklular bu grup içinde türetilmiş olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, Parhyale tarafından sunulan embriyolojik ve fonksiyonel genetik manipülasyon göreli kolaylığı bu amphipod model organizmaların mevcut envanter için değerli bir katkı yapmak. Bir laboratuar hayvanına, P. de hawaiensis bir çok avantaj sunar. Hayvanlar sıcaklık ve tuzluluk geniş bir yelpazede karşı toleranslı olan ve yapay deniz suyu 1 büyük kültürlerinde iyi hayatta. Bu betw ayırt etmek kolaydırbelirgin morfolojik farklar, çiftleşme sırasında dişi kavramak için kullanabileceğiniz Erkeklerde en önemlisi, büyük, çengel, ön gövde uzantıları dayalı een kadın ve erkekler. Embriyolojik ve gelişimsel çalışmaları için, P. hawaiensis birkaç çok çekici özelliklere sahiptir. Embryogenezis yaklaşık 10 gün sürer ve cinsel olgunluk zamanı 28 º C&#39;de yaklaşık altı hafta (ama Parhyale yaklaşık 20-30 º C arasında değişen sıcaklıklarda iyi hayatta unutmayın, ve bu ayrıntılı gelişimsel evreleme bilgisi 18 º C&#39;de 4 yetiştirilen embriyo için kullanılabilir , 25 º C 4, ve 26 º C 5,6). Yetişkin laboratuvarda tüm yıl boyunca dostum, yani embriyolar yılın herhangi bir zamanında kullanılabilir. Dişiler ilk birkaç bacak çifti (Şekil 1A ve 1B) arasında yer alan bir ventral kuluçka kese içine döllenmiş yumurta (dişi yaşına bağlı olarak) 2-20 koymak ve bu embriyo toplamak mümkündürkadın öldürme veya embriyolar (Şekil 1C) zarar vermeden çok erken gelişme var. Embriyolar, tarama için süzülür yapay deniz suyu içinde hayatta sonraki gen ifadesi ya da histolojik analiz 7 için sabitlenebilir, ve detaylı bir hazırlama tablo geliştirilmesi 5 boyunca ilerleme doğru belirlenmesini sağlar. Sağlam protokolleri ya da in situ hibridizasyon 8-15 4,16,17 immün olarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır, ya da RNA girişim 13,15 morpholinos 12 ve sabit bir germ hattı ile fonksiyonel portatif 18, genetik dönüştürme. Transgenesis sistemi, uyarılabilir ifade 14 ve 19 yöntemleri de P. gen araştırmak üzere de kullanılabilir güçlendirici tuzağı kullanılarak hawaiensis. Kamuya açık bir genom dizisi şu anda mevcut değil ise, oogenezisin ve embriyogenez sırasında üretilen transkript içeren bir transcriptome arı vardırn de novo monte edilmiş ve 20 açıklamalı ve gen keşif kolaylaştıran, aranabilir bir veritabanında 21 yatırılır. Sonuç olarak, P. hawaiensis gelişimini anlamak için birden fazla deneysel ve genetik yaklaşımlar için uygun son derece uysal bir model organizmadır. D. erken sinsityal bölünmeler aksine melanogaster, P. hawaiensis embriyolar holoblastically fertilizasyon (Şekil 2A), aşağıdaki bölmektedir. Köken izleme analizleri üçüncü bölünme ile, üçüncü bölme blastomerlerin her biri özel olarak üç germ tabakaların bir ya da germ hattı 6 (Şekil 2B) meydana getirmek için mahkum olduğunu göstermiştir. Bu veriler, birlikte mikroarray veri 22, hücre soy 6,23 analizleri ve blastomer izolasyon deneyleri 4 gelişimsel potansiyelleri cel asimetrik miras yoluyla en azından bazı üçüncü bölünme blastomerlere için ayrılmış olduğunu ileri sürmüşlerdirl kader belirleyici. Hücrelerin yokluğu ile gösterildiği gibi duruma göre, (Parhyale hücre soyu terminoloji 6&#39;daki &quot;g&quot; olarak adlandırılır) germ hattı ön sekiz hücre aşamasında uzaklaştırılmış olan blastomere ablasyon deneylerde, embriyolar, geç gelişim evrelerinde 4 ° germ hücreleri yoksun En metazoans 24 bir germ çizgi işareti olan protein Vasa, ifade. Bunun aksine, somatik blastomere ablasyon deneyler göstermiştir ki P. hawaiensis embriyolar da önemli düzenleyici yetenekleri, sahip sekiz hücreli aşamada ablazeydi mezoderm veya ektoderm öncü blastomer kaderi kalan blastomerlerin 25 bazı torunları tarafından ele olabilir böyle. Nasıl düzenleyici hücre kaderinin yedek oluşabilir, ve somatik blastomerlere otonom hücre kaderi benimsenmesi ölçüde bilinmemektedir. Örneğin blastomere ablasyonu gibi deneysel embriyolojik teknikler Understan yararlı olabilirding göreli özerklik ve hücre kaderini belirleyen 26,27 arasında nonautonomy ve P. çalışmada ilgi bu nedenle hawaiensis embriyogenez. Ektodermal ve mezodermal soy düzenleyici değiştirilmesini gösterdi deneylerde, blastomer ablasyon enjeksiyon 28 ve fototoksik boyaların 25 sonraki uyarılması ile yapıldı. Bu teknik enjekte blastomer (ler) öldürmede etkili olsa da, tamamen embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Buna ek olarak, farklılıklar hücre soyu floresan soy izleyiciler 28,29 ile blastomerlerdir enjekte ederek embriyojenezin Gastrulasyon aşamalarında aracılığıyla toplanan verilerin, ve aynı embriyonik aşamalarında 23 geliştirilmesi yoluyla soğukkanlı blastomerlerdir izleyerek toplanan veriler arasında gözlenmiştir. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Daha önce hücre soyunun sonuçlarını yayınladı tek hücreler elle 23 ablazeydi hangi embriyoların analizleri. Ancak, erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerdir çıkarmak için gerekli olan hassas işlemleri henüz tam olarak tarif edilmemiştir. Burada P. toplanması için bir protokol mevcut hawaiensis embriyolar ve sekiz hücreli evre embriyo tek blastomer manuel ablasyon. Bu yöntemin amacı, hücresel davranışları ve embriyogenez ve post-embriyonik gelişimi sırasında, kalan hücrelerin hücre hayati yeterliliklerinin gözlem sağlayan, embriyo, hücre gövdesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktır. Bizim protokol germ hattı ön g (Şekil 2C) çıkarılmasını gösterir, ancak veya daha bölünme aşamaları blastomerlerin için, sekiz-hücre aşamasında herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prensip olarak, bu protokol tasarımlarıyla erken bölünme evresindeki embriyolar, tek hücreleri çıkarmak için uygulanabilirr holoblastically deniz omurgasız bölünmesi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Amphipod Parhyale hawaiensis dünya çapında tertidal deniz habitatlarda bulunan küçük kabuklu olduğunu. Geçtiğimiz on yıl içinde, Parhyale iyi okudu eklembacaklı model organizma Drosophila melanogaster yararlı bir dışgrup karşılaştırma sağlayarak, geliştirme laboratuar çalışmaları için umut verici bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila sinsityal bölünmeler aksine, Parhyale erken yarılmış holoblastic bulunmaktadır. Erken blastomerlerin enjekte tracer boyalar kullanılarak kader eşleme her üç germ tabakaları ve germ hattı sekiz-hücre aşamasına göre kurulan göstermiştir. Bu aşamada, üç blastomerler ektoderm doğuran mahkum olan, üç mezoderm doğuran mahkum ve geri kalan iki blastomerler sırasıyla endoderm ve mikrop hattının ön vardır. Ancak, blastomer ablasyon deneyler Parhyale embriyoları da önemli düzenleyici capabiliti sahip olduğunu göstermiştirsekiz hücreli aşamada ablasyon Blastomerlerin kaderi kalan blastomerlerin bazı soyundan tarafından satın alınabilir es, öyle ki. Enjeksiyon ve fototoksik boyalar ya da manuel ablasyon sonraki aktivasyonu: Blastomer ablasyon daha önceleri, iki yöntemden biri ile tarif edilmiştir. Ancak, photoablation blastomerlerdir öldürür ama embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Burada canlı ve sağlam kalan blastomerlerdir tutarken hücre gövdesinin tamamen çıkarılması için gerekli olan araçları ve manuel işlemleri gösteren, Parhyale embriyoların sekiz-hücre evresinden itibaren bir blastomerlerin elle çıkarılması için bir protokol mevcut. Bu protokol, sekiz hücre evresinde veya diğer yarılma erken aşamalarında blastomerlerin için bir Parhyale hücreye uygulanabilir. Buna ek olarak, prensip olarak, bu protokol erken Clea için geçerli olabilirDiğer holoblastically yaran Omurgasız deniz vage sahne embriyolar.

Bir üçüncü bölge P. başarı ablasyon sonra Bu protokol daha önce tarif edildiği gibi, kısmen kesilip alınmış blastomer tarafından işgal edilen alanı işgal edecek şekilde hawaiensis micromeres, kalan micromeres yavaş yavaş hafif konumlarını kayması. G kaldırıldığında Örneğin, blastomerler MR komşu ve biraz vardiya ve g ile doğrudan temas (Şekil 2A ve 2C karşılaştırın) eskiden olduğu yanal hücre sınırlarını paylaşmak için gelmek ml. Başarılı ablasyon ardından, kalan blastomerlerin dördüncü bölünme girmeden önce (en az bir saat) hafif bir gecikme görüntüleyebilir, ancak daha sonra aynı bölünme modellerini ve en az gastrulasyon kadar unmanipulated embriyolar görüntülenen olacağını zamanlama 23 aşamaları devam etmelidir . Dört micromeres, kalan blasto soyundan herhangi takiben ablasyonmeres ayrıca &quot;rozet&quot; ve Gastrulasyon hareketleri 23&#39;ün başlatılması olarak adlandırılan bir özellik hücre düzeneğinin oluşumu dahil olmak üzere normal hücre bölünme zamanlama ve davranışları, göstermelidir. Kuluçka üzerine ablasyon prosedürü ve tam embriyojenezi hayatta embriyo oranı başlangıçta tekniği yeni bir araştırmacı için yaklaşık% 10 mertebesinde olabilir, ama tecrübeye sahip yaklaşık% 50 oranında ortalama olmalıdır ve% 75 kadar yüksek olabilir blastomere ablasyon ardından embriyoların uygulama ve uyanık dikkatle. Tablo 1. ablazeydi embriyo sayıları ve hayatta kalma oranlarının ilk birkaç için genellikle en az% 80 gösteren aynı araştırmacı tarafından yapılan ardışık ablasyon deneyler bir dizi için sağkalım oranları örneklerini gösterir gün araştırmacı artan deneyimi ile artış kuluçka kadar ablasyon, ve hayatta kalma oranlarını takip. Eksik blastomere kaldırma olacaktırhala embriyonun koryon içinde yer alan membran bileşenleri, sitoplazma, ya da yumurta sarısı granülleri, içerebilir ablazeydi olmalıdır blastomer kalıntıları görülmeye değerdir. Iki saatten fazla, ya da düzensiz bölünme desen veya kalan blastomerlerin soyundan hücresel davranışları dördüncü bölünme bir gecikme, aynı zamanda başarısız ablasyon gösterebilir. Bu olgular ablasyon işlemi sırasında diğer blastomerlere neden hasar sonucu olabilir. Ablasyon ekran morfolojik anormallikler için hedeflenen bir veya hasar daha sonra tekrar parçalanır dışındaki blastomerler olasılıkla ablasyon işlemi sırasında diğer blastomerlere neden olmuşsa. Hücre kaderinin belirteçleri kaderleri düzenleyici değiştirme tabi olmayan belirli üçüncü bölünme blastomer soyundan etiket varsa, başarılı ablasyon sonra ek onay, bu belirteçlerin Follo ile etiketleme manipüle embriyolar elde edilebilmektedirkanat ablasyon. Bazı mezodermal ve ektodermal toprakları belirteçleri embriyogenezin 8,14,15 geç safhalarda orta ila tarif edilmiştir. Bu germ hem de kurucusu blastomerlerin 25 birinin kaybı üzerine düzenleyici yerine geçmesi çünkü Ancak, bu belirteçler açıkça ablasyon başarılı blastomere olmadığını belirlemek olmayabilir. Germ hattı ön-madde g durumunda, onun tüm soyu vasa transkript 12 ve embriyojenez boyunca 4 protein ekspresyonu ile işaretlenmiş ve erken tohum bandı, en az olmaması ile germ hücreleri ablasyon edildiği g embriyolar 4 aşamaları vardır. G Başarılı ablasyon böylece embriyojenezin sonraki aşamalarında ablasyonu (Şekil 5) Aşağıdaki vaza ifadeyi inceleyerek teyit edilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-wid<html> src = &quot;/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg&quot; /&gt;: fo th = &quot;5in&quot; Şekil 1. Yetişkin Parhyale kadın ve embriyolar hawaiensis. (A) bir yetişkin dişi P. Yanal hawaiensis, coxal plakaları (oklar) gösteren, göğüs uzantılar (ok başları) ve şeffaf coxal plakaları (mavi noktalı anahat) aracılığıyla, pembe veya mor küremsilerden gibi görünen embriyolar. Anterior solunda. Bir yetişkin dişi P. (B) alttan görünüşü hawaiensis yavru kese (mavi noktalı anahat) görünür embriyoları gösteren. Anterior solunda. Yavru kese salınan (C) embriyolar FASW normal gelişir. . S1 tarama aşamaları arasında değişen çeşitli gösterilmiştir, Browne ve ark 5 Ölçü bar = 1 (A) &#39;mm ve (B)&#39; ye göre aşamalı, (C) &#39;de 500 um.51073/51073fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig2.jpg" /> Şekil 2. P. sekiz hücre aşamasında embriyoların hawaiensis. (A) dört micromeres (küçük hücre) ve dört macromeres (büyük hücreleri) ihtiva eden, (aşama S4 5) unmanipulated embriyonun sekiz-hücre aşamasına canlı. (B) floresan marker 6 göre izleme soyu ortaya koyduğu gibi, bir vahşi tip embriyo Tüm blastomerlerin hücre hayati belirtme gösteren sekiz hücreli evre embriyo şematik. (C), mevcut protokolü kullanılarak kaldırıldı g blastomer olmuştur S4 evresindeki embriyonun canlı. Daire bölge eskiden g blastomer tarafından işgal bölgesini göstermektedir;Kalan micromeres hafifçe g ablasyon sonucu pozisyon değiştirdi. Ölçeği (A) = 250 mikron bar ve (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51073/51073fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig3.jpg" /> Şekil 3,. Kuluçka kesesinden embriyolar çıkarılması için kullanılan tel araç. Burada gösterilen aracı hafif bir eğri forseps kullanılarak tanıtmak için, daha sonra, bir Pasteur pipeti dar ucuna bir tungsten teli yerleştirilmesi ve hafifçe yerinde mühür teli, cam eritme tarafından yapıldı tel haline. Damızlık kese embriyolar kaldırmak için uygun diğer araçlar köreltilmiş forseps ya da mühürlü ve düzeltti sonunda bir cam kılcal bulunmaktadır. Sc= 1 cm ale bar. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig4.jpg" /> Şekil 4. Cam iğne ablasyon işlemi sırasında blastomerlerdir delme için kullanılır. Burada gösterilen iğne parametreleri 2 x bir program kullanarak bir Sutter P97 iğne çektirmesi çekildi (ısı = 566, = 100 çekin, hız = 20, zaman = 250) + 1 x (ısı = 566, zaman = 250, hız = 100, = 100 çekin). Diğer araçlar veya programları sürece burada gösterilenden ile aynı genel şekle sahip olarak, ayırma için müsait iğneler çekmek için kullanılabilmektedir. Ölçek çubuğu = 1 cm. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig5.jpg" /> Şekil 5,. Blastomere a sonuçlarını değerlendirmekblation Embriyogenez sırasında. (A) kısa bir anti-Vasa immünoboyamayla (ok başları) tarafından etiketli germ hücreleri gösteren, kuluçka önce vahşi bir türü aşama S29 embriyonun Gonad bölgesi. Burada kullanılan bir anti-Vasa antikoru P. özgüdür hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes ve Extavour, yayınlanmamış veri). (B) gonad bölgesi (ok başları) belirli anti-Vasa sinyalinin olmaması ile ortaya koyduğu gibi germ hücreleri olmadığını gösteren sekiz hücreli aşamada uzaklaştırılmıştır g blastomer olan bir aşama S29 embriyo Gonad bölgesi. Ölçeği (A) = 100 mikron bar ve (B) için de geçerlidir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51073/51073fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ablasyon yuvarlak </td><td> # Ablasyon </td><td> # (%) Atlattı% 50 gelişme </td><td> # (%)% 90-100 gelişimine atlattı </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 49 </td><td> 41 (83.7) </td><td> 6 (12.2) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 48 </td><td> 46 (95.8) </td><td> 17 (35.4) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 31 </td><td> 25 (80.6) </td><td> 22 (71.0) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 97 </td><td> 72 (74.2) </td><td> 56 (57.7) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 108 </td><td> 100 (92.6) </td><td> 65 (60.2) </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 50 </td><td> 36 (72.0) </td><td> 37 (74.0) </td></tr><tr><td> TOPLAM </td><td> 383 </td><td> 320 (83.6) </td><td> 203 (53.0) </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Temsilci ablasyon sağkalımistatistik. micromere ablasyon sonrasında, hayatta kalma (25 º C&#39;de 10-12 gün) (25 º C&#39;de 5-6 gün) gelişiminin ilk% 50 içinde ve daha sonra 90-100% gelişimine hem de gol oldu. Ablasyon 1-6 sekiz aylık süre boyunca kronolojik sırayla tek bir araştırmacı (AR Nast) tarafından gerçekleştirilen deneyler temsili örnekleridir yuvarlar. Tecrübesi ile% 90-100 geliştirme artış, burada sağkalım oranları gösterildiği gibi Araştırmacılar, bulmak gerekir.

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.

Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K Görüntüleme.  Harvard University.  Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder. 

Video: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Biyoloji

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler