Agradecemos Rayhan Arif e Hassaan Shahawy para trabalho de câmera, Tripti Gupta e Frederike Alwes de assistência refinar a técnica de ablação de células, e os membros do laboratório Extavour para feedback sobre os dados, vídeo e manuscrito. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Instituto de Células-Tronco de Harvard (Seed número Grant SG-0057-10-00) da Fundação Ellison Medical (New Scholar Award número AG-NS-07010-10) a CGE, e prêmios do Programa Escola de Pesquisa de Harvard para ARN.

Comentários que podem ser úteis na execução de certas etapas são indicados em itálico. 1. Dia 1: Preparação de Materiais <ol><li> Prepare os seguintes materiais (ver Tabela de Materiais e Equipamentos): <ul><li> 15 cm e 22 cm de pipetas de Pasteur </li><li> Escriba Diamante </li><li> Filtrou água do mar artificial (salinidade entre 0,0018-0,0020) contendo 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de uma solução de estoque de 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina (1:50 de uma solução de estoque contendo 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 mg / ml de estreptomicina) </li><li> filtrada água do mar artificial (salinidade entre ,0018-0,0020) sem aditivos </li><li> um recipiente de plástico grande para casais de habitação (pelo menos 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> pequeno (3 cm ou 5 cm), placas de Petri forradas com Sylgard </li><li> pequena (3 cm ou 5 cm), os pratos de Petri </li><li> um vidro de relógio ou de vidro multi-bem placa </li><li> fórceps (usamos uma pinça sem corte derivado from de idade Dumont # 5 fórceps que foram danificados acidentalmente em outros procedimentos laboratoriais, os quais têm reaproveitado utilizando uma pinça de pedra de afiar para garantir que as extremidades das pinças são lisas, que ambos os dentes são do mesmo comprimento, e que eles não têm pontas afiadas. Fórceps extremamente fina, como novas Dumont # 5 fórceps, são indesejáveis, pois podem ferir os embriões e / ou fêmeas). </li><li> uma pipeta Pasteur com o fim arregalou (veja o passo 1.2 abaixo) </li><li> uma ferramenta de recuperação de embrião constituído por um fio de tungsténio curvado fino incorporado na extremidade mais fina de uma pipeta de Pasteur (poderia ser substituída por uma alternativa implementar; ver 1.3 abaixo) </li><li> uma pipeta de boca, com uma pequena abertura (veja o passo 1.4) </li><li> uma agulha de vidro feito de um capilar de vidro puxado (veja o passo 1.5) </li></ul> Não há materiais tóxicos para os seres humanos são utilizados neste protocolo. No entanto, os pesquisadores devem garantir que eles usam luvas ou outras vestimentas de proteção, conforme exigido pelo guidel gestão de riscoines da sua instituição. </li><li> Para fazer com que a pipeta Pasteur alargado, primeiro pontuação em torno de uma pipeta de Pasteur 15 centímetros no ponto em que a pipeta começa a diminuir com um estilete de diamante, embrulhar a região marcado da pipeta numa toalha de papel Kimwipe ou para proteger os dedos, e, em seguida, cuidadosamente romper a ponta na linha de pontuação. Segure a extremidade quebrada da pipeta sobre a chama do queimador de Bunsen por alguns segundos para suavizar as bordas. A abertura deve ser ligeiramente mais estreito do que a largura máxima da pipeta. </li><li> Para fazer com que a ferramenta de dissecação de arame de tungsténio, inserir um fio de tungsténio para dentro da extremidade de 15 centímetros uma pipeta de Pasteur de vidro, e mantenha rapidamente ao longo de um queimador de chama de Bunsen para fundir o vidro, a fixação do fio no lugar. Use uma pinça de curva suavemente a extremidade do fio para uma forma de gancho. Ver Figura 3 para um exemplo de uma forma adequada para esta ferramenta. </li><li> Para fazer uma pequena abertura para a pipeta de boca, puxe a ponta fina de uma pipeta Pasteur 22 centímetros em duas peças over uma chama, e quebrar a ponta da ponta pequena. Inserir a extremidade do suporte da pipeta a boca. </li><li> Fazer a agulha de vidro que vai ser utilizado para perfurar os blastómeros de interesse durante o processo de ablação com um extractor de agulha. Uma agulha em forma adequada é mostrado na Figura 4. Esta agulha foi retirado em um extrator de agulhas Sutter P97 usando um programa com os parâmetros 2x (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 20, tempo = 250) + 1X (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 100, time = 250). O programa e instrumento específico usado para fazer a agulha pode variar, mas a agulha deve ter uma ponta fina, mas também ser resistente o suficiente para não quebrar quando empurrado contra o córion do embrião. </li></ol> 2. Dia 1: Casais Gathering Parhyale Acasalamento <ol><li> Use a pipeta Pasteur ampliou (passo 1.2 acima) para coletar acasalamento P. casais hawaiensis do grande recipiente de cultura, e transferi-los para um recipiente contendo separado cinclinar-se a água do mar artificial. Não é necessário que esta água do mar ser filtrada. É melhor recolher pares conjugadas no fim da tarde e deixar os casais à temperatura ambiente (20-23 ° C) durante a noite, de modo que, na manhã seguinte, a maioria dos embriões foram recentemente fertilizados e depositado, e, assim, a clivagem inicial fases apropriado para ablação. Reúna pelo menos 20 pares de acasalamento para assegurar que algumas fêmeas estará carregando embriões em estágio inicial de clivagem pela manhã seguinte. </li></ol> 3. Dia 2: Encontro Parhyale Embriões <ul><li> Na manhã seguinte, filtrou-infundir água do mar artificial (FASW) com CO 2. Algumas das mulheres terá nadado livre de seus homens durante a noite, recolhendo estas fêmeas separados e anestesiar-los em FASW / CO 2. Os restantes machos desemparelhados podem ser removidos do recipiente par de acoplamento e devolvido para a grande cultura. Pares de acasalamento restante pode ser guardado para coleta de embriões mais tardedurante o dia ou no dia seguinte. </li><li> Transferir uma única fêmea anestesiado transportar embriões para um vidro de relógio em FASW / CO 2. Todas as fêmeas separados, provavelmente, tenham depositado os ovos, que será visível a olho nu, como rosa pálido ou esferóides roxo através das placas coxal transparentes das mulheres (Figura 1A). Para determinar se os embriões estão em estágios iniciais de clivagem e, portanto, apropriado para a ablação de blastômeros, o pesquisador terá que remover os embriões da bolsa ninhada e examiná-las sob um microscópio. </li><li> Visualizando o procedimento sob um microscópio de dissecação, segure as placas da coxa ao longo de um lado do corpo com uma pinça. Os embriões serão visíveis na bolsa ninhada entre essas placas ventral da coxa (Figura 1B). </li><li> Insira a ferramenta de arame fino e curvo (Figura 3; passo 1.3 acima) na extremidade posterior da bolsa ninhada, e levante cuidadosamente o fio no final anterior da bolsa incubadora para separar a ninhadarevestimentos bolsa (estes são modificados apêndices ventrais chamados oostegites 30), abrindo a bolsa e soltando os embriões. Os embriões que estão dentro da primeira hora ou assim de ser colocado estão todos fechados dentro de uma membrana muito fina e transparente, que será facilmente perturbada pela ferramenta de arame, esta membrana desaparece por cerca de 2-3 horas após a postura de ovos, e os embriões não se limite uns com os outros ou para a fêmea de qualquer forma a partir deste ponto em diante todo embriogênese. Se os investigadores achar inconveniente ou difícil de manobrar a ferramenta de arame curvo para remover os embriões a partir da bolsa de ninhada, uma alternativa pode ser usado implementar, enquanto os movimentos são suaves e sem pressão dura é aplicado ao embrião ou ao marsúpios. Outras ferramentas apropriadas para a remoção de embriões da bolsa ninhada incluem pinças embotados ou um capilar de vidro com uma extremidade selada e suavizada. </li><li> Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para liberar água através da bolsa incubadora abriu, empurrando para fora tele embriões, o qual deve assentar no fundo do vidro de relógio. Transfira a fêmea para limpar FASW (sem CO 2) para permitir a recuperação antes de reintroduzir-la para a cultura principal. Várias fêmeas podem ser colocados no mesmo prato de recuperação, mas permitir que as fêmeas para se recuperar totalmente antes de devolvê-los à cultura principal, como eles podem ser comidos por outros animais, se eles ainda estão parcialmente anestesiado. </li><li> Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para transferir os embriões para uma placa de Petri com FASW limpo e visualizar ao microscópio para determinar o seu estágio embrionário. Embriões separados que estão na terceira clivagem (fase 4 5), que são adequados para este procedimento. Deve também ser possível aplicar este protocolo para qualquer fase clivagem antes da formação do disco germe (encena 07-08 maio). </li></ul> 4. Dia 2: ablação de células individuais <ol><li> Preencha Sylgard-alinhado placa de Petri com uma camada superficial de FASW. Use um inalterado 15 centímetros Pasteur piPette para transferir um único embrião para a placa. </li><li> Usando fórceps rombas, rolar suavemente o embrião para identificar a célula a ser cauterizado (Figuras 2A e 2B). A linha germinal precursora g pode ser identificada como sendo a menor micrômetros, que fica no topo da menor Mav macromere. Além disso, g não contactar directamente a célula en, que é o micrômetros em frente, como os micrômeros mesoderme precursoras ml e share mr uma borda de célula no meio do embrião. Mr é a blastomere à direita de g, e mL é o micrômetros à esquerda de g. Os macromeres irmã de mr, ml, e en são os precursores ectoderma Er, EL, e Ep respectivamente. </li><li> Com uma pinça na ABLt lado, se o pesquisador é destro (ou na mão direita se o pesquisador é canhoto), orientar o embrião com a célula de interesse para a direita (ou à esquerda se o pesquisador é canhoto) e agarrar suavemente o embrião entre a pinça para estabilizá-la. </li><li> Usando uma agulha puxada vidro (passo 1.5 acima, a Figura 4), ​​punção suavemente a célula de interesse. Não inserir a agulha demasiado longe, de modo a não empurrar a agulha para dentro das células vizinhas ou abaixo da célula de interesse. A agulha tem apenas para perfurar o cório e membrana celular subjacente, e não precisa de estender profundamente para dentro da célula a ser cauterizado. </li><li> Troque a agulha usada para perfurar o embrião para o final de vidro de uma pipeta de boca com um bom puxado ponta da pipeta Pasteur (passo 1.4 acima). Segurar a ponta da pipeta para fechar o orifício criado na célula de interesse, e aplicar o vácuo muito suave. </li><li> Muito aperte delicadamente o embrião com a pinça. À medida que o conteúdo do blastomero é empurrado para fora do córion através do orifício criado na etapa 4.4, sugá-lo para a pipeta boca para permitir uma visão desobstruída do embrião. Se o orifício for suficientemente grande, o núcleo da célula perfurado pode ser visto a emergir também. Esta é uma boa verificação para certificar-se o conteúdo da célula inteiros foram removidos e não pode ser regenerada. </li><li> Observar atentamente o embrião como blastômeros de interesse é removido. A borda da célula perfurado vai recuar em direção ao buraco no córion, tornando as intersecções das células subjacentes visíveis. Continuar a aplicar pressão até que todo o blastómero de interesse tenha sido removido. Use uma pinça para a implantação do embrião de lado a lado e confirmar visualmente que todo o blastômeros de interesse é ido. </li><li> Usando um inalterado 15 centímetros pipetas de Pasteur, transferir o embrião para limpar FASW + (FASW + 1 mg / mL de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Levante embriões ablated-blastômeros em poços individuaisde um ambiente limpo placa 48 poços em FASW +, mudando 50% da FASW suplementados com antibiótico + diária. Em nossas mãos embriões sobreviver e se desenvolver bem, mesmo após a ablação, em um intervalo de temperaturas 18-28 º C. Os investigadores devem elevar seus embriões a uma temperatura para a qual eles têm uma superfície limpa (mas não necessariamente estéril) em que para levantar os embriões com o mínimo de perturbação. Para ser capaz de comparar o tempo dos eventos de desenvolvimento em embriões ablated-blastômeros com controles, nos referimos ao leitor a informação encenação de desenvolvimento detalhado, que está disponível para os embriões criados a 18 º C 4, 25 º C 4, e 26 º C 5,6. </li></ol>

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	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós descrevemos um protocolo para a ablação manual e remoção física completa de blastômeros individuais de estágios iniciais de clivagem da anfípode P. hawaiensis. Demonstramos uso deste protocolo, removendo a única linha germinal célula precursora g de uma fase de embrião de oito células, e mostrar que a ablação tem sido bem sucedida, confirmando a ausência de células-filhas g &#39;s na embriogênese mais tarde. Este protocolo pode ser usada para remover qualquer dos micrômeros do embrião nos estágios iniciais de clivagem. Para usar este protocolo para remover macromeres neste estágio, ou blastómeros na fase de primeira ou segunda clivagem, os utilizadores podem simplesmente aplicar as ligeiras modificações de criação de um orifício ligeiramente maior no cório, etapa 4.4, e a aplicação de pressão e de sucção para um tempo mais longo para remover o volume maior do conteúdo das células no passo 4.6. Descobrimos que após o uso deste protocolo, o desenvolvimento dos blastômeros restantes após a ablação é unafectadas com respeito a padrões de clivagem e de movimento de células, pelo menos, até ao momento da gastrulação 23. Este protocolo pode ser útil para a investigação continuou no potencial de desenvolvimento de blastômeros iniciais de clivagem neste anfípode. Muitas perguntas ainda precisam ser respondidas nesta área, inclusive porque algumas células, mas outros não podem mudar os destinos para substituir os de blastômeros cauterizado, eo momento preciso e mecanismos dessas mudanças reguladoras. O protocolo também pode ser modificado para acomodar a ablação de mais de uma célula, por simplesmente repetindo os passos 4,2-4,7 sucessivamente dos blastómeros de interesse. É importante o uso de um microscópio estereoscópico de alta qualidade com iluminação adequada, a fim de visualizar e identificar corretamente os blastômeros iniciais de clivagem. Nós achamos que o incidente lateral, luz branca a partir de uma fonte de luz fria de fibra óptica é o mais útil para este fim. Luz incidente diretamente acima do SPECIMen cria reflexões que podem obscurecer as morfologias celulares e fronteiras, enquanto a luz transmitida não consegue penetrar a gema densa dos embriões e blastômeros são, portanto, difíceis de distinguir. É mais útil para o vidro de relógio ou placa de Petri contendo embriões para ser colocado sobre uma superfície preta, em vez de uma superfície de vidro branco ou transparente, uma vez que oferece melhor contraste para os embriões pálidos. Uma limitação do protocolo é que o blastômeros de interesse deve ser corretamente e inequivocamente identificado antes de iniciar o procedimento. Técnicas fotoablação seria mais útil para os pesquisadores novo para o sistema, uma vez que os embriões podem ser deixados para desenvolver por alguns ciclos de clivagem após a injeção do corante fluorescente 28, e a identidade do blastomere injetado confirmou pós-injeção, mas antes fotoablação, através da análise dos padrões dos descendentes celulares, que têm sido bem descritos na linha celular anterioridade analisa 6,23. Uma vez que os pesquisadores estão familiarizados com o P. embrião hawaiensis e pode identificar todos os blastómeros com confiança, a ablação manual descrita aqui pode ser utilizada para aplicações em que a remoção física completa de um blastómero, em vez de matar a célula sem a remoção de células mortas do corpo do embrião, é desejável. Este procedimento pode em princípio ser aplicada para remover blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem de outros crustáceos holoblastically clivagem ou outros invertebrados marinhos ou de água doce, cuja córions ou membranas de fertilização não pode ser facilmente removido. As modificações podem incluir o uso de meio de incubação com características de salinidade apropriados, e modificando a forma da agulha para acomodar membranas mais delicados (mais agulhas, mais finas) ou revestimentos embrionárias mais robustos (mais curtos, rapidamente afilados agulhas).

O Parhyale hawaiensis anfípode crustáceo emergiu na última década como um organismo modelo promissor e com grande potencial para uso em pesquisa evolucionária biologia do desenvolvimento 1. Entre os artrópodes, a maioria dos sistemas modelo são insetos, e os mais extensivamente estudado delas é a mosca da fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster é um membro da ordem de insectos Diptera, e, como tal, apresenta muitas características da embriologia que são derivadas em relação aos dos insectos basalmente ramificação 2. Além disso, os insetos são aninhados dentro do subfilo Pancrustacea 3, o que significa que os insetos têm seus parentes mais próximos dentro do grupo &quot;natural&quot; de longa data chamado pancrustaceans, e que este grupo é parafilético. Isto sugere que, além de basally ramificação modelos de insetos, estudos de outros crustáceos são obrigados a ter uma visão mais ampla da história evolutiva das características do desenvolvimento de ummecanismos moleculares nd que foram muito bem estudados em D. melanogaster. No entanto, muito poucos crustáceos têm sido bem estabelecido para a análise de laboratório experimental de desenvolvimento. O anfípode P. hawaiensis é um sistema de modelo de laboratório altamente tratável, passíveis de uma variedade de técnicas experimentais. Amphipods exibir muitas características únicas dentro de sua superordem pai Peracarida (funis de praia, Scuds, e camarões bem), e, portanto, são pensados ​​para ser relativamente derivado dentro deste grupo de crustáceos. No entanto, a relativa facilidade de manipulação genética embrionária e funcional oferecido pelo Parhyale fazer este anfípode uma adição valiosa para o estoque atual de organismos modelo. Como um animal de laboratório, P. hawaiensis oferece muitas vantagens. Os animais são tolerantes a uma ampla gama de temperaturas e salinidades, e sobreviver bem em grandes culturas de água do mar artificial 1. É fácil de distinguir entre omeen homens e mulheres com base em diferenças morfológicas claras, principalmente, das grandes, em forma de gancho, apêndices tronco anterior que os machos usam para agarrar as fêmeas durante o acasalamento. Para o trabalho embrionário e de desenvolvimento, P. hawaiensis tem várias características muito atraentes. Embriogênese dura aproximadamente 10 dias eo tempo para a maturidade sexual é cerca de seis semanas a 28 º C (mas note que Parhyale sobrevive bem em temperaturas que variam de cerca de 20-30 º C, e que a informação detalhada encenação de desenvolvimento está disponível para os embriões criados a 18 º C 4 , 25 º C 4, e 26 º C 5,6). Adultos acasalar durante todo o ano no laboratório, por isso embriões estão disponíveis em qualquer época do ano. As fêmeas colocam 2-20 (dependendo da idade das fêmeas) ovos fecundados num marsúpios ventral situada entre os vários primeiros pares de pernas (Figuras 1A e 1B), e isto é possível reunir estas embriãos muito cedo no desenvolvimento sem matar a fêmea ou danificar os embriões (Figura 1C). Os embriões sobreviver em água do mar artificial filtrada através de incubação, pode ser fixado para a expressão do gene ou posterior análise histológica 7, e uma tabela de preparação detalhada permite a identificação precisa do progresso através do desenvolvimento 5. Protocolos robustos têm sido utilizados para realizar a análise de expressão gênica por hibridização in situ 8-15 ou imunomarcação 4,16,17, knockdown funcional por interferência de RNA 13,15 ou morpholinos 12, e germinal estável transgênese 18. Usando o sistema de transgénese, expressão indutível 14 e 19 armadilha potenciador métodos também podem ser utilizados para investigar a função de genes em P. hawaiensis. Enquanto a sequência do genoma disponível publicamente não está disponível atualmente, um transcriptoma contendo transcrições produzido durante a ovogênese e embriogênese tem abelhan de novo reunidos e anotados 20, e depositado em um banco de dados pesquisável 21, facilitando a descoberta do gene. Em suma, o P. hawaiensis é um organismo modelo altamente tratável adequado para múltiplas abordagens experimentais e genéticas para a compreensão do desenvolvimento. Ao contrário das clivagens sinciciais de D. primeiros melanogaster, P. embriões hawaiensis clivar holoblastically após a fertilização (Figura 2A). Linhagem análise rastreio mostrou que a clivagem pela terceira, cada uma das terceira blastómeros de clivagem é especificamente destinada a dar origem a uma das três camadas germinais ou da linha germinal 6 (Figura 2B). Estes dados, juntamente com dados de microarranjos 22, linhagem de células analisa 6,23, e as experiências de isolamento de blastômeros 4 sugeriram que os potenciais de desenvolvimento são segregados para pelo menos alguns terceiros blastômeros de clivagem por herança assimétrica de cell determinantes sorte. Deste modo, em experiências de ablação blastómero na qual o precursor de linha germinal (denominado &quot;g&quot; no Parhyale linhagem celular nomenclatura 6) foi removida na fase de oito células, os embriões não tinham células germinais em quatro estágios de desenvolvimento posteriores, como indicado pela ausência de células expressando a proteína vasa, que é um marcador de linha germinal na maioria dos metazoários 24. Em contraste, as experiências de ablação blastômeros somáticas mostrou que P. embriões hawaiensis também possuem capacidades regulatórias significativas, de modo que os destinos de mesoderme ou ectoderma blastômeros precursoras cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes 25. Como substituição destino celular regulador pode ocorrer, ea extensão da adoção destino celular autônoma por blastômeros somáticas, permanece desconhecida. Técnicas embriológicas experimentais tais como a ablação blastomere pode ser útil em entending a autonomia relativa e nonautonomy de decisões destino de células 26,27 e são, portanto, de interesse no estudo da P. embriogênese hawaiensis. Nos experimentos que demonstraram substituição regulador da ectodérmicas e mesodérmicas linhagens, ablação blastomere foi realizada pela injeção de 28 e excitação subseqüente de corantes phototoxic 25. Embora esta técnica seja eficaz em matar a blastomere injectado (s), que não remover completamente o corpo da célula morta do embrião. Além disso, foram observadas diferenças entre os dados de linhagem de células recolhidas nos estadios gastrulação da embriogênese, injetando blastômeros com traçadores fluorescentes linhagem 28,29, e os dados recolhidos pelo seguinte blastômeros não perturbados por meio do desenvolvimento das mesmas fases embrionárias 23. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Nós já publicou os resultados de linhagem celular de embriões analisa em que células individuais foram extirpadas manualmente 23. No entanto, as operações delicadas necessárias para remover blastómeros individuais a partir de embriões na fase inicial de clivagem ainda não foram totalmente descritos. Aqui apresentamos um protocolo para coleta de P. embriões hawaiensis e ablação manual de um único blastômero de uma fase de embrião de oito células. O objectivo deste método é o de conseguir a remoção completa do corpo de célula do embrião, permitindo a observação dos comportamentos celulares e competências destino celular das células remanescentes durante a embriogénese e desenvolvimento pós-embrionário. Nosso protocolo mostra a remoção do precursor g linha germinal (Figura 2C), mas pode ser aplicado a qualquer célula na fase de oito células, ou para as fases de clivagem de blastómeros anteriores. Em princípio, este protocolo pode ser usado para remover as células individuais de embriões em estágio iniciais de clivagem outrr holoblastically clivagem invertebrados marinhos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

O hawaiensis anfípode Parhyale é um pequeno crustáceo encontrado em habitats marinhos intertidal em todo o mundo. Ao longo da última década, Parhyale emergiu como um organismo modelo promissor para estudos de laboratório de desenvolvimento, proporcionando uma comparação grupo externo útil para o modelo de artrópodes organismo bem estudado de Drosophila melanogaster. Em contraste com as clivagens sinciciais de Drosophila, os primeiros clivagens de Parhyale são holoblásticas. Mapeamento destino usando corantes traçadores injetados primeiros blastômeros têm mostrado que todas as três camadas germinativas e da linha germinal são estabelecidas pelo estágio de oito células. Nesta fase, três blastômeros estão fadados a dar origem ao ectoderma, três estão fadados a dar origem à mesoderme, e os restantes dois blastômeros são os precursores da linha endoderme e germe respectivamente. No entanto, as experiências de ablação blastômeros têm mostrado que os embriões Parhyale também possuem capabiliti regulador significativoes, de tal forma que os destinos de blastômeros cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes. Ablação blastomere tenha sido anteriormente descrita por um dos dois métodos: a injecção e a subsequente activação de corantes fototóxicas ou ablação manual. No entanto, fotoablação mata blastômeros, mas não remove o corpo de células mortas do embrião. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Aqui é apresentado um protocolo para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir da fase de oito células de embriões Parhyale, ilustrando os instrumentos e procedimentos manuais necessárias para a remoção completa do corpo da célula, mantendo as restantes blastómeros viva e intacta. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer célula Parhyale na fase de oito células, ou de blastómeros de outras fases de clivagem antecipada. Além disso, em princípio, este protocolo pode ser aplicável a clea precoceVåge embriões em estágio de outros invertebrados marinhos holoblastically clivagem.

Após a ablação bem sucedida de solteiro terceira clivagem P. micrômeros hawaiensis conforme descrito neste protocolo, os micrômeros restantes gradualmente mudar suas posições ligeiramente, de modo a ocupar parcialmente o espaço anteriormente ocupado pelo blastomere ablacionada. Por exemplo, quando g é removida, o vizinho blastômeros mr e ml deslocar um pouco e chegar a compartilhar as bordas das células laterais que estavam anteriormente em contato direto com g (comparar Figura 2A e 2C). Seguindo a ablação com sucesso, os restantes blastómeros podem exibir um ligeiro atraso (de menos de uma hora) antes de entrar em quarto de clivagem, mas devem, em seguida, retomar os mesmos padrões de clivagem e tempo do que eles teriam exibido em embriões não manipuladas, pelo menos, através de fases de 23 a gastrulação . Após a ablação de qualquer um dos quatro micrômeros, descendentes do blasto restanteMeres também deve mostrar sincronismo clivagem normal e comportamentos celulares, incluindo a formação de um arranjo celular característico chamado de &quot;roseta&quot; eo início dos movimentos de gastrulação 23. A percentagem de embriões que sobrevivem ao processo de ablação e embriogênese completa através de incubação pode, inicialmente, ser da ordem de cerca de 10% por um investigador novo para a técnica, mas com experiência deve média de aproximadamente 50%, e pode ser tão elevada como 75% com a prática e os cuidados atentos de embriões após a ablação blastômeros. Tabela 1 mostra exemplos de números de embriões cauterizado e taxas de sobrevivência para uma série de experimentos de ablação sucessivos realizados pelo mesmo pesquisador, mostrando que as taxas de sobrevivência são geralmente pelo menos 80% para os primeiros dias após a ablação, e que as taxas de sobrevivência até a eclosão aumento com o aumento da experiência do pesquisador. Remoção blastomere incompleta seriaevidenciado por ver restos da blastômeros que deveria ter sido extirpada, que podem incluir componentes de membrana, citoplasma, ou grânulos de vitelo, ainda situados no córion do embrião. Um atraso no quarto de clivagem de mais de duas horas, ou padrões de clivagem irregulares ou comportamentos celulares descendentes dos restantes blastómeros, também podem indicar insucessos. Estes fenómenos podem ser o resultado de danos causados ​​a outros blastómeros durante o procedimento de ablação. Se outros do que o alvo de exibição ablação anormalidades morfológicas ou desintegrar-se, em seguida, novamente danificar blastômeros provavelmente foi causado a outros blastômeros durante o procedimento de ablação. Se os marcadores destino celular estão disponíveis para marcar a descendência de blastómeros terceira clivagem específicos cujos destinos não estão sujeitos a substituição regulador, em seguida, a confirmação adicional da ablação com sucesso pode ser obtido pela rotulagem embriões manipulados com esses marcadores seguinasa da ablação. Marcadores de alguns mesodérmicas e ectodérmicas territórios têm sido descritas em meados de estágios finais da embriogênese 8,14,15. No entanto, porque ambas estas camadas germinais pode sofrer substituição regulador sobre a perda de uma das suas blastómeros fundadores 25, estes marcadores podem não inequivocamente determinar se ou não blastomere ablação foi bem-sucedida. No caso da linha germinal precursora g, todos os seus descendentes são marcadas pela expressão dos vasa transcrição 12 e proteína de 4 durante a embriogénese, e os embriões na qual g tem sido extirpadas as células germinativas falta, pelo menos, através de banda germe fases iniciais de 4. Ablação com sucesso de g pode, assim, ser confirmada por análise de expressão vasa após a ablação em fases posteriores do desenvolvimento embrionário (Figura 5). <img alt="Figura 1" fo:content-wid<html> th = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Adulto Parhyale hawaiensis feminino e embriões. (A) Vista lateral de uma fêmea adulta P. hawaiensis, mostrando placas coxal (setas), apêndices torácicos (setas) e embriões visíveis como esferóides rosa ou roxo através das placas coxal transparentes (azul linha pontilhada). Anterior é para a esquerda. (B) vista ventral de uma fêmea adulta P. hawaiensis mostrando embriões visíveis na bolsa ninhada (azul linha pontilhada). Anterior é para a esquerda. (C) os embriões liberados da ninhada bolsa desenvolver normalmente em FASW. Uma variedade de fases variando de S1 até incubação são mostrados, encenada acordo Browne et al 5 Escala da barra = 1 mm (A) e (B),. De 500 mM em (C).51073/51073fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig2.jpg" /> Figura 2. Oito embriões em estágio de células de P. hawaiensis. (A) Live fase de oito células (fase S4 5) embrião unmanipulated, compreendendo quatro micrômeros (células menores) e quatro macromeres (células maiores). (B) Esquema de um estágio de embrião de oito células mostrando designações destino celular de todos os blastômeros em um embrião do tipo selvagem como revelado por rastreamento linhagem com base em marcadores fluorescentes 6. (C) Live S4 fase de embrião que teve o g blastômeros removidos com o presente protocolo. A região circulou mostra a região anteriormente ocupado pelo g blastômeros, omicrômeros remanescentes mudou de posição um pouco como resultado da ablação de g. Barra de escala = 250 um em (A) e (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51073/51073fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig3.jpg" /> Figura 3. Fio usado para a ferramenta de remoção de embriões a partir da bolsa de ninhada. A ferramenta representada aqui foi feito através da inserção de um fio de tungsténio na extremidade estreita de uma pipeta de Pasteur e suavemente fusão do vidro para vedar o arame no lugar e, em seguida, utilizando um fórceps para introduzir uma curva suave para o fio. Outras ferramentas apropriadas para a remoção de embriões da bolsa ninhada incluem pinças embotados ou um capilar de vidro com uma extremidade selada e suavizada. Scale barra = 1 cm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig4.jpg" /> Figura 4. Agulha de vidro usado para perfurar blastômeros durante o procedimento de ablação. A agulha mostrado aqui foi puxado em um extrator de agulhas Sutter P97 usando um programa com os parâmetros 2 x (calor = 566, pull = 100, velocidade = 20 time = 250) + 1 x (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 100, time = 250). Outros programas ou instrumentos pode ser usado para puxar agulhas adequadas para ablação, contanto que eles sejam da mesma forma geral como a que é mostrada aqui. Barra de escala = 1 cm. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51073/51073fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51073/51073fig5.jpg" /> Figura 5. Avaliando os resultados de um blastômeroblation durante a embriogênese. (A) região Gonad de um tipo selvagem fase S29 embrião pouco antes da eclosão, mostrando células germinativas marcadas pelo anti-Vasa immunostaining (setas). O anticorpo anti-vasa usado aqui é específico para P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes e Extavour, dados não publicados). (B) região gônadas de um embrião fase S29 que tinha o g blastômeros removidos na fase de oito células, mostrando ausência de células germinativas como revelado pela ausência de sinal anti-Vasa específica na região das gônadas (setas). Barra de escala em (A) = 100 mm e aplica-se também a (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51073/51073fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ablação rodada </td><td> # Ablated </td><td> # (%) Sobreviverampara o desenvolvimento de 50% </td><td> # (%) Sobreviveram ao desenvolvimento 90-100% </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 49 </td><td> 41 (83,7) </td><td> 6 (12,2) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 48 </td><td> 46 (95,8) </td><td> 17 (35,4) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 31 </td><td> 25 (80,6) </td><td> 22 (71,0) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 97 </td><td> 72 (74,2) </td><td> 56 (57,7) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 108 </td><td> 100 (92,6) </td><td> 65 (60,2) </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 50 </td><td> 36 (72,0) </td><td> 37 (74,0) </td></tr><tr><td> TOTAL </td><td> 383 </td><td> 320 (83,6) </td><td> 203 (53,0) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Sobrevivência ablação Representanteestatísticas. Após ablação micrômetros, a sobrevivência foi marcado tanto no primeiro 50% do desenvolvimento (5-6 dias a 25 º C) e, em seguida, para o desenvolvimento de 90-100% (10-12 dias a 25 º C). Ablação rodadas 1-6 são exemplos representativos de experimentos realizados por um único pesquisador (AR Nast) em ordem cronológica ao longo de um período de oito meses. Os investigadores devem achar que, como mostrado aqui, as taxas de sobrevivência para aumentar o desenvolvimento 90-100% com a experiência.

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Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.

Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K visualizações.  Harvard University.  O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale. 

Vídeo: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Biologia

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Transfecção única célula em embriões de galinha

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes

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