Diese Studie wurde im Rahmen des Forschungsprogramms der biomedizinischen Materialien (BMM) Institut durchgeführt. BMM wird vom niederländischen Ministerium für Wirtschaft, Landwirtschaft und Innovation kofinanziert. Der finanzielle Beitrag der Nederlandse Hartstichting gedankt.

1. Kultur der Menschenrechte Vena Saphena Cells <ol><li> Isolieren von Zellen, die Vena saphena magna, von einem Spender gemäß den Richtlinien für die Weiterverwendung Material erfasst, gemäß dem Protokoll von Schnell et al. 9 und speichert diese in flüssigem Stickstoff. Aus dem Teil der Vena saphena magna von einem Spender-Zuschnitte von 2 x 2 mm zur Kultur in einem Sechs-Well-Platte. Verwenden Sie 2 Stück pro Vertiefung. Im Allgemeinen genügend Zellen erhalten werden, um etwa 3 Ampullen mit 0,25 x 10 6 Zellen in flüssigem Stickstoff zu füllen. HVSCs als Myofibroblasten gekennzeichnet, durch die die Expression von Vimentin, keine Expression von Desmin und eine Subpopulation exprimieren α Glattmuskelaktin 10. Weiter starten Sie das Protokoll, um die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff aufgetaut, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen. </li><li> Legen Sie die Zellen aus einem Fläschchen in eine T75 Zellkulturflasche und fügen Wachstumsmedium (GM), bestehend aus Erweiterte DMEM, 50 ml fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin /Streptomycin und 5 ml L-Glutamax. Ändern Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Zellen wachsen etwa nach 14 Tagen konfluent. Shop 0,5 x 10 6 Zellen in einem Fläschchen in flüssigem Stickstoff, die als Durchgang 1. </li></ol> Hinweis: Das Einfrieren der Zellen ist nicht notwendig, wenn die Ernte HVSCs, ist aber ausschließlich für die Lagerung verwendet. <ol start="4"><li> Legen Sie die HVSCs aus einem Fläschchen in eine T175 Zellkulturflasche und fügen GM. Ändern Medium alle 2-3 Tage. Zellen wachsen nach ca. 7 Tage konfluent. Shop 3 x 10 6 Zellen in einem Fläschchen in flüssigem Stickstoff, die so genannte Passage 2. </li><li> Legen Sie die Zellen aus einem Fläschchen in eine rollerbottle und fügen GM. Ändern Medium alle 2-3 Tage. Zellen wachsen etwa nach 8 Tagen konfluent. Eine rollerbottle enthält etwa 20-30 x 10 6 Zellen. Kultur-Zellen bis zu Kanal 6. Verwenden Sie keine Zellen einer Passage über Kanal 9, da Zellphänotyp ändern kann. </li></ol&gt; 2. Engineering Fibrin-basierten Tissue Konstrukte <ol><li> Bereiten Silikonkleber durch Mischen des Elastomers mit dem Härter (10:1). Cut 7 x 3 mm rechteckige Segmente Klettverschluss. Kleben Sie das Klettband in einem 6-Loch-Zellkulturplatten mit flexiblen Membranen, eine Flanke zu bilden und einen eckigen Raum von 3 mm zwischen den Klettbändern verlassen. </li></ol> Hinweise: Verwenden Sie nur die weiche Seite des Velcro und das Gesicht dieser Seite nach oben. Beim Verkleben der Klettverschluss, decken nur den Klettverschluss mit Silikon kleben, kleben nicht im ganzen gut verteilt. Da die Kultur Platten Siliconmembran Böden haben, verwenden Sie etwas unterhalb des Well-Platte zur Verstärkung der flexiblen Membranen, leicht zu kleben, um die Platte zu gewährleisten. <ol start="2"><li> Trocknen der Silikonkleber über Nacht in einem Ofen bei 60 ° C, um Härtung des Klebers zu erreichen. Sterilisieren durch Zugabe von 70% EtOH in die Vertiefungen und Inkubation für 30 min. Spülen 3x mit PBS und entfernen Sie alle PBS aus der wells und der Klettverschluss. Setzen Sie unter UV für 30 min und bis zur Verwendung steril zu halten. </li><li> Bereiten Tissue Engineering Medium (TM), bestehend aus GM und 130 mg L-Ascorbinsäure-2-Phosphat. </li><li> 1 mg / ml ε-Aminocapronsäure (ACA) an die TM. ACA ist für den ersten 7 Tagen der Kultur verwendet, um das Fibrin aus erniedrigender 11 zu verhindern. Alternativ kann Aprotinin verwendet werden. </li><li> Um Klumpenbildung zu verhindern, erlauben Fibrinogen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen zu erreichen. Ohne Klumpen Fibrinogen wird leichter aufzulösen. Lösen Fibrinogen in einer Konzentration von 10 mg tatsächlichen Protein / ml TM 7 mit ACA ergänzt. Sterilfilter der Fibrinogen-Lösung, vielleicht mehrere Filter benötigt werden. Lagern auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> Hinweis: Um Fibrinogen vorsichtig mischen auflösen zu viel Schaumbildung verhindern. <ol start="6"><li> Lösen Thrombin in einer Konzentration von 10 IU / ml TM 7 mit ACA ergänzt. Lagern auf Eis bis zum Gebrauch. </li> &lt;/ Ol&gt; Hinweis: Lagerung auf Eis benötigt wird, um früh Gelierung von Thrombin und Fibrinogen zu verhindern. <ol start="7"><li> Trypsinize die Zellen, in GM und zählen erneut zu suspendieren. </li><li> Mit 15 x 10 6 Zellen / ml für die Aussaat die Fibrin-basierten Gewebe Konstrukte (Konzentration auf Methoden für das Tissue Engineering Herzklappen 7 basiert). Eine einzelne Gel besteht aus 100 ul gof el und damit von 1,5 x 10 6 Zellen. Setzen 1,5 x 10 6 Zellen in einem Zentrifugenröhrchen, was in vielen Zentrifugenröhrchen wie die Anzahl der Gele, die vorgenommen werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 xg für 7 min und den Überstand verwerfen. Die Zellen in 50 ul Thrombin. In 4 ul blau fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln zu dieser Suspension. Setzen Sie 50 ul von Fibrinogen in einem Fläschchen. Verwenden Sie eine Pipette zur Aufnahme der 50 ul Thrombin mit Zellen. Erhöhen Sie die Lautstärke der Pipette zu 100 ul. Pipettieren Sie die 50 ul Lösung von Thrombin mitZellen in das Fläschchen mit Fibrinogen zu mischen die Thrombin und Fibrinogen, und nehmen die 100 ul Mischung. </li></ol> Hinweis: Das fluoreszierende Polystyrol-Mikrokügelchen als interne Referenz-Markierungen zur Bildanalyse verwendet wird. Beim Mischen von Thrombin und Fibrinogen, verhindern die Bildung von Luftblasen durch vorsichtiges Pipettieren der Mischung. Luftblasen in Löcher im Fibringel führen. <ol start="10"><li> Pipettieren Sie die Gel-Gemisch in und zwischen den Klettbändern. Die typische Gelierzeit für die Fibrin-Gelen, wenn die Komponenten gemischt werden, ist in der Größenordnung von 20 Sekunden. </li></ol> Anmerkungen: Tun Sie dies so schnell wie möglich, um die Gelierung zu verhindern, bevor die Mischung in der Well-Platte pipettiert. Üben Sie vor Verwendung von Zellen und Perlen. <ol start="11"><li> Inkubieren Suspensionen für 30 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 95% Luft / 5% CO 2-Inkubator, um die Gelierung bevor Kultur TM mit ACA ermöglichen. </li><li> Ersetzen TM mit ACA alle 2-3 Tage für die ersten 7 Tage. Gele sind stabil genug, nach einer Woche ohne ACA kultiviert werden. Nach der ersten Woche ersetzen TM alle 2-3 Tage. In 6 ml TM pro Vertiefung. Am Tag 12 Zellen haben genügend Kollagen zur Visualisierung erzeugt. </li></ol> 3. Anwenden von Stamm und Inducing Änderungen in Stamm und Constraints <ol><li> Statische Belastung wird von den Zellen direkt durch Zellen Traktion und Verdichtung 12 angelegt. Um Kollagen Reorganisation zu induzieren, schneiden das Gewebe konstruieren lose aus zwei Klettbändern in eine Richtung. Dies führt zu Einschränkungen unidirektionalen (1A). Führen Sie diese am Tag 12, da das Konstrukt dann stabil genug und Kollagen abgelagert worden. </li><li> Anwenden zyklischen Beanspruchung durch Anlegen eines Vakuums an die Unterseite der Kulturplatten mit flexiblen Membranen unter Verwendung der Flexcell FX4000T System. Legen Sie die Platten auf einer Grundplatte, auf der Oberseite des Ladens Beiträge (die sind ein Teil der the zyklischer Belastung Gerät). Die Pumpe gilt ein Vakuum auf die Membran und damit zieht die Membran über dem rechteckigen Beitrag darunterliegenden. Durch die kreuzförmige Anhängen des Gewebes konstruiert, um die Membran (über den Klettverschluss) und die rechteckigen Beitrag die angelegte Spannung zyklisch uniaxial (1B). </li><li> Zunächst verwenden statischer Kultur für 5 Tage zu anfänglichen mechanischen Integrität zu erreichen, vor dem Aufbringen der zyklischen Belastung beginnend am 6. Tag. Programm ein cyclisches Fleck Protokoll in der Steuerung für die Vakuumpumpe. Zum Beispiel mit einem vorher festgelegten intermittierenden zyklischen Belastung Protokoll, mit einachsigen Richtung 13. Diese besteht aus einer intermittierenden Dehnung einer Sinuswelle mit 1 Hz, Pressen von 0 bis 5% Dehnung für die Dauer von 3 Stunden bei 3 h Ruheperioden abwechseln. Führen Sie diese zyklische Belastung Protokoll für 7 Tage, Induktion einer Organisation ausgerichtet Kollagen. </li><li> Typischerweise nach 12 Tagen HVSCs haben eine ausgerichtete Kollagen produziert organisaton. Nach einer ausgerichteten Kollagen Organisation erreicht wird, ändern die einachsigen zyklischen Belastung Richtung senkrecht zu der ursprünglichen Stamm Richtung. Tun Sie dies, indem Sie die rechteckigen Beiträge von 90 °. </li></ol> 4. Visualisierung von Zellen und Collagen <ol><li> Um eine aktive Echtzeit-Kollagen Umbau, Label Proben mit Sonden, die nicht mit der Lebensfähigkeit der Zellen oder die Bildung von Kollagen nicht stören zu visualisieren. Verwenden Sonden fluoreszierend Fleck Zytoplasma der Zelle und Kollagen. </li><li> Alternativ Erzeugung der zweiten Harmonischen mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet werden, um Kollagen-Strukturen mit Autofluoreszenz 14, mit einer Anregung bei 780 nm und Detektion zwischen 500-550 nm zu visualisieren. </li><li> Entfernen Sie die Kultur Platten aus dem Setup und dem Inkubator, der zyklisch gespannten Proben während der 3 Stunden Ruhezeit, und transportieren sie zu einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, um Zellen und Kollagen zu visualisieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).</li><li>Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cyclic+distention+enhances+the+mechanical+properties+of+collagen-based+media-equivalents.">Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).</li><li>Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+and+axial+strain+additively+increase+matrix+remodeling+and+MMP-9,+but+not+MMP-2,+expression+in+arteries+engineered+by+directed+remodeling.">Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).</li><li>Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+multiscale+modeling+predicts+tissue-level+and+network-level+fiber+reorganization+in+stretched+cell-compacted+collagen+gels.">Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).</li><li>Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+tissue+development+under+biaxial+stretch+using+nonlinear+optical+microscopy.">Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).</li><li>Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+engineered+tissue+anisotropy+in+response+to+altered+loading+conditions.">Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).</li><li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+as+a+cell+carrier+in+cardiovascular+tissue+engineering+applications.">Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications.</a> Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).</li><li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs.">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).</li><li>Schnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+cell+source+for+cardiovascular+tissue+engineering:+venous+vs.+aortic+human+myofibroblasts.">Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts.</a> Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).</li><li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+human+tissue-engineered+heart+valves:+prospects+for+systemic+application.">Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application.</a> Circulation. , I152-I158 (2006).</li><li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro.">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).</li><li>John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+stiffness+regulates+fibroblast+behavior+in+collagen+gels.">Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).</li><li>Rubbens, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+straining+accelerates+the+development+of+tissue+properties+in+engineered+heart+valve+tissue.">Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).</li><li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+and+quantitative+analysis+of+collagen+production+by+chondrogenic+human+mesenchymal+stem+cells+cultured+in+chitosan+scaffold.">Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).</li><li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs.">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).</li><li>Merryman, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+heart+valve+interstitial+cell+stiffness+and+transvalvular+pressure:+implications+for+collagen+synthesis.">Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis.</a> Am. J. Physiol. 290, (2006).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cellular+mechanotransduction+to+biologically+inspired+engineering:+2009+Pritzker+Award+Lecture,+BMES+Annual+Meeting+October+10,+2009.">From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).</li><li>Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension.">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).</li><li>van der Schaft, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Skeletal+Muscle+Tissues+from+Murine+Myoblast+Progenitor+Cells+and+Application+of+Electrical+Stimulation.">Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das beschriebene Modell System der Zelle besiedelten Fibrin-Konstrukte hat ein großes Potenzial für die Untersuchung von Zell-und Kollagen (Re-) Organisation (de Jonge et al. 15), z. B. für das Tissue Engineering verwendet werden. Durch die Verwendung von Fibrin als anfängliche Zellträgers nach Fibrinabbauprodukten wird ein Gewebe mit Zellen und endogenen Matrix nur erstellt. Auf diese Weise werden die Zellen stimuliert, um auf Stress reagieren, entweder statisch oder zyklischer Natur, indem Kontraktionskräfte 16,17, Erfassen Grenze Steifigkeit 12, oder die Anzeige Stamm Vermeidung. Bedeutung: Fibrin-Konstrukte verwendet wurden, bevor Kollagen (Re-) Organisation 18 studieren, aber nicht mit der Fähigkeit der Anwendung zyklischer Belastung und / oder Studium der Konstrukte in einem Zeitraffer-Weise, die beide möglich sind in diesem Verfahren vorgestellt. Die Klettverschlüsse, die die Einschränkungen bieten in diesem Modell-System haben vor 19 verwendet wurde,aber die Kombination dieses Verfahrens mit Kulturplatten mit flexiblen Membranen ermöglicht zyklische Belastung über längere Zeit anwenden. Kultivierung in diesen Platten ermöglicht einfache Hinzufügen und Entfernen von mittleren und Visualisierung der Konstrukte während noch anhaftendem und steril. Dies ermöglicht das Studium relevant Umbauprozesse zeitversetzt oder sogar in Echtzeit. Änderungen und zukünftige Anwendungen: Zukünftige Anwendungen des Systems können in die Manipulation der 3D-Remodeling-Prozess, zum Beispiel durch Zugabe von Metalloproteinasen oder Agenten, die mit der Montage oder Integrin Signalisierung stören gefunden werden. Neben der Anwendung von Zusatzstoffen lassen sich die Komponenten des Modells System leicht modifiziert werden, wenn das Studium Zelle und Kollagen (Re) Organisation. Verschiedene Zellquellen, gesunden und kranken Zellen, die Laufzeit der Kollagen-Matrix (zB durch Variation Kulturzeit) und die Form und Größe des Konstrukts an spezifische Bedürfnisse angepasst werden. Das System ist auch sUited für andere Quellen Zelle anstelle der gegenwärtig verwendeten HVSCs. Wir haben bereits dieses System zu Kultur endothelialen koloniebildenden Zellen verwendet (ECFCs; PlosOne, zur Veröffentlichung angenommen), wo wir feststellen, dass ECFCs orientieren ihre Kollagen produziert anders auf zyklische Belastung als HVSCs. Einschränkungen der Technik: Eine Begrenzung des aktuellen Modells ist die relativ große Größe der Gewebe erfordern 1,5 x 10 6 Zellen pro Konstrukt bei Verwendung einer Zelldichte von 15 x 10 6 Zellen / ml. Dies kann ein Problem darstellen, in Fällen, in denen weniger verfügbar Zelle Quellen verwendet werden. Eine weitere Einschränkung ist die aktuelle Dicke der Konstrukte (ca. 1 mm), die aufgrund der (dick) Klettverschlüsse ist. Dies begrenzt die konfokalen auf nur einen Teil der gesamten Probe. Es ist möglich, eine Tiefe von max 200 um in das Gewebe, die genug, um zelluläre Reaktionen im Kern der aktuellen Gewebe zu visualisieren ist zu erreichen, aber tunes nicht in einem vollen Dicke Übersicht führen. Kritische Schritte und Fehlerbehebung: Da das Modell, das auf der Bildung von Gewebe zwischen den Klettverschluss Punkte basiert, dies umfasst auch die kritischen Schritte im Protokoll. Richtiges Schneiden und Kleben ist unerlässlich und sollte besonderes Augenmerk auf die sorgfältige Pipettieren des Gels Mischung in den Klettbändern zur ordnungsgemäßen Befestigung des Gewebes, die von entscheidender Bedeutung für die Anwendung zyklischer Belastung ist zu zahlen. Ferner bestimmende Schritte können bei der Auswahl der Zelle Quelle und Medium Zusatzstoffe finden. Die Optimierung wird benötigt, wenn Kultivierung mit einer anderen Zelle Quelle werden. Derzeit sind Konstrukte mit ACA für 7 Tage kultiviert, um das Fibrin aus erniedrigender stoppen. Eine andere Zell-Quelle kann auch in einem anderen Zeitrahmen sowohl im Hinblick auf die Bildung von Kollagen und Fibrin-führen.

Herz-Kreislauf-Gewebe haben einen prominenten tragende Funktion. Insbesondere werden Inhalte und Organisation der Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix zu den tragenden Eigenschaften beitragen und dominieren insgesamt Gewebefestigkeit 1. In Tissue Engineering mechanische Konditionierung des Konstrukts verwendet wird - in der Regel bestehend aus (zyklisch) belasten Regimen - um Gewebe Organisation und mechanischen Eigenschaften 2,3 verbessern. Volles Verständnis von Stamm-induzierte Kollagen Organisation in komplexen Geometrien Gewebe zu Gewebe mit vordefinierten Kollagen Architektur zu schaffen, hat noch nicht erreicht worden. Dies ist vor allem aufgrund unseres begrenzten Wissens von Kollagen Umbau in entwickelnde Gewebe. Bestehende Modelle vor allem Aufschluss über die endgültige Nettoergebnis von Kollagen Umbau mit der Nutzung der statischen Belastung 4-6. Hier bieten wir eine sehr abstimmbaren Modellsystem, das die Studie von Kollagen (Re-) Organisation ermöglicht in einer Echtzeit-Mode, in 3D, unter dem Einflussstatische oder zyklische Belastung. Die Gewebe Konstrukte sind Fibrin-basierte, sicherzustellen, dass alle Kollagen in dem Konstrukt endogenen ist. Zell-und Kollagen-Organisation in den Konstrukten wird visualisiert, und eine interne Referenz-System ermöglicht es uns, Zellen und Kollagen-Strukturen für Zeitraffer-Analyse zu verlagern. In diesem Protokoll werden wir beschreiben die Verwendung des Modells für humane Vena Saphena Cells (HVSCs), da diese Zellen für ihre erhöhte extrazelluläre Matrix-Produktion und die Fähigkeit, die Matrix und unseren etablierten Einsatz in engineered kardiovaskulärem Gewebe 7 renovieren, sind bekannt auf der Arbeit von de Jonge et al. 8

<table><tbody><tr><td>Culture plastic</td><td>Greiner</td><td></td><td>Includes culture flasks and pipettes</td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer and curing agent</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Velcro</td><td>Regular store</td><td></td><td>You can buy this at a regular store, only use the soft side</td></tr><tr><td>Bioflex culture plates</td><td>Flexcell Int</td><td>BF-3001U</td><td>Untreated</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid 2-phosphatase</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Amino Caproic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>0.45 syringe filter</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>Blue fluorescent, 10 &amp;mu;m diameter</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>Includes rectangular loading posts</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td><td>Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Needed for cell isolation</td></tr></tbody></table>

engineering fibrin-based tissue constructs from myofibroblasts and application of constraints and strain to induce cell and collagen reorganization

Collagen Inhalt und Organisation bei der Entwicklung kollagenen Gewebe kann durch lokale Stämme Gewebe und Gewebe Einschränkung beeinflusst werden. Tissue-Ingenieure sind bestrebt, diese Prinzipien zu verwenden, um Gewebe mit vordefinierten Kollagen Architekturen erstellen. Ein vollständiges Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse genauen Umbau von Kollagen, um die endgültige Architektur Gewebe steuern, jedoch fehlen. Insbesondere ist über die (Re-) Ausrichtung der Kollagenfasern in Reaktion auf Veränderungen im Gewebe mechanischen Beanspruchungen bekannt. Wir entwickelten ein in vitro-Modell, bestehend aus biaxial eingeschränkten myofibroblast ausgesät Fibrin-Konstrukte, die weitere Aufklärung Kollagen (re) Orientierung in Reaktion auf i) Rückgriff auf zweiachsigen einachsigen statischen Lastbedingungen und ii) zyklische einachsige Belastung des biaxial eingeschränkt Konstrukte vor und nach einer Änderung der Belastungsrichtung, unter Verwendung des Flexcell FX4000T Ladevorrichtung. Zeitraffer-konfokale Bildgebung verwendet wird, um visualize Kollagen (re) Orientierung in einer zerstörungsfrei. Zell-und Kollagen-Organisation in den Konstrukten können in Echtzeit visualisiert und eine interne Referenz-System ermöglicht es uns, Zellen und Kollagen-Strukturen für Zeitraffer-Analyse zu verlagern. Verschiedene Aspekte des Modells kann eingestellt werden, wie Zellquelle oder Verwendung von gesunden und kranken Zellen. Additive können zur weiteren aufzuklären zugrunde liegenden Kollagen Umbau werden, zum Beispiel durch Zugabe von MMPs oder Sperrung Integrine. Form und Größe des Konstrukts kann leicht an spezifische Bedürfnisse angepasst werden, was zu einer sehr abstimmbaren Modellsystem zur Zelle und Kollagen (Re-) Organisation zu studieren.

Dieses Modell ermöglicht zum Kultivieren Myofibroblasten ausgesät Fibringele. 1A zeigt ein Gewebe zunächst unter statischen Bedingungen biaxial kultiviert. Tissue-Einschränkungen werden durch Schneiden der Fibringel aus zwei Einschränkungen freigegeben, um statische einachsige Zwänge schaffen und Gewebe verdichtet und danach umbaut (Abbildung 1A). Für zyklische Belastung wird das Gewebe unter statischen Bedingungen kultiviert biaxial sowie. Nach 5 Tagen cyclischen uniaxiale Verformung aufgebracht (Fig. 1B) werden. Kollagen Neuausrichtung induzieren kann uniaxiale Verformung Richtung auf die senkrechte Richtung (1B) geändert werden. Die Mikrosphären ausgesät mit dem Gel-Mischung, die Anzeige eines zufälligen Muster, die verwendet werden, um vordefinierte Standorte für Zeitraffer-Aufnahmen verlagern wird (Abbildung 2). 2A und 2C ein Bild von Zellen, Kollagen und Perlen zeigen. Die gleichen Bilder werden 3 Tage (Figur gescannte 2B) und 2 Tage (2D) später auf. Zellen und Kollagen Muster haben sich geändert, aber Kornmuster werden verwendet, um die Zellen und Kollagen zu verlagern. Kultivieren Proben für 12 Tage Ergebnisse der endogenen Produktion von Kollagen in ausreichenden Mengen visualisiert werden konfokale Mikroskopie (3 und 4). Verwendung entweder statisch oder cyclische Kultur ergibt deutlich unterschiedliche Kollagen Organisation, in biaxialen statischen Kultur führt zu einer zufälligen Kollagen Organisation (3A) und einachsigen zyklischen Belastung aufgebracht, um eine biaxial eingeschränkt Gewebe führt zu einer ausgerichteten Kollagen-Struktur (Fig. 4A und B) . Diese Kollagen Organisation kann im Laufe der Zeit untersucht werden, während Sie die statische Einschränkungen oder Änderung der zyklischen Belastung Richtung. Bei statischen Einschränkungen werden von zweiachsigen zu einachsigen, Kollagen Orientierung ändert sich von einer zufälligen Orientierung (3A geändert) Zu einer ausgerichteten Orientierung (Abbildung 3B). Zyklische Belastung induziert eine Änderung der Orientierung an der Oberfläche des Gewebes (Fig. 4A und C), aber nach 3 Tagen, keine Änderung in dem Kern des Gewebes beobachtet (Fig. 4B und D). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/51009/51009fig1.jpg" /> Abbildung 1. Konstrukte unter biaxialen Einschränkungen verwendet werden, um Kollagen durch (A) Lösen statischen Bedingungen in einer Richtung neu kultiviert, oder durch (B) ändernden zyklischen Belastung Richtung. Loading Beiträge gestrichelte schwarze Linien angedeutet. Maßstab Balken zeigen 3 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/51009/51009fig2.jpg" /> Abbildung 2. Typische Beispiel für die Verwendung von Perlen Muster vorgegebenen Stellen in 3D zu verlagern, in diesem Fall in statischkultivierten Proben. Zellen werden in rot, grün und Kollagen in Perlen in blau dargestellt. A und C zeigen ein Bild von Zellen, Kollagen und Perlen. Diese Bilder werden 3 Tage (B) und 2 Tage (D) später gescannt sind. Bead Muster werden verwendet, um Zellen und Kollagen zu verlagern. Maßstab Balken zeigt 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/51009/51009fig3.jpg" /> Abbildung 3. R epräsentativer Bilder der 12 Tage statische Belastung mit zweiachsigen Zwänge (A) und Neuausrichtung durch einachsige Einschränkungen innerhalb von 7 Tagen (B). Maßstab Balken zeigt 50 um. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/51009/51009fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Bilder nach 12 Tagen (5 Tage statisch, gefolgt von 7 Tagen zyklischen Belastung gefolgt) für die zyklische Belastung an der Oberfläche (A) Und ~ 60 um in das Gewebe (B). Nach der Änderung des zyklischen Belastung Richtung (nach 12 Tagen), an der Oberfläche Zellen und Kollagen umorientieren (C) aber keine Änderungen in den Kern des Gewebes (T) gesehen nach dem 3 Nächte.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization at JoVE.co

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden.

Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

engineering-fibrin-based-tissue-constructs-from-myofibroblasts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Aufrufe.  Eindhoven University of Technology.  Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden. 

Serie: Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Forschung

Biotechnik

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Biologie

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Ingenieurwesen

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Finite-Elemente-Modellierung einer zellulären elektrischen Mikroumgebung

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...