Bu çalışma, Biyomedikal Malzemeler (BMM) enstitü araştırma programı uygulandı. BMM Ekonomik işler, Tarım ve İnovasyon Bakanlığı tarafından Hollanda cofunded edilir. Nederlandse Hartstichting mali katkısı minnetle kabul edilmektedir.

1. İnsan Vena Saphena Hücreleri Kültür <ol><li> Schnell ve arkadaşları tarafından protokole göre ikincil kullanım malzeme kurallarına uygun olarak bir donörden alınan vena safena magna,,. 9 hücreleri izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Altı plaka kültürüne 2 x 2 mm bir donör kesim parçalardan vena safena magna kısmından. Başına iyi 2 adet kullanın. Genel olarak yeterli hücreleri, sıvı nitrojen içinde 0.25 x 10 6 hücre ile yaklaşık 3 şişeleri doldurmak için elde edilebilir. HVSCs vimentin, desmin hiçbir ifade ve α düz kas aktini 10 ifade bir alt ifade göstererek, miyofibroblastlar olarak karakterize edilirler. Sonraki hücrelerinin sayısını arttırmak için sıvı azottan hücreleri çözülme için protokol başlar. </li><li> T75 doku kültürü şişesi içine bir tüpten hücreleri yer ve İleri DMEM, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), 5 ml penisilin / oluşan büyüme ortamı (GM), eklemestreptomisin ve 5 ml L-glutamax. 2-3 günde bir orta değiştirin. </li><li> Hücreler yaklaşık 14 gün sonra birleşik büyür. Store 0,5 sıvı azot içinde bir cam şişe içinde x 10 6 hücre, geçit 1 olarak adlandırılır. </li></ol> Not: Hücrelerin dondurularak HVSCs hasat zaman gerekli değildir, fakat sadece depolama için kullanılır. <ol start="4"><li> Bir T175 doku kültürü şişesi içine bir tüpten HVSCs yerleştirin ve GM ekleyin. 2-3 günde bir orta değiştirin. Hücreler yaklaşık 7 gün sonra birleşik büyür. Mağaza 3 ve sıvı azot içinde bir cam şişe içinde x 10 6 hücre, geçit 2 olarak anılacaktır. </li><li> Bir rollerbottle içine bir tüpten hücreleri yer ve GM ekleyin. 2-3 günde bir orta değiştirin. Hücreler, yaklaşık 8 gün sonra konfluent büyür. Bir rollerbottle yaklaşık 20-30 x 10 6 hücre içerir. Geçit 6 Kültür hücreleri. Hücre fenotip değişebilir, çünkü geçit 9 daha yüksek bir geçiş hücreleri kullanmayın. </li></ol&gt; 2. Fibrin tabanlı Doku Yapıları Mühendislik <ol><li> Sertleştirici (10:1) ile elastomer karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Velcro 7 x 3 mm dikdörtgen parçaları kesin. Bir çapraz oluşturmak için, ve cırt bant arasında 3 mm kare boşluk bırakmak esnek membran ile 6 kuyu kültür plaka içine tutkal Velcro,. </li></ol> Notlar: Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarı yüz. Ne zaman yapıştırma Velcro, sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapağı, iyi boyunca tutkal yayılmış yok. Kültür plakaları silikon membran dipleri olduğundan, plaka için kolay yapıştırma sağlamak için, esnek zarlar takviye için plaka altında bir şey kullanın. <ol start="2"><li> Tutkalın sertleştirme sağlamak için 60 ° C&#39;de bir fırın içerisinde gece boyunca silikon yapıştırıcı kurutun. 30 dakika boyunca inkübe kuyular ve% 70 EtOH eklenerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve wel tüm PBS kaldırmakls ve Velcro. 30 dakika UV altına ve kullanılıncaya kadar steril tutmak. </li><li> Doku mühendisliği GM oluşan orta (TM) ve L-askorbik asit 2-fosfat ve 130 mg hazırlayın. </li><li> TM, 1 mg / ml &#39;ε-amino kaproik asit (ACA) ekleyin. ACA kırıcı 11 fibrin önlemek için kültürün ilk 7 gün için kullanılır. Alternatif olarak, aprotinin kullanılabilir. </li><li> Yığın oluşumunu önlemek için, fibrinojen açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kümeleri fibrinojen olmadan daha kolay eriyecektir. ACA ile takviye edilmiş 10 mg gerçek protein / ml TM 7 arasında bir konsantrasyona fibrinojen çözülür. Steril filtre fibrinojen çözüm, birden çok filtre gerekebilir. Kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin. </li></ol> Not: Çok fazla köpük oluşumunu önlemek için yavaşça fibrinojen karışımı çözülür için. <ol start="6"><li> ACA ile takviye edilmiş 10 IU / ml &#39;TM 7 arasında bir konsantrasyona trombin çözülür. Kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin. </li> &lt;/ Ol&gt; Not: Buz Depolama trombin ve fibrinojen erken jelleşme önlemek için gereklidir. <ol start="7"><li> GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize. </li><li> , Fibrin tabanlı doku yapıları (doku mühendisliği kalp kapakçıkları 7 metotlara göre konsantrasyon) tohum için 15 x 10 6 hücre / ml &#39;kullanın. Tek bir jel 100 ul GOF El ve böylece 1.5 x 10 6 hücre oluşur. Yapılacaktır jellerin sayısı kadar santrifüj tüpleri ile sonuçlanan bir santrifüj tüpü içinde 1.5 x 10 6 hücre koyun. </li><li> 7 dakika 350 x g&#39;de hücreleri Santrifüj ve süpernatant atın. 50 ul trombin hücrelerin tekrar süspansiyon. Bu süspansiyon mavi floresan polistiren mikro 4 ul ekleyin. Bir şişe içinde, fibrinojen 50 ul koyun. Hücreleri ile 50 ul trombin almak için bir pipet kullanın. 100 ul pipet hacmi artırın. Trombin çözeltisi ile 50 ul Pipetfibrinojen ile şişenin içine hücreleri trombin ve fibrinojen karıştırın ve 100 ul karışımı almak. </li></ol> Not: floresan polistiren mikro görüntü analizi için dahili referans işaretleri kullanılmaktadır. Karıştırma trombin ve fibrinojen, dikkatli bir karışım, pipetleme hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek zaman. Hava kabarcıkları, fibrin jel delik neden olur. <ol start="10"><li> Içine ve Velcro şeritleri arasında jel karışımı pipetle. Fibrin jel için tipik jelleşme süresi, bir kez bileşenler karıştırılır, 20 sn &#39;dir. </li></ol> Notlar: karışım plaka pipetle önce jelleşme önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapın. Hücreleri ve boncuklar kullanmadan önce uygulama. <ol start="11"><li> ACA ile kültür TM eklemeden önce jelleşme izin vermek için, nemlendirilmiş bir% 95 hava /% 5 CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe süspansiyonlar. </li><li> Ilk 7 gün ACA 2-3 gün her ile TM değiştirin. Bir hafta ACA olmadan kültive edilecek sonra jeller yeterince stabildir. İlk haftadan sonra 2-3 günde TM değiştirin. Başına iyi TM 6 ml ekleyin. Günde 12 hücreleri görünüm için yeterli kolajen doğurmuştur. </li></ol> 3. Gerilme ve Kısıtlamalar içinde uygulamak Gerilme ve indükleyen değişiklikler <ol><li> Statik yük hücresi çekiş ve sıkıştırma 12 nedeniyle, doğrudan hücre tarafından uygulanır. Kollajen yeniden ikna etmek için, doku tek yönde iki cırt bant gevşek inşa kesti. Tek yönlü kısıtlamaları (Şekil 1A) ile sonuçlanır. Yapı daha sonra istikrarlı yeterli ve kollajen tevdi beri, 12. günde bu gerçekleştirin. </li><li> Flexcell FX4000T sisteminin kullanımı ile, esnek bir membran ile kültür plakalarının altına bir vakum uygulanarak siklik gerilme uygulanır. Yükleme mesajların üst (ki inci bir parçası olan üzerinde, bir kaide üzerine tabak koyunE döngüsel yükleme cihazı). Pompa, membran üzerine bir vakum uygulanır ve böylece altında yatan dikdörtgen sonrası üzerinde membran çeker. Doku haç biçimli ekleri olarak, membranın (Velcro ile) oluşturur ve dikdörtgen sonrası uygulanan siklik suşu (Şekil 1B) tek eksenli. </li><li> Başlangıçta, döngüsel gerginlik uygulama gün 6 başlamadan önce, ilk mekanik bütünlük elde etmek için 5 gün boyunca statik kültür kullanın. Vakum pompası için kumanda içine programı döngüsel bir leke protokolü. Örneğin tek eksenli yön 13 ile, daha önce kurulmuş aralıklı döngüsel gerginlik protokolünü kullanır. Bu, 3 saat dinlenme süreleri ile dönüşümlü olarak 3 saat dönemleri boyunca 0 dan% 5 suşu için süzme 1 Hz ile bir sinüs dalgası, bir aralıklı gerginlik oluşur. Bir uyumlu kollajen organizasyon uyararak, 7 gün boyunca bu döngüsel gerginlik protokol yapın. </li><li> Tipik olarak 12 gün sonra, bir HVSCs hizalanmış kolajen organ ürettilern. Hizalanmış bir kolajen kuruluş ulaşıldıktan sonra, orijinal gerilme yönüne dik olduğu, tek eksenli siklik suşu yönünü değiştirmek. 90 ° dikdörtgen mesajları çevirerek yapın. </li></ol> 4. Görselleştirme Hücreler ve Kollajen <ol><li> Hücre canlılığı veya kollajen oluşumu ile karışmaz probları ile aktif, gerçek zamanlı kollajen yeniden, etiket örnekleri görselleştirmek için. Floresan hücre sitoplazma ve kollajen leke prob kullanın. </li><li> Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak Alternatif olarak ikinci harmonik üretimi 780 nm ve 500-550 nm arasında algılama de uyarma ile otofloresansı 14, kullanarak kollajen yapıları görselleştirmek için kullanılabilir. </li><li> 3 saat dinlenme süresi boyunca periyodik olarak gergin örnekler için, kurulum ve inkübatör kültür plakaları çıkarın ve hücreleri ve kollajen görselleştirmek için bir konfokal lazer tarama mikroskobu taşırlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).</li><li>Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cyclic+distention+enhances+the+mechanical+properties+of+collagen-based+media-equivalents.">Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).</li><li>Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+and+axial+strain+additively+increase+matrix+remodeling+and+MMP-9,+but+not+MMP-2,+expression+in+arteries+engineered+by+directed+remodeling.">Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).</li><li>Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+multiscale+modeling+predicts+tissue-level+and+network-level+fiber+reorganization+in+stretched+cell-compacted+collagen+gels.">Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).</li><li>Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+tissue+development+under+biaxial+stretch+using+nonlinear+optical+microscopy.">Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).</li><li>Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+engineered+tissue+anisotropy+in+response+to+altered+loading+conditions.">Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).</li><li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+as+a+cell+carrier+in+cardiovascular+tissue+engineering+applications.">Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications.</a> Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).</li><li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs.">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).</li><li>Schnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+cell+source+for+cardiovascular+tissue+engineering:+venous+vs.+aortic+human+myofibroblasts.">Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts.</a> Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).</li><li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+human+tissue-engineered+heart+valves:+prospects+for+systemic+application.">Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application.</a> Circulation. , I152-I158 (2006).</li><li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro.">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).</li><li>John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+stiffness+regulates+fibroblast+behavior+in+collagen+gels.">Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).</li><li>Rubbens, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+straining+accelerates+the+development+of+tissue+properties+in+engineered+heart+valve+tissue.">Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).</li><li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+and+quantitative+analysis+of+collagen+production+by+chondrogenic+human+mesenchymal+stem+cells+cultured+in+chitosan+scaffold.">Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).</li><li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs.">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).</li><li>Merryman, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+heart+valve+interstitial+cell+stiffness+and+transvalvular+pressure:+implications+for+collagen+synthesis.">Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis.</a> Am. J. Physiol. 290, (2006).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+mechanotransduction+to+biologically+inspired+engineering:+2009+Pritzker+Award+Lecture,+BMES+Annual+Meeting+October+10,+2009.">From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).</li><li>Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension.">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).</li><li>van der Schaft, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Skeletal+Muscle+Tissues+from+Murine+Myoblast+Progenitor+Cells+and+Application+of+Electrical+Stimulation.">Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Hücre kalabalık fibrin yapıların tarif model sistem hücre ve kollajen çalışma için büyük bir potansiyele sahiptir (yeniden) organizasyonu (de Jonge ve ark. 15), doku mühendisliği amaçlar için de kullanılabilir örneğin. Ilk hücre taşıyıcı olarak fibrin kullanarak, fibrin bozulduktan sonra, bir doku hücreleri ve endojen matriste ile oluşturulur. Bu şekilde, hücre sınır sertlik 12 algılama veya gerginlik kaçınma gösteren, kasılma güçleri 16,17 uygulayarak, doğada, statik veya döngüsel ya zorlanma tepki uyarılır. Önemi: kolajen (yeniden) organizasyonu 18 çalışma önce Fibrin yapıları kullanılmıştır, ancak döngüsel gerginlik ve / veya uygulamak veya bu sunulan yöntemde olası her ikisi de bir zaman atlamalı bir şekilde, yapıları okuyan yeteneği ile. Bu model sistemde bilgiler sağlayan Velcro şeritleri, 19 daha önce kullanılmışama bu teknik esnek membran ile kültür plakaları ile birleştirerek uzun süre için döngüsel gerginlik uygulamak sağlar. Bu plakalarda kültür yapıları orta ve görselleştirme kolay eklenmesi ve çıkarılması için izin verir hala ekli ve steril ise. Bu, ilgili yeniden süreçleri gerçek zamanlı zaman süresi geçmiş ya da eğitim sağlar. Değişiklikler ve gelecekteki uygulamalar: Sistemin Geleceği uygulamaları integrin montaj veya sinyal müdahale metaloproteinazlar veya acenteleri ekleyerek örneğin, 3D yeniden süreci manipüle bulunabilir. Hücre ve kollajen (yeniden) organizasyonu eğitim sırasında katkı maddelerinin uygulama yanında, model sisteminin bileşenleri kolayca değiştirilebilir. Farklı hücre kaynakları, sağlıklı ve hastalıklı hücreler kolajen matrisi (kültürünün zaman içinde değişen göre) olgunluğu, ve yapının şekli ve boyutu özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir. Sistemi iyi sBunun yerine, halen kullanılmakta olan HVSCs bölgesinin diğer hücre kaynakları için uited. Biz gözlemlemek burada, bu ECFCs yönlendirmek HVSCs daha döngüsel gerginlik üzerine farklı onların üretilen kolajen, biz zaten (PlosOne, yayına kabul ECFCs) kültür endotel koloni oluşturan hücreler için bu sistemi kullandık. Bu tekniğin sınırlamaları: Mevcut model sistem bir sınırlaması, 15 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir hücre yoğunluğuna kullanılıyorsa yapı başına 1.5 x 10 6 hücre gerektiren, dokularda nispeten büyük boyutudur. Bu daha az kullanılabilir hücre kaynakları kullanılacak durumda bir sorun teşkil edebilir. Başka bir sınırlama (kalın) Velcro ek parça nedeniyle yapılar (yaklaşık 1 mm), mevcut kalınlığıdır. Bu Numunenin tamamının yalnızca bir bölümüne konfokal tarama sınırlar. Bu, mevcut dokuların çekirdek içinde hücre yanıtları görselleştirmek için yeterli doku, içinde maksimum 200 mikron derinliğe ulaşmak mümkündür, ama yapmakes bir tam kat bakış ile sonuçlanmaz. Adımları Kritik ve sorun giderme: model sistem Velcro bağlantı noktaları arasında doku oluşumu dayanır, bu da protokolde kritik adımları kapsar. Doğru kesme ve yapıştırma gereklidir ve özel ilgi döngüsel gerginlik uygulamak için çok önemlidir doku, uygun eki için Velcro şeritler halinde jel karışımının dikkatli pipetleme dikkat edilmelidir. Ayrıca belirleyici adımlar hücre kaynağı ve orta katkı seçiminde bulunabilir. Zaman farklı bir hücre kaynağı ile kültür optimizasyon gerekecektir. Şu anda, yapıları aşağılayıcı gelen fibrin durdurmak için, 7 gün boyunca ACA ile kültür. Farklı bir hücre kaynağı, aynı zamanda kollajen oluşumu ve fibrin bozunma hem ile ilgili farklı bir zaman dilimi ile sonuçlanabilir.

Kardiyovasküler dokular önemli bir taşıyıcı fonksiyonu var. Hücre dışı matriks kollajen liflerinin belirli bir içerik ve organizasyonda yük taşıyan özellikleri katkı ve genel doku gücü 1 hakim. Doku mühendisliği yapı mekanik klima kullanılır - genellikle (döngüsel) süzme rejimlerinin oluşan - doku organizasyonu ve mekanik özellikleri 2,3 artırmak için. Önceden tanımlanmış kollajen mimarisi ile doku oluşturmak için karmaşık doku geometrilerde gerginlik kaynaklı kollajen organizasyonu tam bir anlayış henüz elde edilmiştir değil. Bu gelişmekte olan dokularda kollajen yeniden bizim sınırlı bilgi kaynaklanmaktadır. Mevcut modeller ağırlıklı olarak statik zorlanma 4-6 kullanımı ile kollajen yeniden nihai net sonucu hakkında bilgi vermek. Burada etkisi altında, 3D, gerçek zamanlı bir şekilde kolajen (yeniden) örgütün çalışma sağlayan son derece ayarlanabilir model sistem sağlarStatik veya siklik suşunun. Doku yapıları yapı tüm kollajen endojen sağlamak, fibrin tabanlı. Yapıları hücre ve kollajen organizasyon görüntülenmiştir ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Bu hücreler dayalı olarak gelişmiş hücre dışı matriks üretim ve mühendislik kardiyovasküler dokularda 7 matris ve kurulan kullanım bozulmasina yeteneği, tanınırlar beri bu protokolde, İnsan Vena Saphena Hücreleri (HVSCs) için model sisteminin kullanımı anlatacağım de Jonge ve ark. 8 çalışmalarına

<table><tbody><tr><td>Culture plastic</td><td>Greiner</td><td></td><td>Includes culture flasks and pipettes</td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer and curing agent</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Velcro</td><td>Regular store</td><td></td><td>You can buy this at a regular store, only use the soft side</td></tr><tr><td>Bioflex culture plates</td><td>Flexcell Int</td><td>BF-3001U</td><td>Untreated</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid 2-phosphatase</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Amino Caproic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>0.45 syringe filter</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>Blue fluorescent, 10 &amp;mu;m diameter</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>Includes rectangular loading posts</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td><td>Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Needed for cell isolation</td></tr></tbody></table>

engineering fibrin-based tissue constructs from myofibroblasts and application of constraints and strain to induce cell and collagen reorganization

Kolajen içerik ve kollajen doku gelişmekte olan organizasyon lokal doku suşları ve doku kısıtlaması tarafından etkilenebilir. Doku mühendisleri önceden tanımlanmış kollajen mimarileri ile dokuları oluşturmak için bu ilkeleri kullanmayı hedefliyoruz. Son mimari dokusu kontrol etmek için kollajen yeniden tam yatan süreçlerin tam bir anlayış, ancak eksik olduğunu. Özellikle, küçük bir doku mekanik yükleme koşullarındaki değişikliklere yanıt olarak kollajen liflerinin (yeniden) yönlendirme hakkında bilinmektedir. Biz daha kollajen aydınlatmak için, iki taraflı-kısıtlı miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin yapıları oluşan, in vitro model sistem bir geliştirilen i yanıt olarak (yeniden) yönlendirme) tek eksenli statik yükleme koşulları ve ii iki eksenli geri alma) Çift yönlü-kısıtlı siklik tek eksenli yükleme Flexcell FX4000T yükleme cihazı kullanımı ile, yön değişikliği yükleme öncesi ve sonrası yapıları. Time-lapse konfokal görüntüleme vi için kullanılırbir tahribatsız şekilde kolajen (yeniden) yönlendirme sualize. Yapıları hücre ve kollajen organizasyon gerçek zamanlı olarak görüntülenmiştir olabilir, ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Model sisteminin çeşitli yönleri hücre kaynağı ya da sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin kullanımı gibi, ayarlanabilir. Katkı maddeleri örneğin MMP ekleyerek veya integrinler tarafından bloke edilmesi için, daha altta yatan mekanizmalar kollajen yeniden aydınlatmak için kullanılabilir. Bu yapı şekli ve büyüklüğü kolayca hücresi ve kollajen (yeniden) organizasyonu incelemek için bir çok ayarlanabilir modeli sistemi ile sonuçlanan, özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir.

Bu model sistem kültür miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin jeller için izin verir. Şekil 1A statik iki eksenli kısıtlar altında ilk kültüre bir doku gösterir. Doku kısıtlamaları tek eksenli statik kısıtlamaları oluşturmak için, iki kısıtlamaları fibrin jel kesim tarafından yayımlanan ve doku kompakt ve daha sonra remodels (Şekil 1A) vardır. Siklik bir suş için, doku hem de statik eksenli kısıtlamalar altında kültürlenir. 5 gün sonra, siklik tek eksenli gerilme (Şekil 1B) uygulanabilir. Kollajen yeniden yönlendirilmesi ikna etmek için, tek eksenli gerilme yönü dik yönde (Şekil 1B) için değiştirilebilir. Jel karışımı ile mikroküreler numaralı seribaşı, (Şekil 2) zaman atlamalı görüntüleme için önceden tanımlanmış yerlerde yerini değiştirmek için kullanılan bir rasgele bir desen, görüntülemek. Şekil 2A ve 2C hücreleri, kollajen ve boncuk bir görüntü gösterir. Bu aynı görüntüleri 3 gün (Figür taranıre 2B) ve sırasıyla 2 gün sonra (Şekil 2B). Hücreler ve kollajen desenler değişmiştir fakat boncuk desen hücreleri ve kollajen yeniden konumlandırmak için kullanılır. Konfokal mikroskopi (Şekiller 3 ve 4) ile görüntülenebilmektedir için yeterli miktarda endojen kollajen üretimini içinde 12 gün süre ile kültüre örnekleri. Iki eksenli statik kültür bir uyumlu kollajen yapısı (Şekil 4A ve B) bir çift eksenli kısıtlı doku sonuçlarına uygulanan rasgele bir kollajen organizasyonu (Şekil 3A) ve tek eksenli döngüsel gerginlik neden olur belirgin farklı kollajen organizasyon, statik ya da döngüsel kültür sonuçları kullanarak . Statik kısıtlamaları değiştirme veya döngüsel gerginlik yönünü değiştirirken Bu kollajen örgüt, zaman içinde incelenebilir. Statik kısıtlamaları rastgele bir yönelim (Şekil 3A gelen iki eksenli gelen tek eksenli, kollajen yönlendirme değişikliklere değiştirildiğinde) Bir hizalanmış oryantasyon (Şekil 3B) için. Siklik suşu doku (Şekil 4A ve C) yüzeyinde oryantasyon değişikliği indükler, ama 3 gün sonra, doku çekirdeği herhangi bir değişiklik (Şekiller 4B ve D) görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/51009/51009fig1.jpg" /> Şekil 1. Yapıları (A) bir yönde statik kısıtlamaları bırakarak kollajen yeniden düzenlemek için kullanılan iki eksenli kısıtlamalar altında kültüre, ya da (B) döngüsel gerginlik yön değiştirme. Yükleniyor mesajları noktalı siyah çizgiler ile gösterilir tarafından. Ölçek çubukları 3 mm göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51009/51009fig2.jpg" /> Şekil 2. Statik olarak, bu durumda, 3 boyutlu önceden tanımlanmış yerlerde taşınmaya boncuk desen kullanımı tipik bir örneğiKültür örnekleri. hücreler kırmızı, yeşil ve mavi boncuk kolajen gösterilmiştir., A ve C hücreleri, kollajen ve boncuk bir görüntü gösterir. Bu görüntüler, sırasıyla, 3 gün (B) ve 2 gün (B) daha sonra taranır. Boncuk desen hücreleri ve kollajen yeniden konumlandırmak için kullanılır. Ölçek çubuğu 50 mikron gösterir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51009/51009fig3.jpg" /> Iki eksenli kısıtlamaları (A) ve 7 gün içinde tek eksenli kısıtlamaları nedeniyle yeniden yönlendirilmesi ile 12 gün statik gerilme Şekil 3. R epresentative görüntüleri (B). Ölçek çubuğu 50 um gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/51009/51009fig4.jpg" /> Şekil 4. Yüzeyde siklik suşu boyunca 12 gün sonra Örnek görüntü (7 gün siklik suşu takiben statik 5 gün), (A) Ve ~ dokuya 60 um (B). Bir yüzey hücreleri ve kollajen (C) yeniden yönlendirme de siklik gerilme yönü (12 gün sonra), değişikliği ancak değişiklik sonra doku (D) çekirdek görülür sonra 3 gün.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization at JoVE.co

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

engineering-fibrin-based-tissue-constructs-from-myofibroblasts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Görüntüleme.  Eindhoven University of Technology.  Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir. 

Video: Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Biyomühendislik

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Biyoloji

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Mühendislik

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Hücresel Elektrik Mikroçevriminin Sonlu Eleman Modellemesi

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...